Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

O peptidoglicano (PG) é uma característica definidora de bactérias que serve para manter a morfologia celular, ao mesmo tempo em que fornece suporte estrutural para proteínas e outros componentes celulares ^1,2. A espinha dorsal do PG é composta pelo ácido N-acetil murâmico ligado ao β-1,4 (MurNAc) e N-acetilglucosamina (GlcNAc)^1,2. Cada MurNAc possui um peptídeo curto ligado ao resíduo ᴅ-lactílico que pode ser reticulado com peptídeos adjacentes ligados ao dissacarídeo (Figura 1A,B). Essa reticulação produz uma estrutura semelhante a uma malha que abrange toda a célula e é frequentemente referida como um sáculo (Figura 1C). Durante a síntese de PG, precursores são gerados no citoplasma e transportados através da membrana citoplasmática por flippases. Os precursores são posteriormente incorporados à PG madura pelas enzimas transglicosilase e transpeptidase, que produzem as ligações glicosídica e peptídica, respectivamente³. No entanto, uma vez montadas, existem inúmeras enzimas produzidas pelas bactérias que modificam e/ou degradam o PG para realizar uma série de processos celulares, incluindo crescimento e divisão. Além disso, várias modificações do PG têm demonstrado conferir adaptações específicas à linhagem, condições de crescimento e estresse ambiental, que têm sido implicadas na sinalização celular, resistência antimicrobiana e evasão imune do hospedeiro⁴. Como exemplos, uma modificação comum é a adição de um grupo acetila C6 no MurNAc que confere resistência limitando o acesso às ligações glicânicas β-1,4 às enzimas lisozimas produzidas pelo hospedeiro que degradam PG ^4,5,6. Em Enterococos, a substituição do ᴅ-Ala terminal da cadeia lateral do peptídeo por ᴅ-Lac confere maior resistência ao antimicrobiano, a vancomicina ^7,8.

O procedimento geral de isolamento e purificação do PG permaneceu relativamente inalterado desde que foi descrito^{na década de} 19609. As membranas bacterianas são dissolvidas através de tratamento térmico com SDS, seguido de remoção enzimática de proteínas ligadas, glicolipídios e DNA remanescente. O sáculo intacto purificado pode ser posteriormente digerido nos componentes individuais por hidrólise da ligação β-1,4 entre GlcNAc e MurNAc. Essa digestão produz dissacarídeos GlcNAc-MurNAc com quaisquer modificações estruturais e/ou ligações cruzadas intactas e são chamados de muropeptídeos (Figura 1B).

A análise composicional do PG foi inicialmente realizada por separação por cromatografia líquida de alta pressão (CLAE) para purificação de cada muropeptídeo, seguida da identificação manual dos muropeptídeos^10,11. Desde então, isso foi substituído pela cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS), que aumenta a sensibilidade de detecção e diminui a carga de trabalho manual de purificação de cada muropeptídeo individual. Entretanto, a demora e complexidade da identificação manual de muropeptídeos tem permanecido um fator limitante, reduzindo o número de estudos realizados. Nos últimos anos, com o surgimento de tecnologias "ômicas", a extração automatizada de recursos LC-MS tornou-se uma ferramenta poderosa, permitindo a rápida detecção e identificação de compostos individuais em amostras complexas de conjuntos de dados muito grandes. Uma vez identificadas as características, um software de bioinformática compara estatisticamente a variação entre as amostras por meio da análise diferencial, isolando diferenças mínimas entre o complexo conjunto de dados e exibindo-as graficamente ao usuário. A aplicação de softwares de extração de características para análise da composição de PG apenas começou a ser explorada 12,13,14 e acoplada à análise bioinformática ¹². Ao contrário da análise proteômica, que se beneficia dos bancos de dados de proteínas prontamente disponíveis que predizem a fragmentação peptídica, permitindo a identificação totalmente automatizada, nenhuma biblioteca de fragmentação existe atualmente para peptidoglicômica. No entanto, a extração de características pode ser acoplada a bancos de dados estruturais conhecidos e previstos para prever a identificação de muropeptídeos¹². Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o uso da extração de características baseada em LC-MS combinada com uma biblioteca de muropeptídeos para identificação automatizada e análise diferencial bioinformática da composição PG (Figura 2).

1. Preparação da amostra de peptidoglicano

1. Crescimento de culturas bacterianas
   NOTA: O crescimento das culturas bacterianas irá variar dependendo da espécie bacteriana e das condições de crescimento que estão sendo examinadas. Os parâmetros experimentais a serem testados definirão as condições de crescimento.
   1. Cultivar culturas bacterianas sob condições de crescimento requeridas para a linhagem bacteriana e planejamento experimental. Cultivar bactérias como culturas triplicadas (réplicas biológicas), ou seja, três colônias separadas por cepa ou condição de crescimento.
      NOTA: Sabe-se que as condições de crescimento e a fase de crescimento têm efeitos significativos sobre a composição do PG ^1,2,10. Muito cuidado deve ser tomado para manter a consistência entre culturas e réplicas para garantir que as mudanças composicionais sejam devidas aos parâmetros experimentais e não a erros experimentais.
   2. Resfriar rapidamente a cultura a 4 °C, coletar por centrifugação (11.000 x g, 10 min, 4 °C) e congelar o pellet de células a -20 °C. Lavar o pellet de células com fosfato de sódio pré-resfriado a 4 °C, 20 mM pH 6,5 antes do congelamento. A produção do pellet de células congeladas deve ser feita o mais rápido e consistentemente possível entre as amostras para limitar a atividade de enzimas que possam modificar e/ou degradar o PG durante o processo de coleta. As amostras podem ser processadas directamente através do processo de extracção (ponto 1.2) sem congelamento; no entanto, certifique-se de que todas as amostras sejam processadas de maneira semelhante.
      NOTA: Para garantir produto suficiente para etapas posteriores, um pellet de célula úmida de tamanho significativo é usado. Isto produz um pellet de sáculo suficientemente grande, que é facilmente visualizado e mantido durante as repetidas etapas de lavagem (pontos 1.2.5 e 1.2.14) sem perda significativa de produto. Dependendo da bactéria e das condições de crescimento, esse rendimento provavelmente variará. Para a bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 L de uma cultura de 0,5 OD₆₀₀ produziram uma pastilha de células de 3–4 g e foi suficiente para produzir ~10 mg de sáculos purificados (seção 1.2.17)¹². Trata-se de um grande excesso de sáculos do que o necessário para o LC-MS (seção 2); no entanto, ajudará na precisão da medição (secção 1.2.17) e na normalização (secção 1.3).
2. Extração de peptidoglicanos sacculi
   NOTA: O protocolo para a extração de PG é adaptado da ref.^9,11,15. Este protocolo irá extrair o PG de células bacterianas individuais como um sacculi inteiro, livre de outros componentes celulares. O protocolo pode ser usado com bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas. No entanto, para células Gram-positivas, ajustes podem ser necessários para isolar a estrutura PG mais espessa e remover polímeros associados à parede celular; tais como, ácidos teicóicos.
   1. Ressuspender os pellets de células congeladas a aproximadamente 1:10 do volume de cultura original de fosfato de sódio 20 mM pH 6,5. Executar esta etapa a 4 °C (pode ser de 1 a 8 mg de peso de pellet de célula úmida por mL de tampão^11,12).
      OBS: Para manter o estado de acetilação do PG, é necessário um pH igual ou inferior^{a 6,5 15,16}.
   2. Adicione a suspensão celular dropwise à fervura de dodecil sulfato de sódio (SDS) 8% 20 mM fosfato de sódio pH 6,5 para um volume final de 1:1 (ou seja, a concentração final é de 4% SDS), agitando suavemente em um balão de fundo redondo equipado com um condensador refrigerado a água. (Figura 2, passo 2)
   3. Mantenha uma fervura suave por 30 min a 3 h com agitação para garantir a dissociação completa da membrana. Certifique-se de que a mistura resultante esteja completamente límpida, sem aglomerados celulares ou viscosidade remanescentes. A ebulição mais longa é preferível para garantir a dissociação completa.
   4. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. A amostra pode ser deixada à temperatura ambiente durante a noite.
      NOTA: Quando o SDS estiver presente, mantenha as amostras à temperatura ambiente para manter o SDS na solução.
   5. Coletar sacculi como um pellet através de ultracentrifugação a 70.000 x g por 40 min (ou o tempo necessário para sedimentar completamente os sacculi) a 25 °C.
   6. Lavar repetidamente os sáculos por ultracentrifugação sucessiva (ponto 1.2.5) e suspensão em ~50 ml de fosfato de sódio 20 mM à temperatura ambiente pH 6,5 até que o tampão de lavagem tenha uma concentração de SDS ~0,001%. Normalmente, 5 a 7 lavagens são suficientes.
      NOTA: Para testar a concentração do SDS restante no tampão de lavagem, use o corante colorimétrico, Stains-all¹⁷.
   7. Ressuspender os sáculos em 5–10 mL de temperatura ambiente 20 mM fosfato de sódio pH 6,5.
   8. Sonicar a amostra brevemente (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) à temperatura ambiente para dispersar aglomerados.
      NOTA: A sonicação prolongada causará mecanicamente cisalhamento da estrutura PG¹⁸.
   9. Completar a amostra com 50 μg/mL cada amilase, DNase e RNase, sulfato de magnésio 10 mM, e digerir a 37 °C por 1 h com agitação ou nutação.
      NOTA: A digestão da amilase remove qualquer glicogênio remanescente aprisionado dentro dos sáculos¹¹.
   10. Adicionar 100 μg/mL de pronase e digerir a 37 °C durante a noite com agitação ou nutação e ~0,02% de azida sódica.
       NOTA: A digestão Pronase remove as enzimas adicionadas (da secção 1.2.9) e remove as lipoproteínas que estão ligadas covalentemente ao PG.
       CUIDADO: A azida sódica é altamente tóxica e requer métodos adequados de uso/descarte.
   11. Ultracentrifugação a 70.000 x g por 40 min (ou o tempo necessário para sedimentar completamente os sacculi) a 25 °C para remover azida de sódio.
   12. Ressuspender o pellet em 25 mL de SDS 2% 20 mM fosfato de sódio pH 6,5.
   13. Ferver durante 1 h num vapor ou no balão de fundo redondo com condensador refrigerado a água (ponto 1.2.2).
       NOTA: A segunda etapa de ebulição do SDS remove todas as proteínas e contaminantes restantes dos sacculi.
   14. Repetir a lavagem dos sáculos (ponto 1.2.6) com ~50 ml de água bidestilada à temperatura ambiente (ddH₂O) até que a concentração de SDS seja de ~0,001%.
   15. Ressuspenda o pellet em uma quantidade suficiente de ddH₂O para suspender os sacculi, bem como lave o recipiente (por exemplo, 25 mL) e congele durante a noite a -80 °C. O volume pode variar à medida que a amostra será liofilizada na próxima etapa, porém, volumes menores demandam menos tempo para liofilizar.
   16. No dia seguinte, liofilize a suspensão e guarde em temperatura ambiente.
   17. Medir a quantidade de sáculos liofilizados obtidos em balança analítica.
   18. Diluir os sáculos em ddH₂O a 10 mg/mL e sonicar brevemente para quebrar os aglomerados antes de uma análise mais aprofundada.
3. Quantificação de peptidoglicano purificado
   1. Quantificar a quantidade de sáculos purificados a partir do ponto 1.2.18 para garantir que os dados de especificação de massa são equalizados durante a análise diferencial (ponto 3.2). Siga a metodologia detalhada descrita na Referência¹⁵.
      NOTA: Os sáculos purificados (ponto 1.2.18) são decompostos em componentes individuais de açúcar e aminoácidos por hidrólise ácida. Os componentes individuais são separados e quantificados por cromatografia de troca iônica usando detecção amperométrica pulsada. Dada a estrutura do PG (Figura 1), os muropeptídeos individuais são compostos por um único MurNAc e um único resíduo de GlcNAc. Portanto, quantificar a concentração de cada resíduo representa a quantidade de muropeptídeos 1:1 dentro da amostra. O MurNAc é preferido devido à separação limpa do pico de outros componentes do PG durante a cromatografia¹⁶.

2. Aquisição de dados por espectrometria de massas

1. Preparação de muropeptídeos para espectrometria de massas
   1. Suplementar 800 μg de sacculi purificado com 100 μg/mL de mutanolisina, 100 mM de acetato de amônio pH 5,5 e 50 mM de cloreto de magnésio em uma reação de 100 μL.
   2. Digerir a 37 °C durante a noite.
   3. Adicionar 1:1 volume 0,5 M tampão borato pH 9,0 e complementar com ~10 mg/mL de borohidreto de sódio (NaBH₄).
      NOTA: A mutarotação de açúcares cíclicos entre α e β formas anoméricas causará múltiplas formações de picos durante a separação por cromatografia líquida dos muropeptídeos. O tratamento com NaBH₄ elimina a interconversão entre as duas formas, reduzindo o MurNAc em muramitol¹¹. O tratamento não reduz os resíduos de açúcar 1,6-anidro ou 1,4-ligado.
      CUIDADO: A reação do NaBH₄ produz pequenas quantidades de gás hidrogênio. A reação de NaBH₄ criará bolhas e os tubos de microfuga devem ser mantidos abertos para permitir que o gás escape.
   4. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante ~20–30 min.
   5. Centrifugar brevemente para fixar a amostra no tubo de microfuga e remover bolhas.
   6. Ajustar o pH para <4,0 usando ácido fosfórico 1:5, adicionado em incrementos de 5 μL. Teste o pH usando tiras de teste de pH litmus.
   7. Centrifugar a ~17.000 x g por 1 min para sedimentar qualquer material insolúvel restante.
   8. Filtrar utilizando filtros de microcentrífuga de 0,2 μm.
   9. As amostras são centrifugadas por 10 min a 30.000 x g antes da injeção em LC-MS para garantir que quaisquer partículas não sejam injetadas em MS.
2. Configuração do LC-MS
   1. Anexe uma coluna de partículas superficialmente porosas C18 (100 mm x 2,1 mm, tamanho de poro <3 μm) a um espectrômetro de massa quadrupolo-time of flight (qtof) com uma precisão mínima detecção quatro pontos decimais m/z .
   2. Realizar separação por cromatografia líquida de muropeptídeos
      NOTA: Cada triplicata biológica (secção 1.1.1) deve ser executada através do LC-MS (secções 2.2.2 a 2.2.3) três vezes (triplicata técnica). Portanto, cada condição testada terá um total de nove arquivos de dados LC-MS. A aquisição de dados foi realizada por meio de software disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). No entanto, o software de aquisição deve ser escolhido com base no maquinário MS. O seguinte representa um guia para configurar o MS com parâmetros específicos para executar este protocolo. Para obter uma descrição detalhada, consulte o manual do fabricante.
      1. Para a separação cromatográfica, preparar os seguintes solventes ácido fórmico a 0,1% (A) e acetonitrila com ácido fórmico a 0,1% (B).
      2. Configure um método de separação cromatográfica usando os seguintes parâmetros.
      3. Ajuste o fluxo para 0,4 mL/min.
      4. Condicione a coluna por 10 min a 2% B (~24 volumes de coluna).
      5. Com um amostrador automático, injectar 10 μL de amostra a partir do ponto 2.1.9.
         Observação : execute uma amostra inicial através do protocolo LC-MS antes de iniciar a coleta de dados. Essa execução não é usada para dados, mas para aumentar a reprodutibilidade do tempo de retenção para todas as execuções subsequentes. A reprodutibilidade do tempo de retenção é necessária durante o processamento espectral (secção 3.1) para a identificação e agrupamento precisos dos picos da relação massa/carga (m/z).
      6. Separe os muropeptídeos usando 2% B por 5 min (~12 volumes de coluna), depois aumentando-o para 15% B em 13 min (~30 volumes de coluna), aumentando-o ainda mais para 50% B em 10 min (~24 volumes de coluna) e, finalmente, aumentando-o para 98% B em 2 min (~5 volumes de coluna).
         OBS: Descarte (envie para o lixo) os primeiros 2 min e os últimos 5 min do gradiente.
      7. Termine com uma lavagem de coluna a 98% B por 6 min (~14 volumes de coluna) e 20 min (~47 volumes de coluna) de reequilíbrio.
   3. Realizar detecção por espectrometria de massa de muropeptídeos
      1. Calibrar o eixo de massa em modo positivo usando uma mistura de afinação em acetonitrila contendo padrões de massa de referência LC-MS seguindo as instruções do fabricante do MS.
         NOTA: O MS é ajustado antes do início das execuções cromatográficas (ponto 2.2.2.1).
      2. Configure um método para aquisição de dados MS usando os seguintes parâmetros.
         NOTA: Os dados de EM e EM/EM são recolhidos (secções 2.2.3.2 a 2.2.3.6) em simultâneo com a separação cromatográfica dos muropeptídeos (secções 2.2.2.4 e 2.2.2.5). Ambos os parâmetros cromatográficos e MS (seções 2.2.2.2 e 2.2.3.2) são um único método que é adicionado durante a configuração de uma lista de trabalho para executar várias amostras em sequência.
      3. Ajuste a tensão capilar do electrospray em 4,0 kV e a temperatura do gás de secagem em 350° C com uma vazão de 13 L/min.
         NOTA: O nitrogênio (pureza >99%) deve ser usado como nebulização, secagem e gás de colisão durante toda a coleta de dados de espectrometria de massa.
      4. Ajuste a pressão do nebulizador para 40 psi e ajuste o fragmentador para 150 V.
      5. Ajuste as tensões de RF do bico, skimmer e octapolo para 1000 V, 65 V e 750 V, respectivamente.
      6. Defina o intervalo de varredura para 300–2.000 m/z no modo de íons positivos de 4 GHz (faixa dinâmica estendida).
      7. Defina a coleta de dados usando aquisição de MS/MS dependente de dados com uma taxa de varredura de MS e MS/MS de 1 espectro/segundo. Selecione cinco massas precursoras por ciclo, na ordem de carga única, dupla e tripla.
      8. Defina as energias de colisão de fragmentação MS/MS para 15, 20 e 30 eV.

3. Análise diferencial da abundância de muropeptídeos

1. Processamento espectral do cromatograma LC-MS
   NOTA: A extração de recursos recursivos foi realizada usando software disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Outros softwares de extração de recursos podem ser usados. No entanto, outros softwares podem exigir processamento manual de dados adicional para realizar a extração recursiva altamente robusta. Vários softwares usam o recurso de terminologia, entidade e composto quase que alternadamente. Para a análise de PG, todos se referem à identificação do cromatograma de íons LC-MS representativo de um muropeptídeo individual (por exemplo, Figura 3). Durante o processamento espectral (seção 3.1), uma característica representa os múltiplos picos m/z que englobam as múltiplas espécies possíveis de íons de um único muropeptídeo que são agrupadas sob um único rótulo composto.
   1. Em Arquivo, inicie um novo projeto.
   2. Adicione os arquivos de dados LC-MS QTOF e atribua arquivos de dados individuais a uma condição / grupo experimental, por exemplo, duas condições de crescimento diferentes.
   3. Execute o assistente de processamento de dados Extração de recursos recursivos em lote (pequenas moléculas/peptídeos) e defina os filtros de processamento de dados para corresponder aos parâmetros das condições LC-MS e instrumentação para identificar, agrupar e verificar com precisão picos m/z que representam muropeptídeos individuais. A partir do cromatograma, examine a deriva do tempo de retenção e a variação de m/z de picos similares conhecidos para definir os parâmetros iniciais do filtro.
      NOTA: A extração de recursos recursivos usa um algoritmo inicial de extração de feição molecular não direcionado para identificar e alinhar recursos de cromatograma (picos m/z ) em todos os arquivos de dados. Uma vez criados, esses recursos são usados para reavaliar os arquivos de dados originais (recursivos) com um algoritmo de extração de características moleculares direcionado para melhorar a confiabilidade e a precisão dos recursos identificados. É melhor definir a extração inicial não direcionada com uma janela de detecção estreita e usar parâmetros de detecção mais amplos para a extração recursiva para identificar picos em todos os arquivos de dados que podem estar faltando na extração inicial. A execução da extração de recurso recursivo pode levar horas para ser concluída, dependendo do número de amostras, da complexidade dos dados e do hardware do computador presente
   4. Revise os resultados da extração de recursos. Se um número significativo de recursos não conseguir se alinhar em um grupo, ajuste os parâmetros de filtragem recursiva para ampliar/restringir a janela de detecção, conforme necessário. Para fazer isso, inspecione o cromatograma e o perfil isotópico de cada recurso extraído para garantir que a detecção de recursos foi realizada de forma semelhante em todos os arquivos de dados. Além disso, para cada recurso identificado em um arquivo de dados, examine a pontuação, quaisquer avisos e se o recurso passou nos parâmetros de filtro escolhidos.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado para manter as janelas de detecção estreitas o suficiente para que recursos distintos não sejam agrupados por engano. Isso geralmente é observado por perfis isotópicos díspares entre arquivos de dados, ou variações significativas de m/z / tempo de retenção. Por outro lado, se houver vários recursos com tempos de retenção e m/z semelhantes, é possível que os parâmetros de filtro tenham sido muito rigorosos, resultando em um pico de MS sendo dividido em dois recursos. Portanto, execute a extração de recursos (seção 3.1.3) novamente com parâmetros de filtro de tempo de retenção ajustados para permitir um melhor agrupamento desses recursos. A visualização dos picos de abundância mais baixos indicará se os filtros utilizados (secção 3.1.3) identificaram com precisão os picos acima do ruído de fundo. Se os picos de abundância mais baixos parecerem semelhantes ao plano de fundo, execute novamente a extração de recurso com novos parâmetros de filtro de plano de fundo.
   5. Exporte dados como um arquivo de troca composto (.cef) (um formato compatível com o programa de software estatístico) ou um arquivo separado por coluna (.csv) que contém a massa, o tempo de retenção e a abundância de cada recurso para cada amostra.
2. Análise diferencial de características espectrais
   NOTA: A análise diferencial foi realizada utilizando software disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). Outros softwares de bioinformática podem ser utilizados.
   1. Abra o programa e, quando instruído, inicie um novo projeto.
   2. Siga as instruções para importação e análise de dados. Durante a importação de dados, carregue os arquivos extraídos do recurso (seção 3.1). Durante a análise de dados, escolha a significância e a alteração de dobra para análise diferencial e selecione os dados de linha de base para a intensidade média em todos os arquivos de dados. Não defina nenhum filtro de dados (se isso foi feito na etapa anterior de processamento de espectros (seção 3.1)), pois a aplicação de filtros novamente anularia a extração robusta de recursos recursivos. No entanto, semelhante à extração de características, a análise diferencial deve ser alinhada com base na massa (m/z) e no tempo de retenção devido à deriva na coleta de dados LC-MS. Use os parâmetros determinados na extração de recursos (seção 3.1).
      NOTA: Normalizar entre ficheiros de dados utilizando a quantificação de muropeptídeo (secção 1.3) para garantir que as variações são devidas a parâmetros experimentais e não devidas a variações na purificação de sáculos (secção 1.2). Use a opção de dimensionador externo para ajustar cada arquivo de dados para diferenças na concentração de MurNAc da amostra.
   3. Uma vez concluída a análise, examine as análises gráficas e estatísticas resultantes para identificar muropeptídeos que demonstram uma mudança significativa de abundância entre as condições experimentais testadas.
   4. No navegador do projeto, clique com o botão direito do mouse nas várias análises e escolha uma opção de exportação para salvar os detalhes do recurso como um arquivo de dados separado por coluna (.csv) que contém o m/z, tempo de retenção, valores de intensidade bruta e normalizada, valor p, FDR e alterações de dobra para cada recurso. Múltiplas análises devem ser salvas para obter todos os dados relevantes.
   5. Exportar um segundo arquivo .csv contendo apenas os muropeptídeos que ultrapassaram as análises estatísticas, incluindo p-valor <0,05 e fold change >2.
3. Anotação da identidade de muropeptídeos em características espectrais
   NOTA: A cada característica identificada deve ser atribuída uma estrutura de muropeptídeo prevista com base no m/z e esta anotação confirmada examinando a fragmentação MS/MS. Após a confirmação das anotações, pode ser necessário realizar e refinar a análise diferencial (ponto 3.2).
   1. Dentro do software de análise diferencial, em interpretação de resultados, selecione ID browser. Adicionar uma biblioteca de estruturas de muropeptídeos esperadas e selecionar parâmetros semelhantes aos usados anteriormente (seção 3.1.3). Isso produzirá uma anotação de muropeptídeo prevista para cada característica identificada. Uma biblioteca de estruturas de muropeptídeos pode ser produzida usando o m/z para estruturas de muropeptídeos previstas e software de banco de dados MS (ver Tabela de Materiais). No entanto, uma biblioteca de m/z de >6.000 possíveis muropeptídeos pode ser encontrada na Referência¹².
   2. Selecione a anotação de muropeptídeo prevista com base no escore de pareamento e na relevância biológica do muropeptídeo predito, ou seja, escolha o muropeptídeo mais provável de estar presente na amostra biológica.
   3. Confirme manualmente a anotação de muropeptídeo predita comparando os picos m/z do cromatograma MS/MS com o m/z previsto de todas as possíveis fragmentações de uma estrutura de muropeptídeo conhecida (por exemplo, Figura 4).
      1. Visualize os dados de MS e MS/MS usando um programa de visualização de cromatogramas (consulte Tabela de Materiais, Figura 4).
      2. Desenhe a estrutura de muropeptídeo prevista usando um editor molecular (programa de desenho de estrutura química) (ver Tabela de Materiais, Figura 4, inserção cinza). Use a ferramenta de fragmentação de massa para mostrar o m/z de fragmentos de MS quando cada ligação é quebrada individualmente ou em combinação.
         NOTA: Dependendo da energia de fragmentação usada para MS/MS, a fragmentação pode acontecer em qualquer ligação na estrutura do muropeptídeo. No entanto, algumas ligações são mais facilmente / frequentemente fragmentadas em níveis de energia mais baixos. Por exemplo, a fragmentação na cadeia lateral do peptídeo ocorre mais frequentemente na ligação amida entre aminoácidos. Ao avaliar a fragmentação, é importante notar que os resíduos de GlcNAc são facilmente fragmentados do muropeptídeo. Portanto, a fragmentação da estrutura conhecida do muropeptídeo deve ser avaliada com e sem GlcNAc. Devido à fragmentação na fonte do GlcNAc, várias características extraídas no processamento espectral (seção 3.1) podem representar uma única estrutura de muropeptídeo. Se encontradas, essas características devem ser mescladas e a análise diferencial reavaliada.
      3. Comparar todas as possíveis fragmentações da estrutura do muropeptídeo determinada (secção 3.3.3.2) com o cromatograma MS/MS (secção 3.3.3.1). Para confirmar a anotação do muropeptídeo, os picos m/z de múltiplos fragmentos devem ser encontrados no cromatograma MS/MS com uma janela de alinhamento m/z mínima (Figura 4).
      4. A fim de elucidar a identidade do muropeptídeo no caso de fragmentação ambígua de EM/EM, repita as seções 2.2.2 a 2.2.3 com amostras (seção 2.1.9) para aquisição adicional de dados de MS/MS incorporando uma lista de precursores preferenciais de m/z e tempo de retenção com energias adicionais de colisão de fragmentação de MS/MS.
   4. Para entidades co-eluidoras que foram anotadas como o mesmo muropeptídeo, execute a análise diferencial (seção 3.2.2) novamente e mescle as características extraídas.
4. Avaliação das mudanças globais nas modificações de muropeptídeos
   1. Edite o arquivo .csv (seção 3.2.4) dos muropeptídeos de alta alteração de dobra estatisticamente significativos para incluir uma única coluna para cada modificação de muropeptídeo. Preencher esta coluna com uma designação para cada muropeptídeo anotado (secção 3.3) (por exemplo, GlcNAc ou MurNAc acetilado versus des-N-acetilado).
   2. Carregue o arquivo .csv modificado no Perseus^22,23. Importe os valores de intensidade normalizados para a caixa Importação principal e importe a designação de modificação para a caixa Importação categórica.
   3. Em Anotar linhas, clique em Anotar linhas categoricamente e adicione arquivos de dados a cada parâmetro experimental.
   4. Em teste, clique em dois testes amostrais para realizar o teste t de um aluno (p-valor < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
   5. Clique em 1D para realizar a anotação 1D^22,23. Uma anotação 1D FDR < 0,05 indica uma mudança significativa na abundância para a modificação do muropeptídeo entre os parâmetros experimentais testados. A definição do valor limite (s0) = 1 exibirá os escores FDR de anotação 1D para todos os muropeptídeos.
   6. Dentro de um software gráfico (ver Tabela de Materiais), produza um mapa de calor da mudança de dobra de abundância para cada modificação de muropeptídeo e mostre o escore de anotação 1D para demonstrar significância (Figura 5B). A mudança de dobra de cada modificação de muropeptídeo pode ser produzida no Microsoft Excel usando as intensidades brutas de todos os muropeptídeos individuais que contêm a modificação.

O aumento da sensibilidade de detecção das máquinas MS, juntamente com o software de reconhecimento de pico de alta potência, melhorou a capacidade de isolar, monitorar e analisar composições de substâncias de amostras complexas em detalhes minuciosos. Utilizando esses avanços tecnológicos, estudos recentes sobre a composição de peptidoglicanos começaram a utilizar técnicas automatizadas de extração de características LC-MS 12,13,14,24 em detrimento de metodologias mais antigas baseadas em HPLC 11,25,26,27,28,29,30,31 . Embora existam inúmeros pacotes de software genéricos de extração de recursos disponíveis, o software comercial que usa extração de recursos recursivos é rápido e altamente robusto, identificando e combinando automaticamente todas as cargas, isótopos e versões de adutos de cada muropeptídeo encontrado no conjunto de dados LC-MS (Figura 3). Além disso, tempos de retenção iniciais, m/z e padrões isotópicos de recursos extraídos são usados para reavaliar (recursiva) o conjunto de dados para garantir a identificação precisa de cada recurso em todos os arquivos de dados. Portanto, o algoritmo recursivo auxilia na validação e aumento da confiança na identificação de picos. A maioria dos programas genéricos de extração de recursos não agrupa cargas/isótopos, etc. e exigirá isso como uma etapa manual adicional. Além disso, os programas genéricos serão menos robustos, pois os recursos são extraídos separadamente dentro de cada arquivo de dados e não como um conjunto de dados inteiro, que faz parte do algoritmo recursivo.

O protocolo peptidoglicômico aqui apresentado foi recentemente utilizado para examinar as mudanças composicionais do PG entre duas condições fisiológicas de crescimento, a saber, o biofilme planctônico de nado livre e o biofilme comunal estacionário12. Usando um QTOF MS altamente sensível juntamente com a extração de características recursivas, 160 muropeptídeos distintos foram reconhecidos e rastreados. Isso representou oito vezes o número de muropeptídeos identificados neste organismo anteriormente 29,32, e mais que o dobro dos muropeptídeos identificados usando outras metodologias em outros organismos10,14,24.

A associação de cada pico m/z extraído dos dados de SM com um muropeptídeo particular é facilitada pelo cruzamento com um banco de dados de estruturas de muropeptídeos conhecidas e previstas. O cromatograma MS/MS de fragmentação (Figura 4) para cada característica extraída é comparado com o perfil de fragmentação (Figura 4, inserção cinza) do muropeptídeo proposto no banco de dados.

Os dados peptidoglicômicos podem ser visualizados de várias maneiras diferentes, dependendo da configuração experimental e das perguntas que estão sendo feitas. Essa análise gráfica pode incluir análise de componentes principais (ACP), gráficos de dispersão, gráficos de vulcão, mapas de calor e análise de agrupamento hierárquico. Por exemplo, gráficos vulcânicos destacam muropeptídeos que demonstram uma magnitude estatisticamente alta de mudança de abundância entre as condições testadas (Figura 5A). Estes muropeptídeos selecionados, que representam mudanças significativas de abundância entre as condições testadas, podem ser examinados para modificações de muropeptídeos. Essas modificações podem incluir a presença de substituições de aminoácidos, alterações de acetilação ou a presença de atividade de amidase. Quando examinados em conjunto, múltiplos muropeptídeos que possuem a mesma modificação podem ser examinados quanto a uma tendência para uma condição experimental (Figura 5A – pontos destacados verde) e todo o grupo avaliado quanto à significância (Figura 5B). O rastreamento de uma modificação do muropeptídeo dessa forma pode indicar uma atividade enzimática particular que é afetada pelo parâmetro experimental. Além disso, outliers dessa tendência podem indicar atividade enzimática com uma especificidade ou função biológica particular (Figura 5A – pontos destacados laranja).

Figura 1: Exemplo de uma estrutura típica de peptidoglicanos Gram-negativos. (A) Nas bactérias Gram-negativas, o peptidoglicano está localizado no periplasma entre as membranas interna e externa. (B) Um único muropeptídeo consiste de um N-acetilglucosamina ligado ao β-1,4 (GlcNAc) (azul) e um ácido N-acetil murâmico (MurNAc) (roxo) com uma cadeia lateral peptídica anexada (laranja). A cadeia lateral do peptídeo pode ser reticulada à cadeia lateral do muropeptídeo adjacente produzindo o peptidoglicano maduro semelhante a uma malha (A). A purificação envolve o isolamento do peptidoglicano de toda a célula como um sáculo onde todo o outro material celular foi retirado. (C) Micrografia eletrônica de transmissão de um peptidoglicano sacculi. Em comparação, o PG Gram-positivo pode consistir em uma maior variedade de variações na estrutura e faz parte da classificação taxonômica Gram-positiva33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho peptidoglicômico. Preparo da Amostra. Passo 1, crescer e pellet células bacterianas (secção 1.1). Passo 2, purificar os sáculos de peptidoglicanos por 4% de SDS ferver (secção 1.2). Aquisição de Dados. Etapa 3, digestão enzimática dos sáculos para produzir muropeptídeos por quebra da ligação β-1,4 entre a N-acetilglucosamina (GlcNAc) e o ácido N-acetilmurâmico (MurNAc) da espinha dorsal do peptidoglicano (secção 2.1). Etapa 4, análise da intensidade do muropeptídeo através de LC-MS/MS (seção 2.2). Análise de dados. Etapa 5, extração de feição recursiva identifica e coleta todas as cargas, adutos e isótopos associados a um único muropeptídeo (seção 3.1). Passo 6, identificação dos muropeptídeos comparando a fragmentação prevista com cromatogramas MS/MS (secção 3.3). Etapa 7, análise diferencial de bioinformática (seção 3.2) comparando as mudanças na composição de peptidoglicanos entre diferentes parâmetros experimentais. Passo 8, examinar a mudança global nas modificações de muropeptídeos dentro dos diferentes parâmetros experimentais usando anotação 1D (seção 3.4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplo de uma extração de recurso recursiva. Para um muropeptídeo representando uma cadeia lateral peptídica de alanina (A), iso-ᴅ-glutamato (E), ácido meso-diaminopimélico (m), alanina (A) reticulada ao AE m A da cadeia lateral do muropeptídeo adjacente (1864,8 m/z). Incluídos no recurso extraído para 1864,8 m/z estão cargas (+1, +2 e +3), adutos (por exemplo, sódio e potássio), perda de GlcNAc (1 ou 2 GlcNAc) e múltiplos picos isotópicos para cada variação (por exemplo, inserção ampliada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Fragmentação e identificação de muropeptídeos. Para anotação, cada pico m/z (característica) extraído do cromatograma MS recebe uma estrutura de muropeptídeos proposta baseada na similaridade com uma biblioteca de muropeptídeos. Para confirmar essa estrutura proposta, fragmentos previstos de MS/MS são gerados usando um programa de desenho químico (inserção cinza). Essa fragmentação prevista é comparada ao cromatograma MS/MS. Quando os fragmentos previstos (inserção cinza) correspondem ao cromatograma MS/MS, a estrutura de muropeptídeos proposta é confirmada. A figura foi modificada da referência12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise diferencial da composição peptidoglicana. (A) Gráfico vulcânico da mudança de dobra e significância estatística das mudanças na intensidade do muropeptídeo entre peptidoglicanos purificados de P. aeruginosa cultivados como cultura planctônica ou estacionária de nado livre. Todos os muropeptídeos que apresentam uma modificação que representou uma mudança no arranjo típico de aminoácidos dentro da cadeia lateral do peptídeo são destacados. Muropeptídeos substituídos por aminoácidos que mostraram uma tendência à diminuição da abundância em peptidoglicanos derivados de biofilme são destacados em verde. Muropeptídeos substituídos por aminoácidos que foram outliers a essa tendência e mostraram maior abundância em peptidoglicanos derivados de biofilme são destacados em laranja. (B) Mapa de calor da dobra global muda na abundância de todos os muropeptídeos substituídos por aminoácidos com aumento da abundância (laranja) e diminuição da abundância (verde) nos biofilmes. Esses muropeptídeos foram reagrupados e avaliados se a substituição de aminoácidos ocorreu em monômeros, dímeros reticulados ou se o quarto (AEm+), quinto (AEmA+) ou ambos os aminoácidos (AEm++) foram substituídos. A significância de cada grupo de muropeptídeos foi avaliada por anotação 1D com FDR < 0,05 para significância e o escore 1D associado é exibido. A anotação 1D só pode ser realizada em mais de 2 muropeptídeos (por exemplo, a substituição AEm++ só foi encontrada em dois muropeptídeos). Portanto, neste caso, a significância deve ser examinada para os muropeptídeos individuais e não para o grupo. A figura foi modificada da referência12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.