Artigo de método

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

DOI:

10.3791/61799

⸱

13 de outubro de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O peptidoglicano é um importante componente da parede celular bacteriana e um alvo celular comum para antimicrobianos. Embora os aspectos da estrutura do peptidoglicano sejam bastante conservados em todas as bactérias, também há uma variação considerável entre Gram-positivos/negativos e entre espécies. Além disso, existem inúmeras variações, modificações ou adaptações conhecidas ao peptidoglicano que podem ocorrer dentro de uma espécie bacteriana em resposta à fase de crescimento e/ou estímulos ambientais. Essas variações produzem uma estrutura altamente dinâmica que é conhecida por participar de muitas funções celulares, incluindo crescimento/divisão, resistência a antibióticos e evitação de defesa do hospedeiro. Para entender a variação dentro do peptidoglicano, a estrutura geral deve ser quebrada em suas partes constitutivas (conhecidas como muropeptídeos) e avaliada para a composição celular geral. A peptidoglicômica usa espectrometria de massa avançada combinada com análise de dados bioinformáticos de alta potência para examinar a composição de peptidoglicanos em detalhes finos. O protocolo a seguir descreve a purificação de peptidoglicanos de culturas bacterianas, a aquisição de dados de intensidade de muropeptídeos através de um cromatógrafo líquido – espectrômetro de massas e a análise diferencial da composição de peptidoglicanos usando bioinformática.

Introdução

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O peptidoglicano (PG) é uma característica definidora de bactérias que serve para manter a morfologia celular, ao mesmo tempo em que fornece suporte estrutural para proteínas e outros componentes celulares 1,2. A espinha dorsal do PG é composta pelo ácido N-acetil murâmico ligado ao β-1,4 (MurNAc) e N-acetilglucosamina (GlcNAc)1,2. Cada MurNAc possui um peptídeo curto ligado ao resíduo ᴅ-lactílico que pode ser reticulado com peptídeos adjacentes ligados ao dissacarídeo (Figura 1A,B). Essa reticulação produz uma estrutura semelhante a uma malha que abrange toda a célula e é frequentemente referida como um sáculo (Figura 1C). Durante a síntese de PG, precursores são gerados no citoplasma e transportados através da membrana citoplasmática por flippases. Os precursores são posteriormente incorporados à PG madura pelas enzimas transglicosilase e transpeptidase, que produzem as ligações glicosídica e peptídica, respectivamente3. No entanto, uma vez montadas, existem inúmeras enzimas produzidas pelas bactérias que modificam e/ou degradam o PG para realizar uma série de processos celulares, incluindo crescimento e divisão. Além disso, várias modificações do PG têm demonstrado conferir adaptações específicas à linhagem, condições de crescimento e estresse ambiental, que têm sido implicadas na sinalização celular, resistência antimicrobiana e evasão imune do hospedeiro4. Como exemplos, uma modificação comum é a adição de um grupo acetila C6 no MurNAc que confere resistência limitando o acesso às ligações glicânicas β-1,4 às enzimas lisozimas produzidas pelo hospedeiro que degradam PG 4,5,6. Em Enterococos, a substituição do ᴅ-Ala terminal da cadeia lateral do peptídeo por ᴅ-Lac confere maior resistência ao antimicrobiano, a vancomicina 7,8.

O procedimento geral de isolamento e purificação do PG permaneceu relativamente inalterado desde que foi descritona década de 19609. As membranas bacterianas são dissolvidas através de tratamento térmico com SDS, seguido de remoção enzimática de proteínas ligadas, glicolipídios e DNA remanescente. O sáculo intacto purificado pode ser posteriormente digerido nos componentes individuais por hidrólise da ligação β-1,4 entre GlcNAc e MurNAc. Essa digestão produz dissacarídeos GlcNAc-MurNAc com quaisquer modificações estruturais e/ou ligações cruzadas intactas e são chamados de muropeptídeos (Figura 1B).

A análise composicional do PG foi inicialmente realizada por separação por cromatografia líquida de alta pressão (CLAE) para purificação de cada muropeptídeo, seguida da identificação manual dos muropeptídeos10,11. Desde então, isso foi substituído pela cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS), que aumenta a sensibilidade de detecção e diminui a carga de trabalho manual de purificação de cada muropeptídeo individual. Entretanto, a demora e complexidade da identificação manual de muropeptídeos tem permanecido um fator limitante, reduzindo o número de estudos realizados. Nos últimos anos, com o surgimento de tecnologias "ômicas", a extração automatizada de recursos LC-MS tornou-se uma ferramenta poderosa, permitindo a rápida detecção e identificação de compostos individuais em amostras complexas de conjuntos de dados muito grandes. Uma vez identificadas as características, um software de bioinformática compara estatisticamente a variação entre as amostras por meio da análise diferencial, isolando diferenças mínimas entre o complexo conjunto de dados e exibindo-as graficamente ao usuário. A aplicação de softwares de extração de características para análise da composição de PG apenas começou a ser explorada 12,13,14 e acoplada à análise bioinformática 12. Ao contrário da análise proteômica, que se beneficia dos bancos de dados de proteínas prontamente disponíveis que predizem a fragmentação peptídica, permitindo a identificação totalmente automatizada, nenhuma biblioteca de fragmentação existe atualmente para peptidoglicômica. No entanto, a extração de características pode ser acoplada a bancos de dados estruturais conhecidos e previstos para prever a identificação de muropeptídeos12. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o uso da extração de características baseada em LC-MS combinada com uma biblioteca de muropeptídeos para identificação automatizada e análise diferencial bioinformática da composição PG (Figura 2).

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Protocolo

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1. Preparação da amostra de peptidoglicano

  1. Crescimento de culturas bacterianas
    NOTA: O crescimento das culturas bacterianas irá variar dependendo da espécie bacteriana e das condições de crescimento que estão sendo examinadas. Os parâmetros experimentais a serem testados definirão as condições de crescimento.
    1. Cultivar culturas bacterianas sob condições de crescimento requeridas para a linhagem bacteriana e planejamento experimental. Cultivar bactérias como culturas triplicadas (réplicas biológicas), ou seja, três colônias separadas por cepa ou condição de crescimento.
      NOTA: Sabe-se que as condições de crescimento e a fase de crescimento têm efeitos significativos sobre a composição do PG 1,2,10. Muito cuidado deve ser tomado para manter a consistência entre culturas e réplicas para garantir que as mudanças composicionais sejam devidas aos parâmetros experimentais e não a erros experimentais.
    2. Resfriar rapidamente a cultura a 4 °C, coletar por centrifugação (11.000 x g, 10 min, 4 °C) e congelar o pellet de células a -20 °C. Lavar o pellet de células com fosfato de sódio pré-resfriado a 4 °C, 20 mM pH 6,5 antes do congelamento. A produção do pellet de células congeladas deve ser feita o mais rápido e consistentemente possível entre as amostras para limitar a atividade de enzimas que possam modificar e/ou degradar o PG durante o processo de coleta. As amostras podem ser processadas directamente através do processo de extracção (ponto 1.2) sem congelamento; no entanto, certifique-se de que todas as amostras sejam processadas de maneira semelhante.
      NOTA: Para garantir produto suficiente para etapas posteriores, um pellet de célula úmida de tamanho significativo é usado. Isto produz um pellet de sáculo suficientemente grande, que é facilmente visualizado e mantido durante as repetidas etapas de lavagem (pontos 1.2.5 e 1.2.14) sem perda significativa de produto. Dependendo da bactéria e das condições de crescimento, esse rendimento provavelmente variará. Para a bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 L de uma cultura de 0,5 OD600 produziram uma pastilha de células de 3–4 g e foi suficiente para produzir ~10 mg de sáculos purificados (seção 1.2.17)12. Trata-se de um grande excesso de sáculos do que o necessário para o LC-MS (seção 2); no entanto, ajudará na precisão da medição (secção 1.2.17) e na normalização (secção 1.3).
  2. Extração de peptidoglicanos sacculi
    NOTA: O protocolo para a extração de PG é adaptado da ref.9,11,15. Este protocolo irá extrair o PG de células bacterianas individuais como um sacculi inteiro, livre de outros componentes celulares. O protocolo pode ser usado com bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas. No entanto, para células Gram-positivas, ajustes podem ser necessários para isolar a estrutura PG mais espessa e remover polímeros associados à parede celular; tais como, ácidos teicóicos.
    1. Ressuspender os pellets de células congeladas a aproximadamente 1:10 do volume de cultura original de fosfato de sódio 20 mM pH 6,5. Executar esta etapa a 4 °C (pode ser de 1 a 8 mg de peso de pellet de célula úmida por mL de tampão11,12).
      OBS: Para manter o estado de acetilação do PG, é necessário um pH igual ou inferiora 6,5 15,16.
    2. Adicione a suspensão celular dropwise à fervura de dodecil sulfato de sódio (SDS) 8% 20 mM fosfato de sódio pH 6,5 para um volume final de 1:1 (ou seja, a concentração final é de 4% SDS), agitando suavemente em um balão de fundo redondo equipado com um condensador refrigerado a água. (Figura 2, passo 2)
    3. Mantenha uma fervura suave por 30 min a 3 h com agitação para garantir a dissociação completa da membrana. Certifique-se de que a mistura resultante esteja completamente límpida, sem aglomerados celulares ou viscosidade remanescentes. A ebulição mais longa é preferível para garantir a dissociação completa.
    4. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. A amostra pode ser deixada à temperatura ambiente durante a noite.
      NOTA: Quando o SDS estiver presente, mantenha as amostras à temperatura ambiente para manter o SDS na solução.
    5. Coletar sacculi como um pellet através de ultracentrifugação a 70.000 x g por 40 min (ou o tempo necessário para sedimentar completamente os sacculi) a 25 °C.
    6. Lavar repetidamente os sáculos por ultracentrifugação sucessiva (ponto 1.2.5) e suspensão em ~50 ml de fosfato de sódio 20 mM à temperatura ambiente pH 6,5 até que o tampão de lavagem tenha uma concentração de SDS ~0,001%. Normalmente, 5 a 7 lavagens são suficientes.
      NOTA: Para testar a concentração do SDS restante no tampão de lavagem, use o corante colorimétrico, Stains-all17.
    7. Ressuspender os sáculos em 5–10 mL de temperatura ambiente 20 mM fosfato de sódio pH 6,5.
    8. Sonicar a amostra brevemente (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) à temperatura ambiente para dispersar aglomerados.
      NOTA: A sonicação prolongada causará mecanicamente cisalhamento da estrutura PG18.
    9. Completar a amostra com 50 μg/mL cada amilase, DNase e RNase, sulfato de magnésio 10 mM, e digerir a 37 °C por 1 h com agitação ou nutação.
      NOTA: A digestão da amilase remove qualquer glicogênio remanescente aprisionado dentro dos sáculos11.
    10. Adicionar 100 μg/mL de pronase e digerir a 37 °C durante a noite com agitação ou nutação e ~0,02% de azida sódica.
      NOTA: A digestão Pronase remove as enzimas adicionadas (da secção 1.2.9) e remove as lipoproteínas que estão ligadas covalentemente ao PG.
      CUIDADO: A azida sódica é altamente tóxica e requer métodos adequados de uso/descarte.
    11. Ultracentrifugação a 70.000 x g por 40 min (ou o tempo necessário para sedimentar completamente os sacculi) a 25 °C para remover azida de sódio.
    12. Ressuspender o pellet em 25 mL de SDS 2% 20 mM fosfato de sódio pH 6,5.
    13. Ferver durante 1 h num vapor ou no balão de fundo redondo com condensador refrigerado a água (ponto 1.2.2).
      NOTA: A segunda etapa de ebulição do SDS remove todas as proteínas e contaminantes restantes dos sacculi.
    14. Repetir a lavagem dos sáculos (ponto 1.2.6) com ~50 ml de água bidestilada à temperatura ambiente (ddH2O) até que a concentração de SDS seja de ~0,001%.
    15. Ressuspenda o pellet em uma quantidade suficiente de ddH2O para suspender os sacculi, bem como lave o recipiente (por exemplo, 25 mL) e congele durante a noite a -80 °C. O volume pode variar à medida que a amostra será liofilizada na próxima etapa, porém, volumes menores demandam menos tempo para liofilizar.
    16. No dia seguinte, liofilize a suspensão e guarde em temperatura ambiente.
    17. Medir a quantidade de sáculos liofilizados obtidos em balança analítica.
    18. Diluir os sáculos em ddH2O a 10 mg/mL e sonicar brevemente para quebrar os aglomerados antes de uma análise mais aprofundada.
  3. Quantificação de peptidoglicano purificado
    1. Quantificar a quantidade de sáculos purificados a partir do ponto 1.2.18 para garantir que os dados de especificação de massa são equalizados durante a análise diferencial (ponto 3.2). Siga a metodologia detalhada descrita na Referência15.
      NOTA: Os sáculos purificados (ponto 1.2.18) são decompostos em componentes individuais de açúcar e aminoácidos por hidrólise ácida. Os componentes individuais são separados e quantificados por cromatografia de troca iônica usando detecção amperométrica pulsada. Dada a estrutura do PG (Figura 1), os muropeptídeos individuais são compostos por um único MurNAc e um único resíduo de GlcNAc. Portanto, quantificar a concentração de cada resíduo representa a quantidade de muropeptídeos 1:1 dentro da amostra. O MurNAc é preferido devido à separação limpa do pico de outros componentes do PG durante a cromatografia16.

2. Aquisição de dados por espectrometria de massas

  1. Preparação de muropeptídeos para espectrometria de massas
    1. Suplementar 800 μg de sacculi purificado com 100 μg/mL de mutanolisina, 100 mM de acetato de amônio pH 5,5 e 50 mM de cloreto de magnésio em uma reação de 100 μL.
    2. Digerir a 37 °C durante a noite.
    3. Adicionar 1:1 volume 0,5 M tampão borato pH 9,0 e complementar com ~10 mg/mL de borohidreto de sódio (NaBH4).
      NOTA: A mutarotação de açúcares cíclicos entre α e β formas anoméricas causará múltiplas formações de picos durante a separação por cromatografia líquida dos muropeptídeos. O tratamento com NaBH4 elimina a interconversão entre as duas formas, reduzindo o MurNAc em muramitol11. O tratamento não reduz os resíduos de açúcar 1,6-anidro ou 1,4-ligado.
      CUIDADO: A reação do NaBH4 produz pequenas quantidades de gás hidrogênio. A reação de NaBH4 criará bolhas e os tubos de microfuga devem ser mantidos abertos para permitir que o gás escape.
    4. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante ~20–30 min.
    5. Centrifugar brevemente para fixar a amostra no tubo de microfuga e remover bolhas.
    6. Ajustar o pH para <4,0 usando ácido fosfórico 1:5, adicionado em incrementos de 5 μL. Teste o pH usando tiras de teste de pH litmus.
    7. Centrifugar a ~17.000 x g por 1 min para sedimentar qualquer material insolúvel restante.
    8. Filtrar utilizando filtros de microcentrífuga de 0,2 μm.
    9. As amostras são centrifugadas por 10 min a 30.000 x g antes da injeção em LC-MS para garantir que quaisquer partículas não sejam injetadas em MS.
  2. Configuração do LC-MS
    1. Anexe uma coluna de partículas superficialmente porosas C18 (100 mm x 2,1 mm, tamanho de poro <3 μm) a um espectrômetro de massa Quadrupolo-Time of Flight (QTOF) com uma precisão mínima de detecção de quatro pontos decimais m/z .
    2. Realizar separação por cromatografia líquida de muropeptídeos
      NOTA: Cada triplicata biológica (secção 1.1.1) deve ser executada através do LC-MS (secções 2.2.2 a 2.2.3) três vezes (triplicata técnica). Portanto, cada condição testada terá um total de nove arquivos de dados LC-MS. A aquisição de dados foi realizada por meio de software disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). No entanto, o software de aquisição deve ser escolhido com base no maquinário MS. O seguinte representa um guia para configurar o MS com parâmetros específicos para executar este protocolo. Para obter uma descrição detalhada, consulte o manual do fabricante.
      1. Para a separação cromatográfica, preparar os seguintes solventes ácido fórmico a 0,1% (A) e acetonitrila com ácido fórmico a 0,1% (B).
      2. Configure um método de separação cromatográfica usando os seguintes parâmetros.
      3. Ajuste o fluxo para 0,4 mL/min.
      4. Condicione a coluna por 10 min a 2% B (~24 volumes de coluna).
      5. Com um amostrador automático, injectar 10 μL de amostra a partir do ponto 2.1.9.
        Observação : execute uma amostra inicial através do protocolo LC-MS antes de iniciar a coleta de dados. Essa execução não é usada para dados, mas para aumentar a reprodutibilidade do tempo de retenção para todas as execuções subsequentes. A reprodutibilidade do tempo de retenção é necessária durante o processamento espectral (secção 3.1) para a identificação e agrupamento precisos dos picos da relação massa/carga (m/z).
      6. Separe os muropeptídeos usando 2% B por 5 min (~12 volumes de coluna), depois aumentando-o para 15% B em 13 min (~30 volumes de coluna), aumentando-o ainda mais para 50% B em 10 min (~24 volumes de coluna) e, finalmente, aumentando-o para 98% B em 2 min (~5 volumes de coluna).
        OBS: Descarte (envie para o lixo) os primeiros 2 min e os últimos 5 min do gradiente.
      7. Termine com uma lavagem de coluna a 98% B por 6 min (~14 volumes de coluna) e 20 min (~47 volumes de coluna) de reequilíbrio.
    3. Realizar detecção por espectrometria de massa de muropeptídeos
      1. Calibrar o eixo de massa em modo positivo usando uma mistura de afinação em acetonitrila contendo padrões de massa de referência LC-MS seguindo as instruções do fabricante do MS.
        NOTA: O MS é ajustado antes do início das execuções cromatográficas (ponto 2.2.2.1).
      2. Configure um método para aquisição de dados MS usando os seguintes parâmetros.
        NOTA: Os dados de EM e EM/EM são recolhidos (secções 2.2.3.2 a 2.2.3.6) em simultâneo com a separação cromatográfica dos muropeptídeos (secções 2.2.2.4 e 2.2.2.5). Ambos os parâmetros cromatográficos e MS (seções 2.2.2.2 e 2.2.3.2) são um único método que é adicionado durante a configuração de uma lista de trabalho para executar várias amostras em sequência.
      3. Ajuste a tensão capilar do electrospray em 4,0 kV e a temperatura do gás de secagem em 350° C com uma vazão de 13 L/min.
        NOTA: O nitrogênio (pureza >99%) deve ser usado como nebulização, secagem e gás de colisão durante toda a coleta de dados de espectrometria de massa.
      4. Ajuste a pressão do nebulizador para 40 psi e ajuste o fragmentador para 150 V.
      5. Ajuste as tensões de RF do bico, skimmer e octapolo para 1000 V, 65 V e 750 V, respectivamente.
      6. Defina o intervalo de varredura para 300–2.000 m/z no modo de íons positivos de 4 GHz (faixa dinâmica estendida).
      7. Defina a coleta de dados usando aquisição de MS/MS dependente de dados com uma taxa de varredura de MS e MS/MS de 1 espectro/segundo. Selecione cinco massas precursoras por ciclo, na ordem de carga única, dupla e tripla.
      8. Defina as energias de colisão de fragmentação MS/MS para 15, 20 e 30 eV.

3. Análise diferencial da abundância de muropeptídeos

  1. Processamento espectral do cromatograma LC-MS
    NOTA: A extração de recursos recursivos foi realizada usando software disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Outros softwares de extração de recursos podem ser usados. No entanto, outros softwares podem exigir processamento manual de dados adicional para realizar a extração recursiva altamente robusta. Vários softwares usam o recurso de terminologia, entidade e composto quase que alternadamente. Para a análise de PG, todos se referem à identificação do cromatograma de íons LC-MS representativo de um muropeptídeo individual (por exemplo, Figura 3). Durante o processamento espectral (seção 3.1), uma característica representa os múltiplos picos m/z que englobam as múltiplas espécies possíveis de íons de um único muropeptídeo que são agrupadas sob um único rótulo composto.
    1. Em Arquivo, inicie um novo projeto.
    2. Adicione os arquivos de dados LC-MS QTOF e atribua arquivos de dados individuais a uma condição / grupo experimental, por exemplo, duas condições de crescimento diferentes.
    3. Execute o assistente de processamento de dados Extração de recursos recursivos em lote (pequenas moléculas/peptídeos) e defina os filtros de processamento de dados para corresponder aos parâmetros das condições LC-MS e instrumentação para identificar, agrupar e verificar com precisão picos m/z que representam muropeptídeos individuais. A partir do cromatograma, examine a deriva do tempo de retenção e a variação de m/z de picos similares conhecidos para definir os parâmetros iniciais do filtro.
      NOTA: A extração de recursos recursivos usa um algoritmo inicial de extração de feição molecular não direcionado para identificar e alinhar recursos de cromatograma (picos m/z ) em todos os arquivos de dados. Uma vez criados, esses recursos são usados para reavaliar os arquivos de dados originais (recursivos) com um algoritmo de extração de características moleculares direcionado para melhorar a confiabilidade e a precisão dos recursos identificados. É melhor definir a extração inicial não direcionada com uma janela de detecção estreita e usar parâmetros de detecção mais amplos para a extração recursiva para identificar picos em todos os arquivos de dados que podem estar faltando na extração inicial. A execução da extração de recurso recursivo pode levar horas para ser concluída, dependendo do número de amostras, da complexidade dos dados e do hardware do computador presente
    4. Revise os resultados da extração de recursos. Se um número significativo de recursos não conseguir se alinhar em um grupo, ajuste os parâmetros de filtragem recursiva para ampliar/restringir a janela de detecção, conforme necessário. Para fazer isso, inspecione o cromatograma e o perfil isotópico de cada recurso extraído para garantir que a detecção de recursos foi realizada de forma semelhante em todos os arquivos de dados. Além disso, para cada recurso identificado em um arquivo de dados, examine a pontuação, quaisquer avisos e se o recurso passou nos parâmetros de filtro escolhidos.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado para manter as janelas de detecção estreitas o suficiente para que recursos distintos não sejam agrupados por engano. Isso geralmente é observado por perfis isotópicos díspares entre arquivos de dados, ou variações significativas de m/z / tempo de retenção. Por outro lado, se houver vários recursos com tempos de retenção e m/z semelhantes, é possível que os parâmetros de filtro tenham sido muito rigorosos, resultando em um pico de MS sendo dividido em dois recursos. Portanto, execute a extração de recursos (seção 3.1.3) novamente com parâmetros de filtro de tempo de retenção ajustados para permitir um melhor agrupamento desses recursos. A visualização dos picos de abundância mais baixos indicará se os filtros utilizados (secção 3.1.3) identificaram com precisão os picos acima do ruído de fundo. Se os picos de abundância mais baixos parecerem semelhantes ao plano de fundo, execute novamente a extração de recurso com novos parâmetros de filtro de plano de fundo.
    5. Exporte dados como um arquivo de troca composto (.cef) (um formato compatível com o programa de software estatístico) ou um arquivo separado por coluna (.csv) que contém a massa, o tempo de retenção e a abundância de cada recurso para cada amostra.
  2. Análise diferencial de características espectrais
    NOTA: A análise diferencial foi realizada utilizando software disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). Outros softwares de bioinformática podem ser utilizados.
    1. Abra o programa e, quando instruído, inicie um novo projeto.
    2. Siga as instruções para importação e análise de dados. Durante a importação de dados, carregue os arquivos extraídos do recurso (seção 3.1). Durante a análise de dados, escolha a significância e a alteração de dobra para análise diferencial e selecione os dados de linha de base para a intensidade média em todos os arquivos de dados. Não defina nenhum filtro de dados (se isso foi feito na etapa anterior de processamento de espectros (seção 3.1)), pois a aplicação de filtros novamente anularia a extração robusta de recursos recursivos. No entanto, semelhante à extração de características, a análise diferencial deve ser alinhada com base na massa (m/z) e no tempo de retenção devido à deriva na coleta de dados LC-MS. Use os parâmetros determinados na extração de recursos (seção 3.1).
      NOTA: Normalizar entre ficheiros de dados utilizando a quantificação de muropeptídeo (secção 1.3) para garantir que as variações são devidas a parâmetros experimentais e não devidas a variações na purificação de sáculos (secção 1.2). Use a opção de dimensionador externo para ajustar cada arquivo de dados para diferenças na concentração de MurNAc da amostra.
    3. Uma vez concluída a análise, examine as análises gráficas e estatísticas resultantes para identificar muropeptídeos que demonstram uma mudança significativa de abundância entre as condições experimentais testadas.
    4. No navegador do projeto, clique com o botão direito do mouse nas várias análises e escolha uma opção de exportação para salvar os detalhes do recurso como um arquivo de dados separado por coluna (.csv) que contém o m/z, tempo de retenção, valores de intensidade bruta e normalizada, valor p, FDR e alterações de dobra para cada recurso. Múltiplas análises devem ser salvas para obter todos os dados relevantes.
    5. Exportar um segundo arquivo .csv contendo apenas os muropeptídeos que ultrapassaram as análises estatísticas, incluindo p-valor <0,05 e fold change >2.
  3. Anotação da identidade de muropeptídeos em características espectrais
    NOTA: A cada característica identificada deve ser atribuída uma estrutura de muropeptídeo prevista com base no m/z e esta anotação confirmada examinando a fragmentação MS/MS. Após a confirmação das anotações, pode ser necessário realizar e refinar a análise diferencial (ponto 3.2).
    1. Dentro do software de análise diferencial, em interpretação de resultados, selecione ID browser. Adicionar uma biblioteca de estruturas de muropeptídeos esperadas e selecionar parâmetros semelhantes aos usados anteriormente (seção 3.1.3). Isso produzirá uma anotação de muropeptídeo prevista para cada característica identificada. Uma biblioteca de estruturas de muropeptídeos pode ser produzida usando o m/z para estruturas de muropeptídeos previstas e software de banco de dados MS (ver Tabela de Materiais). No entanto, uma biblioteca de m/z de >6.000 possíveis muropeptídeos pode ser encontrada na Referência12.
    2. Selecione a anotação de muropeptídeo prevista com base no escore de pareamento e na relevância biológica do muropeptídeo predito, ou seja, escolha o muropeptídeo mais provável de estar presente na amostra biológica.
    3. Confirme manualmente a anotação de muropeptídeo predita comparando os picos m/z do cromatograma MS/MS com o m/z previsto de todas as possíveis fragmentações de uma estrutura de muropeptídeo conhecida (por exemplo, Figura 4).
      1. Visualize os dados de MS e MS/MS usando um programa de visualização de cromatogramas (consulte Tabela de Materiais, Figura 4).
      2. Desenhe a estrutura de muropeptídeo prevista usando um editor molecular (programa de desenho de estrutura química) (ver Tabela de Materiais, Figura 4, inserção cinza). Use a ferramenta de fragmentação de massa para mostrar o m/z de fragmentos de MS quando cada ligação é quebrada individualmente ou em combinação.
        NOTA: Dependendo da energia de fragmentação usada para MS/MS, a fragmentação pode acontecer em qualquer ligação na estrutura do muropeptídeo. No entanto, algumas ligações são mais facilmente / frequentemente fragmentadas em níveis de energia mais baixos. Por exemplo, a fragmentação na cadeia lateral do peptídeo ocorre mais frequentemente na ligação amida entre aminoácidos. Ao avaliar a fragmentação, é importante notar que os resíduos de GlcNAc são facilmente fragmentados do muropeptídeo. Portanto, a fragmentação da estrutura conhecida do muropeptídeo deve ser avaliada com e sem GlcNAc. Devido à fragmentação na fonte do GlcNAc, várias características extraídas no processamento espectral (seção 3.1) podem representar uma única estrutura de muropeptídeo. Se encontradas, essas características devem ser mescladas e a análise diferencial reavaliada.
      3. Comparar todas as possíveis fragmentações da estrutura do muropeptídeo determinada (secção 3.3.3.2) com o cromatograma MS/MS (secção 3.3.3.1). Para confirmar a anotação do muropeptídeo, os picos m/z de múltiplos fragmentos devem ser encontrados no cromatograma MS/MS com uma janela de alinhamento m/z mínima (Figura 4).
      4. A fim de elucidar a identidade do muropeptídeo no caso de fragmentação ambígua de EM/EM, repita as seções 2.2.2 a 2.2.3 com amostras (seção 2.1.9) para aquisição adicional de dados de MS/MS incorporando uma lista de precursores preferenciais de m/z e tempo de retenção com energias adicionais de colisão de fragmentação de MS/MS.
    4. Para entidades co-eluidoras que foram anotadas como o mesmo muropeptídeo, execute a análise diferencial (seção 3.2.2) novamente e mescle as características extraídas.
  4. Avaliação das mudanças globais nas modificações de muropeptídeos
    1. Edite o arquivo .csv (seção 3.2.4) dos muropeptídeos de alta alteração de dobra estatisticamente significativos para incluir uma única coluna para cada modificação de muropeptídeo. Preencher esta coluna com uma designação para cada muropeptídeo anotado (secção 3.3) (por exemplo, GlcNAc ou MurNAc acetilado versus des-N-acetilado).
    2. Carregue o arquivo .csv modificado no Perseus22,23. Importe os valores de intensidade normalizados para a caixa Importação principal e importe a designação de modificação para a caixa Importação categórica.
    3. Em Anotar linhas, clique em Anotar linhas categoricamente e adicione arquivos de dados a cada parâmetro experimental.
    4. Em teste, clique em dois testes amostrais para realizar o teste t de um aluno (p-valor < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Clique em 1D para realizar a anotação 1D22,23. Uma anotação 1D FDR < 0,05 indica uma mudança significativa na abundância para a modificação do muropeptídeo entre os parâmetros experimentais testados. A definição do valor limite (s0) = 1 exibirá os escores FDR de anotação 1D para todos os muropeptídeos.
    6. Dentro de um software gráfico (ver Tabela de Materiais), produza um mapa de calor da mudança de dobra de abundância para cada modificação de muropeptídeo e mostre o escore de anotação 1D para demonstrar significância (Figura 5B). A mudança de dobra de cada modificação de muropeptídeo pode ser produzida no Microsoft Excel usando as intensidades brutas de todos os muropeptídeos individuais que contêm a modificação.

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Resultados

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O aumento da sensibilidade de detecção das máquinas MS, juntamente com o software de reconhecimento de pico de alta potência, melhorou a capacidade de isolar, monitorar e analisar composições de substâncias de amostras complexas em detalhes minuciosos. Utilizando esses avanços tecnológicos, estudos recentes sobre a composição de peptidoglicanos começaram a utilizar técnicas automatizadas de extração de características LC-MS 12,13,14,24 em detrimento de metodologias mais antigas baseadas em HPLC

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Discussão

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Este protocolo descreve um método para purificar peptidoglicanos de culturas bacterianas, processo para detecção de LC-MS e analisar a composição usando técnicas de bioinformática. Aqui, nos concentramos em bactérias Gram-negativas e algumas pequenas modificações serão necessárias para permitir a análise de bactérias Gram-positivas.

A preparação de muropeptídeos tem permanecido praticamente a mesma desde que foi produzida pela primeira vezna década de 19609,11,15.<...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer à Dra. Jennifer Geddes-McAlister e ao Dr. Anthony Clarke por suas contribuições no refinamento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções de funcionamento da CIHR concedidas à C.M.K (PJT 156111) e por um NSERC Alexander Graham Bell CGS D atribuído à E.M.A. Figuras foram criadas em BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
de fase reversa C18 - Coluna de Peptídeos AdvanceBio (100 mm x 2,1 mm 2,7 µ m)AgilentLC-MS aquisição de dados
Controlador de manto de aquecimento, OptichemFisher50-401-788para 4% de fervura SDS
Manto de aquecimento, 1000mL HemisféricoFisherCG1000008para 4%
SDS ferver Incubadora, 37° Cpara purificação de sacculi e preparação de amostras MS
Condensador Leibig, 300MM 24/40,FisherCG121805para 4% de fervura SDS
LiofilizadorLabconcopara liofilização de sacculi
Agitador MagenticFisher90-691-18fervura SDS a 4%
Q-Tof modelo UHD 6530AglientLC-MS
filtros de microcentrífuga, Nanosep MF 0.2 µ mFisher50-197-9573limpeza da amostra antes da injeção de MS
Suporte de retortaFisher12-000-102para fervura SDS a 4%
Braçadeira de retortaFisherS02629para fervura SDS a 4%
frasco de fundo redondo - pirex de 1 litro Fisher07-250-084para fervura SDS a 4%
Sonicator modelo 120FisherFB120para purificação de sacculi
Sonicator - micro pontaFisherFB4422para purificação de sacculi
UltracentrifugeBeckmansacculi etapas de lavagem
Ultracentrifuge garrafas, Ti45FisherNC9691797sacculi etapas de lavagem
Abastecimento de águaCidadepara condensador
Software
ChemdrawCambridgesofteditor molecular para previsão de fragmentação de muropeptídeos
ExcelMicrosoftlistas de visualização de muropeptídeos anotados, abundância, padrões isotópicos, etc.
MassHunter AcquisitionAglientexecutando o instrumento QTOF
MassHunter Mass Profiler ProfessionalAglientbioinformática análise diferencial
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerAglientmuropeptide m/z MS database
MassHunter ProfinderAglientextração de recursos
recursivosMassHunter Análise qualitativaaglientede cromatogramas MS e MS/MS
PrismGraphpadSoftware gráfico
PerseusMax Plank Institute of Biochemistry1D annotation
Material
AcetonitrilaFisherA998-4
Acetato de amônioFisherA637
AmilaseSigma-AldrichA6380
Ácido bóricoFisherBP168-1
DNaseFisherEN0521
Ácido fórmicoSigma-Aldrich27001-500ML-R
LC-MS mistura de ajuste - HP0321AgilentG1969-85000
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM8266
Sulfato de magnésioSigma-AldrichM7506
Mutanolisina de Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Gás nitrogênio (>99% de pureza)PraxairNI 5.0UH-T
Ácido fosfóricoFisherA242
Pronase E de Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNaseFisherEN0531
Azida de sódioFisherS0489
Borohidreto de sódioSigma-Aldrich452890
Dodecil sulfato de sódio (SDS)FisherBP166
Hidróxido de sódioFisherS318
Sódio Fosfato (dibásico)FisherS373
Fosfato de sódio (monobásico)FisherS369
Corantes-todosSigma-AldrichE9379
coluna para espectrômetro de massa de aquisição de dados refrigerado a água Visualização

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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