Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

يغطي هذا البروتوكول تحليلا مفصلا لتكوين الببتيدوغليكان باستخدام قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب استخراج الميزات المتقدمة وبرامج تحليل المعلوماتية الحيوية.

Abstract

الببتيدوغليكان هو عنصر مهم في جدران الخلايا البكتيرية وهدف خلوي شائع لمضادات الميكروبات. على الرغم من أن جوانب بنية الببتيدوغليكان محفوظة إلى حد ما في جميع البكتيريا ، إلا أن هناك أيضا تباينا كبيرا بين إيجابيات / سلبيات الجرام وبين الأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من الاختلافات أو التعديلات أو التكيفات المعروفة على الببتيدوغليكان التي يمكن أن تحدث داخل الأنواع البكتيرية استجابة لمرحلة النمو و / أو المحفزات البيئية. تنتج هذه الاختلافات بنية ديناميكية للغاية معروفة بالمشاركة في العديد من الوظائف الخلوية ، بما في ذلك النمو / الانقسام ، ومقاومة المضادات الحيوية ، وتجنب دفاع المضيف. لفهم التباين داخل الببتيدوغليكان ، يجب تقسيم الهيكل العام إلى أجزائه المكونة (المعروفة باسم muropeptides) وتقييمها للتكوين الخلوي العام. يستخدم Peptidoglycomics قياس الطيف الكتلي المتقدم جنبا إلى جنب مع تحليل بيانات المعلوماتية الحيوية عالية الطاقة لفحص تكوين الببتيدوغليكان بتفاصيل دقيقة. يصف البروتوكول التالي تنقية الببتيدوغليكان من الثقافات البكتيرية ، والحصول على بيانات كثافة الموروببتيد من خلال كروماتوجراف سائل - مطياف الكتلة ، والتحليل التفاضلي لتكوين الببتيدوغليكان باستخدام المعلوماتية الحيوية.

Introduction

الببتيدوغليكان (PG) هو سمة مميزة للبكتيريا تعمل على الحفاظ على مورفولوجيا الخلية ، مع توفير الدعم الهيكلي للبروتينات والمكونات الخلوية الأخرى 1,2. يتكون العمود الفقري ل PG من حمض N-acetyl muramic المرتبط ب β-1،4 (MurNAc) و N-acetyl glucosamine (GlcNAc) 1,2. يمتلك كل MurNAc ببتيدا قصيرا مرتبطا ببقايا ᴅ-lactyl يمكن ربطه بالببتيدات المجاورة المرتبطة بالسكاريد (الشكل 1أ ، ب). ينتج عن هذا التشابك بنية تشبه الشبكة تشمل الخلية بأكملها وغالبا ما يشار إليها باسم الكيس (الشكل 1C). أثناء تخليق PG ، يتم إنشاء السلائف في السيتوبلازم ، ويتم نقلها عبر الغشاء السيتوبلازمي بواسطة الزعانف. يتم دمج السلائف لاحقا في PG الناضج بواسطة إنزيمات transglycosylase و transpeptidase ، والتي تنتج روابط glycosidic والببتيد ، على التوالي3. ومع ذلك ، بمجرد تجميعها ، هناك العديد من الإنزيمات التي تنتجها البكتيريا التي تعدل و / أو تحلل PG لتنفيذ عدد من العمليات الخلوية ، بما في ذلك النمو والانقسام. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التعديلات المختلفة ل PG تمنح تكيفات خاصة بالسلالة وظروف النمو والإجهاد البيئي ، والتي تورطت في إشارات الخلية ، ومقاومة مضادات الميكروبات ، والتهرب المناعي للمضيف4. على سبيل المثال ، التعديل الشائع هو إضافة مجموعة C6 acetyl على MurNAc التي تمنح المقاومة عن طريق الحد من الوصول إلى روابط الجليكان β-1,4 إلى إنزيمات الليزوزيم المنتجة من المضيف والتي تحلل PG4،5،6. في المكورات المعوية ، يمنح استبدال الطرف ᴅ-Ala من السلسلة الجانبية للببتيد ب ᴅ-Lac مقاومة أكبر لمضادات الميكروبات ، فانكومايسين 7,8.

ظل الإجراء العام لعزل وتنقية PG دون تغيير نسبيا منذ أن تم وصفه في ستينيات القرن العشرين9. يتم إذابة الأغشية البكتيرية من خلال المعالجة الحرارية باستخدام SDS ، تليها الإزالة الأنزيمية للبروتينات المرتبطة ، والجليكوليبيدات ، والحمض النووي المتبقي. يمكن بعد ذلك هضم الكيس السليم المنقى في المكونات الفردية عن طريق التحلل المائي للارتباط β-1،4 بين GlcNAc و MurNAc. ينتج هذا الهضم ثنائي السكاريد GlcNAc-MurNAc مع أي تعديلات هيكلية و / أو روابط متقاطعة سليمة وتسمى muropeptides (الشكل 1B).

تم إجراء التحليل التركيبي ل PG في البداية من خلال الفصل الكروماتوجرافي السائل عالي الضغط (HPLC) لتنقية كل موروببتيد متبوعا بالتحديد اليدوي للببتيدات الموروببتيدات10,11. ومنذ ذلك الحين تم استبدال هذا بقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، مما يزيد من حساسية الكشف ويقلل من عبء العمل اليدوي لتنقية كل ببتيد موروببتيد فردي. ومع ذلك ، ظلت الطبيعة المعقدة والمستهلكة للوقت للتحديد اليدوي للببتيدات muropeptides عاملا مقيدا ، مما قلل من عدد الدراسات التي أجريت. في السنوات الأخيرة مع ظهور التقنيات "omic" ، أصبح استخراج ميزة LC-MS الآلي أداة قوية ، مما يسمح بالكشف السريع وتحديد المركبات الفردية في عينات معقدة من مجموعات بيانات كبيرة جدا. بمجرد تحديد الميزات ، يقارن برنامج المعلوماتية الحيوية إحصائيا التباين بين العينات باستخدام التحليل التفاضلي لعزل حتى الحد الأدنى من الاختلافات بين مجموعة البيانات المعقدة وعرضها بيانيا للمستخدم. بدأ للتو استكشاف تطبيق برنامج استخراج الميزات لتحليل تكوين PG 12،13،14 ويقترن بتحليل المعلوماتية الحيوية 12. على عكس التحليل البروتيني الذي يستفيد من قواعد بيانات البروتين المتاحة بسهولة والتي تتنبأ بتجزئة الببتيد مما يسمح بتحديد الهوية الآلي بالكامل ، لا توجد مكتبة تجزئة حاليا ل peptidoglycomics. ومع ذلك ، يمكن أن يقترن استخراج المعالم بقواعد بيانات هيكلية معروفة ومتوقعة للتنبؤ بتحديد muropeptide12. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لاستخدام استخراج الميزات المستندة إلى LC-MS جنبا إلى جنب مع مكتبة muropeptide لتحديد الهوية الآلية والتحليل التفاضلي المعلوماتي الحيوي لتكوين PG (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير عينة الببتيدوغليكان

  1. نمو الثقافات البكتيرية
    ملاحظة: سيختلف نمو المزارع البكتيرية اعتمادا على الأنواع البكتيرية وظروف النمو التي يتم فحصها. ستحدد المعلمات التجريبية التي سيتم اختبارها ظروف النمو.
    1. تنمو المزارع البكتيرية في ظل ظروف النمو المطلوبة للسلالة البكتيرية والتصميم التجريبي. تنمو البكتيريا كمزارع ثلاثية (تتكاثر بيولوجيا) ، أي ثلاث مستعمرات منفصلة لكل سلالة أو حالة نمو.
      ملاحظة: من المعروف أن ظروف النمو ومرحلة النمو لها تأثيرات كبيرة على تكوين PG1،2،10. يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الاتساق بين الثقافات والنسخ المتماثلة لضمان أن التغييرات التركيبية ناتجة عن المعلمات التجريبية وليس الخطأ التجريبي.
    2. قم بتبريد المزرعة بسرعة إلى 4 درجات مئوية ، وقم بالتجميع عن طريق الطرد المركزي (11000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) وقم بتجميد حبيبات الخلية عند -20 درجة مئوية. اغسل حبيبات الخلية بمبردة مسبقا 4 درجات مئوية ، 20 مللي متر من فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5 قبل التجميد. يجب أن يتم إنتاج حبيبات الخلايا المجمدة بأسرع ما يمكن واتساقا بين العينات للحد من نشاط الإنزيمات التي يمكن أن تعدل و / أو تحلل PG أثناء عملية التجميع. يمكن معالجة العينات مباشرة من خلال عملية الاستخراج (القسم 1.2) دون تجميد ؛ ومع ذلك ، تأكد من معالجة جميع العينات بطريقة مماثلة.
      ملاحظة: لضمان منتج كاف للخطوات اللاحقة ، يتم استخدام حبيبات خلية رطبة كبيرة الحجم. ينتج عن ذلك حبيبات ساكولي كبيرة بما فيه الكفاية ، والتي يمكن تصورها وصيانتها بسهولة أثناء خطوات الغسيل المتكررة (القسم 1.2.5 و 1.2.14) دون فقد كبير للمنتج. اعتمادا على البكتيريا وظروف النمو ، من المحتمل أن يختلف هذا العائد. بالنسبة للبكتيريا سالبة الجرام Pseudomonas aeruginosa ، PAO1 ، أنتجت 4 لتر من مزرعة 0.5 OD600 حبيبات خلية 3-4 جم وكانت كافية لإنتاج ~ 10 ملغ من الكيسولي المنقى (القسم 1.2.17) 12. هذا هو فائض كبير من saculi مما هو مطلوب ل LC-MS (القسم 2) ؛ ومع ذلك ، سيساعد في دقة القياس (القسم 1.2.17) والتطبيع (القسم 1.3).
  2. استخراج الببتيدوغليكان ساكولي
    ملاحظة: بروتوكول استخراج PG مقتبس من المرجع.9,11,15. سيقوم هذا البروتوكول باستخراج PG من الخلايا البكتيرية الفردية ككيس كامل ، خال من المكونات الخلوية الأخرى. يمكن استخدام البروتوكول مع البكتيريا سالبة الجرام أو إيجابية الجرام. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا إيجابية الجرام ، قد تكون التعديلات ضرورية لعزل بنية PG الأكثر سمكا وإزالة البوليمرات المرتبطة بجدار الخلية. مثل أحماض تيكويك.
    1. إعادة تعليق كريات الخلايا المجمدة عند حوالي 1:10 من حجم المزرعة الأصلي البالغ 20 مللي متر من فوسفات الصوديوم 6.5. نفذ هذه الخطوة عند 4 درجات مئوية (يمكن أن يكون 1-8 مجم من وزن حبيبات الخلايا الرطبة لكل مل من المخزن المؤقت11,12).
      ملاحظة: للحفاظ على حالة أستلة PG ، يلزم وجود درجة حموضة 6.5 أو أقل15,16.
    2. أضف معلق الخلية بالتنقيط إلى الغليان 8٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5 لحجم نهائي 1: 1 (أي التركيز النهائي هو 4٪ SDS) ، مع التحريك برفق في دورق دائري القاع مجهز بمكثف مبرد بالماء. (الشكل 2، الخطوة 2)
    3. حافظ على غليان لطيف لمدة 30 دقيقة إلى 3 ساعات مع التحريك لضمان تفكك الغشاء بالكامل. تأكد من أن الخليط الناتج واضح تماما مع عدم وجود كتل أو لزوجة متبقية للخلايا. يفضل الغليان لفترة أطول لضمان التفكك التام.
    4. اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. يمكن ترك العينة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
      ملاحظة: عند وجود SDS ، احتفظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على SDS في المحلول.
    5. اجمع الساكولي كحبيبات من خلال الطرد المركزي الفائق عند 70000 × جم لمدة 40 دقيقة (أو الوقت اللازم لتكسير الرواسب بالكامل) عند 25 درجة مئوية.
    6. غسل الكيس بشكل متكرر عن طريق الطرد المركزي الفائق المتتالي (القسم 1.2.5) والتعليق في ~ 50 مل من درجة حرارة الغرفة 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5 حتى يحتوي المخزن المؤقت للغسيل على تركيز SDS ~ 0.001٪. عادة ، 5 إلى 7 غسلات كافية.
      ملاحظة: لاختبار تركيز SDS المتبقي في المخزن المؤقت للغسيل ، استخدم الصبغة اللونية ، Stains-all17.
    7. إعادة تعليق sacculi في 5-10 مل من درجة حرارة الغرفة 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5.
    8. قم بتقطيع العينة لفترة وجيزة (~ 40٪ ، 50 واط ، 20 كيلو هرتز ، 20 ثانية) في درجة حرارة الغرفة لتفريق الكتل.
      ملاحظة: سوف يؤدي صوتنة ممتدة ميكانيكيا القص من هيكل PG18.
    9. استكمل العينة ب 50 ميكروغرام / مل لكل من الأميليز و DNase و RNase ، و 10 mM من كبريتات المغنيسيوم ، واهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التقليب أو التعويذة.
      ملاحظة: يزيل هضم الأميليز أي جليكوجين متبقي محاصر داخل الكيس11.
    10. أضف 100 ميكروغرام / مل من البروناز واهضمه عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع التقليب أو التقطيع و ~ 0.02٪ أزيد الصوديوم.
      ملاحظة: يزيل هضم البروناز الإنزيمات المضافة (من القسم 1.2.9) ويزيل البروتينات الدهنية المرتبطة تساهميا ب PG.
      تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية ويتطلب طرق استخدام / التخلص المناسبة.
    11. جهاز طرد مركزي فائق عند 70000 × جم لمدة 40 دقيقة (أو الوقت اللازم لامتصاص الرواسب بالكامل) عند 25 درجة مئوية لإزالة أزيد الصوديوم.
    12. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من 2٪ SDS 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5.
    13. تغلي لمدة ساعة واحدة في قدر بخاري أو قارورة مستديرة القاع مع مكثف مبرد بالماء (القسم 1.2.2).
      ملاحظة: تزيل خطوة الغليان الثانية SDS جميع البروتينات والملوثات المتبقية من الكيس.
    14. كرر غسل sacculi (القسم 1.2.6) مع ~ 50 مل من الماء المقطر المزدوج بدرجة حرارة الغرفة (ddH2O) حتى يصبح تركيز SDS ~ 0.001٪.
    15. أعد تعليق الحبيبات بكمية كافية من ddH2O لتعليق الكيس ، وكذلك غسل الحاوية (على سبيل المثال ، 25 مل) وتجميدها طوال الليل عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يختلف الحجم حيث سيتم تجفيف العينة بالتجميد في الخطوة التالية ، على الرغم من أن الأحجام الأصغر تتطلب وقتا أقل للتجميد.
    16. في اليوم التالي ، قم بتجفيف التعليق وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
    17. قياس كمية الكيس المجفف بالتجميد التي تم الحصول عليها على ميزان تحليلي.
    18. خفف الكيس في ddH2O إلى 10 مجم / مل وصوتنة لفترة وجيزة لتفتيت الكتل قبل إجراء مزيد من التحليل.
  3. القياس الكمي للببتيدوغليكان المنقى
    1. حدد كمية الكيس المنقى من القسم 1.2.18 لضمان معادلة بيانات مواصفات الكتلة أثناء التحليل التفاضلي (القسم 3.2). اتبع المنهجية التفصيلية الموضحة في المرجع15.
      ملاحظة: يتم تقسيم الساكولي المنقى (القسم 1.2.18) إلى مكونات فردية من السكر والأحماض الأمينية عن طريق التحلل المائي للحمض. يتم فصل المكونات الفردية وقياسها كميا بواسطة كروماتوغرافيا تبادل الأنيون باستخدام الكشف النبضي الأمبيرومتري. بالنظر إلى بنية PG (الشكل 1) ، تتكون الببتيدات الموروببتيدات الفردية من MurNAc واحد وبقايا GlcNAc واحدة. لذلك ، فإن تحديد تركيز أي من البقايا يمثل كمية الببتيدات 1: 1 داخل العينة. يفضل MurNAc بسبب فصل الذروة النظيف عن مكونات PG الأخرى أثناء الكروماتوغرافيا16.

2. الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي

  1. تحضير الببتيدات الموروببتيدات لقياس الطيف الكتلي
    1. تكملة 800 ميكروغرام من ساكولي المنقى مع 100 ميكروغرام / مل موتانوليسين ، 100 مللي متر أسيتات الأمونيوم درجة الحموضة 5.5 ، و 50 مليمتر كلوريد المغنيسيوم في تفاعل 100 ميكرولتر.
    2. هضم في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. أضف حجم 1: 1 0.5 M بورات عازلة درجة الحموضة 9.0 وتكملة مع ~ 10 ملغ / مل بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4).
      ملاحظة: سيؤدي دوران السكريات الحلقية بين الأشكال α و β الشاذة إلى تكوينات ذروة متعددة أثناء فصل الكروماتوغرافيا السائلة للببتيدات الموروببتيدات. العلاج مع NaBH4 يزيل التحويل بين الشكلين عن طريق اختزال MurNAc إلى موراميتول11. لا يقلل العلاج من 1،6-anhydro MurNAc أو 1،4 بقايا السكر المرتبطة به.
      تنبيه: ينتج عن تفاعل NaBH4 كميات صغيرة من غاز الهيدروجين. سيخلق تفاعل NaBH4 فقاعات ويجب إبقاء أنابيب الميكروفوج مفتوحة للسماح للغاز بالهروب.
    4. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 20-30 دقيقة.
    5. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لتسوية العينة في أنبوب microfuge وإزالة الفقاعات.
    6. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى <4.0 باستخدام حمض الفوسفوريك 1: 5 ، المضاف بزيادات قدرها 5 ميكرولتر. اختبار درجة الحموضة باستخدام شرائط اختبار درجة الحموضة عباد الشمس.
    7. أجهزة الطرد المركزي في ~ 17000 × ز لمدة 1 دقيقة لترسب أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية.
    8. تصفية باستخدام مرشحات الطرد المركزي الدقيقة 0.2 ميكرومتر.
    9. يتم طرد العينات بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 30000 × جم قبل الحقن في LC-MS لضمان عدم حقن أي جسيمات في مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. إعداد LC-MS
    1. قم بتوصيل عمود جسيمات C18 مسامي سطحيا (100 مم × 2.1 مم ، حجم المسام <3 ميكرومتر) بمطياف الكتلة رباعي الأقطاب لوقت الرحلة (QTOF) بدقة كشف m / z بأربع نقاط عشرية كحد أدنى.
    2. إجراء فصل الكروماتوغرافيا السائلة من muropeptides
      ملاحظة: يجب تشغيل كل ثلاثية بيولوجية (القسم 1.1.1) من خلال LC-MS (القسم 2.2.2 إلى 2.2.3) ثلاث مرات (ثلاث نسخ تقنية). لذلك ، سيكون لكل حالة تم اختبارها إجمالي تسعة ملفات بيانات LC-MS. تم الحصول على البيانات باستخدام البرامج المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، ينبغي اختيار برامج الاستحواذ بناء على آلية MS. يمثل ما يلي دليلا لإعداد MS مع معلمات محددة لتشغيل هذا البروتوكول. للحصول على وصف تفصيلي ، يرجى الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة.
      1. للفصل الكروماتوغرافي ، قم بإعداد المذيبات التالية 0.1٪ حمض الفورميك (A) والأسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك (B).
      2. قم بإعداد طريقة للفصل الكروماتوجرافي باستخدام المعلمات التالية.
      3. اضبط معدل التدفق على 0.4 مل / دقيقة.
      4. شرط العمود لمدة 10 دقائق عند 2٪ B (~ 24 حجم عمود).
      5. باستخدام جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي ، قم بحقن 10 ميكرولتر من العينة من القسم 2.1.9.
        ملاحظة: قم بتشغيل عينة أولية واحدة من خلال بروتوكول LC-MS قبل بدء جمع البيانات. لا يتم استخدام هذا التشغيل للبيانات ولكن لزيادة قابلية استنساخ وقت الاستبقاء لجميع عمليات التشغيل اللاحقة. ويلزم استنساخ زمن الاستبقاء أثناء المعالجة الطيفية (القسم 1.3) من أجل التحديد الدقيق لقمم نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z ) وتجميعها.
      6. افصل الببتيدات باستخدام 2٪ B لمدة 5 دقائق (~ 12 حجم عمود) ، ثم زيادتها إلى 15٪ B خلال 13 دقيقة (~ 30 حجم عمود) ، وزيادتها إلى 50٪ B على مدى 10 دقائق (~ 24 حجم عمود) ، وأخيرا زيادتها إلى 98٪ B على مدى 2 دقيقة (~ 5 أحجام أعمدة).
        ملاحظة: تخلص (أرسل إلى النفايات) أول 2 دقيقة وآخر 5 دقائق من التدرج.
      7. انتهي بغسل العمود بنسبة 98٪ B لمدة 6 دقائق (~ 14 حجم عمود) وإعادة التوازن لمدة 20 دقيقة (~ 47 حجم عمود).
    3. إجراء الكشف عن قياس الطيف الكتلي للببتيدات الموروببتيدات
      1. قم بمعايرة محور الكتلة في الوضع الإيجابي باستخدام مزيج ضبط في الأسيتونيتريل يحتوي على معايير الكتلة المرجعية LC-MS باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمرض التصلب العصبي المتعدد.
        ملاحظة: يتم ضبط MS قبل بداية عمليات التشغيل الكروماتوغرافية (القسم 2.2.2.1).
      2. قم بإعداد طريقة للحصول على بيانات MS باستخدام المعلمات التالية.
        ملاحظة: تجمع بيانات MS وMS/MS (الأقسام 2-2-3-2 إلى 2-2-3-6) بالتزامن مع الفصل الكروماتوغرافي للببتيدات الموروببتيدات (القسمان 2-2-2-4 و2-2-2-5). كل من المعلمات الكروماتوغرافية و MS (الأقسام 2.2.2.2 و 2.2.3.2) هي طريقة واحدة تتم إضافتها أثناء إعداد قائمة عمل لتشغيل عينات متعددة بالتسلسل.
      3. اضبط جهد الشعيرات الدموية بالرش الكهربائي على 4.0 كيلو فولت ودرجة حرارة غاز التجفيف عند 350 درجة مئوية بمعدل تدفق 13 لتر / دقيقة.
        ملاحظة: يجب استخدام النيتروجين (نقاء >99٪) كغاز للرذاذ والتجفيف والاصطدام أثناء جمع جميع بيانات قياس الطيف الكتلي.
      4. اضبط ضغط البخاخات على 40 رطل / بوصة مربعة واضبط المجزأ على 150 فولت.
      5. اضبط الفوهة والكاشطة وجهد التردد اللاسلكي ثماني الأضلاع على 1000 فولت و 65 فولت و 750 فولت على التوالي.
      6. اضبط نطاق المسح على 300-2000 م / z في وضع الأيونات الموجبة 4 جيجاهرتز (النطاق الديناميكي الموسع).
      7. تعيين جمع البيانات باستخدام اكتساب MS / MS المعتمد على البيانات مع معدل مسح MS و MS / MS يبلغ 1 أطياف / ثانية. حدد خمس كتل سلائف لكل دورة ، بترتيب شحنة مفردة ومضاعفة وثلاثية.
      8. اضبط طاقات تصادم تجزئة MS / MS على 15 و 20 و 30 فولت.

3. التحليل التفاضلي لوفرة الموروببتيد

  1. المعالجة الطيفية للكروماتوجرام LC-MS
    ملاحظة: تم إجراء استخراج الميزة العودية باستخدام البرامج المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يمكن استخدام برامج استخراج الميزات الأخرى. ومع ذلك ، قد تتطلب البرامج الأخرى معالجة بيانات يدوية إضافية لإنجاز الاستخراج العودي القوي للغاية. تستخدم البرامج المختلفة ميزة المصطلحات والكيان والمركب بالتبادل تقريبا. بالنسبة لتحليل PG ، تشير جميعها إلى تحديد مخطط كروماتوجرام الأيونات LC-MS لممثل muropeptide فردي (على سبيل المثال ، الشكل 3). أثناء المعالجة الطيفية (القسم 3.1) ، تمثل الميزة القمم المتعددة m / z التي تشمل الأنواع الأيونات المتعددة المحتملة ل muropeptide واحد والتي يتم تجميعها معا تحت تسمية مركب واحد.
    1. ضمن ملف، بدء مشروع جديد.
    2. أضف ملفات بيانات LC-MS QTOF وقم بتعيين ملفات بيانات فردية لحالة / مجموعة تجريبية ، على سبيل المثال ، حالتان مختلفتان للنمو.
    3. قم بتشغيل معالج معالجة البيانات استخراج الميزة العودية دفعة (جزيئات صغيرة / ببتيدات) وتعيين مرشحات معالجة البيانات لمطابقة معلمات ظروف LC-MS والأجهزة لتحديد وتجميع والتحقق بدقة من قمم m / z التي تمثل muropeptides الفردية. من الكروماتوجرام ، افحص انحراف وقت الاحتفاظ وتباين m / z من القمم المماثلة المعروفة لتعيين معلمات المرشح الأولية.
      ملاحظة: يستخدم استخراج المعالم العودية خوارزمية استخراج ميزة جزيئية أولية غير مستهدفة لتحديد ومحاذاة ميزات الكروماتوجرام (قمم m / z ) عبر جميع ملفات البيانات. بمجرد إنشائها ، يتم استخدام هذه الميزات لإعادة تقييم ملفات البيانات الأصلية (المتكررة) باستخدام خوارزمية استخراج الميزة الجزيئية المستهدفة لتحسين موثوقية ودقة الميزات المحددة. من الأفضل تعيين الاستخراج الأولي غير المستهدف مع نافذة كشف ضيقة واستخدام معلمات الكشف الأوسع للاستخراج العودي لتحديد القمم في جميع ملفات البيانات التي قد تكون مفقودة في الاستخراج الأولي. قد يستغرق تشغيل استخراج الميزة العودية ساعات حتى يكتمل اعتمادا على عدد العينات وتعقيد البيانات وأجهزة الكمبيوتر الموجودة
    4. راجع نتائج استخراج المعالم. إذا فشل عدد كبير من الميزات في المحاذاة في مجموعة، فاضبط معلمات التصفية العودية لتوسيع/تقييد نافذة الكشف كما هو مطلوب. لتحقيق ذلك ، افحص مخطط الكروماتوجرام وملف تعريف النظائر لكل ميزة مستخرجة لضمان إنجاز اكتشاف الميزة بشكل مشابه عبر جميع ملفات البيانات. أيضا، لكل معلم محدد داخل ملف بيانات، افحص النتيجة وأي تحذيرات وما إذا كانت الميزة قد اجتازت معلمات التصفية المختارة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر للحفاظ على نوافذ الكشف ضيقة بما فيه الكفاية بحيث لا يتم تجميع الميزات المميزة معا عن طريق الخطأ. غالبا ما يتم ملاحظة ذلك من خلال ملفات تعريف النظائر المتباينة بين ملفات البيانات ، أو الاختلافات الكبيرة في وقت الاستبقاء . على العكس من ذلك ، إذا كانت هناك ميزات متعددة ذات أوقات m / z وأوقات احتفاظ متشابهة ، فمن المحتمل أن تكون معلمات المرشح صارمة للغاية مما أدى إلى تقسيم ذروة MS واحدة إلى ميزتين. لذلك ، قم بتشغيل استخراج الميزات (القسم 3.1.3) مرة أخرى مع معلمات تصفية وقت الاستبقاء المعدلة للسماح بتجميع أفضل لهذه الميزات. سيشير تصور قمم الوفرة الأقل إلى ما إذا كانت المرشحات المستخدمة (القسم 3.1.3) قد حددت بدقة القمم فوق ضوضاء الخلفية. إذا ظهرت قمم الوفرة الأقل مشابهة للخلفية، فأعد تشغيل استخراج الميزة باستخدام معلمات تصفية الخلفية الجديدة.
    5. تصدير البيانات كملف تبادل مركب (.cef) (تنسيق متوافق مع البرنامج الإحصائي) ، أو ملف منفصل عن عمود (.csv) يحتوي على الكتلة ووقت الاحتفاظ ووفرة كل ميزة لكل عينة.
  2. التحليل التفاضلي للخصائص الطيفية
    ملاحظة: أجري التحليل التفاضلي باستخدام برامجيات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يمكن استخدام برامج المعلوماتية الحيوية الأخرى.
    1. افتح البرنامج وعند توجيه بدء مشروع جديد.
    2. اتبع تعليمات استيراد البيانات وتحليلها. أثناء استيراد البيانات، قم بتحميل ميزة الملفات المستخرجة (القسم 3.1). أثناء تحليل البيانات، اختر تغيير الأهمية والطي للتحليل التفاضلي وحدد البيانات الأساسية إلى متوسط الكثافة عبر جميع ملفات البيانات. لا تقم بتعيين أي عوامل تصفية بيانات (إذا تم ذلك في خطوة معالجة الأطياف السابقة (القسم 3.1)) لأن تطبيق المرشحات مرة أخرى من شأنه أن ينفي استخراج الميزة العودية القوية. ومع ذلك ، على غرار استخراج الميزات ، يجب محاذاة التحليل التفاضلي بناء على الكتلة (m / z) ووقت الاحتفاظ بسبب الانجراف في جمع بيانات LC-MS. استخدم المعلمات المحددة في استخراج الميزة (القسم 3.1).
      ملاحظة: قم بالتطبيع بين ملفات البيانات باستخدام كمية muropeptide (القسم 1.3) للتأكد من أن الاختلافات ناتجة عن المعلمات التجريبية وليس بسبب الاختلافات في تنقية sacculi (القسم 1.2). استخدم خيار القشارة الخارجية لضبط كل ملف بيانات للاختلافات في تركيز MurNAc للعينة.
    3. بمجرد اكتمال التحليل ، افحص التحليلات الرسومية والإحصائية الناتجة لتحديد muropeptides التي تظهر تغيرا كبيرا في الوفرة بين الظروف التجريبية المختبرة.
    4. ضمن متصفح المشروع ، انقر بزر الماوس الأيمن على التحليلات المختلفة واختر خيار تصدير لحفظ تفاصيل الميزة كملف بيانات مفصول بعمود (.csv) يحتوي على m / z ووقت الاحتفاظ وقيم الكثافة الأولية والمعيارية والقيمة p و FDR وتغييرات الطي لكل ميزة. يجب حفظ تحليلات متعددة للحصول على جميع البيانات ذات الصلة.
    5. تصدير ملف .csv ثان يحتوي فقط على muropeptides التي تجاوزت التحليلات الإحصائية بما في ذلك القيمة p <0.05 وتغيير الطي >2.
  3. شرح هوية muropeptide إلى الميزات الطيفية
    ملاحظة: يجب تعيين بنية muropeptide متوقعة لكل معلم محدد بناء على m / z ويتم تأكيد هذا التعليق التوضيحي من خلال فحص تجزئة MS / MS. بعد تأكيد التعليقات التوضيحية ، قد يكون من الضروري إجراء التحليل التفاضلي وتحسينه (القسم 3.2).
    1. ضمن برنامج التحليل التفاضلي ، ضمن تفسير النتائج ، حدد متصفح الهوية. أضف مكتبة من هياكل الموروببتيد المتوقعة وحدد معلمات مماثلة كما هو مستخدم سابقا (القسم 3.1.3). سيؤدي ذلك إلى إنتاج تعليق توضيحي متوقع ل muropeptide لكل ميزة محددة. يمكن إنتاج مكتبة من هياكل muropeptide باستخدام m / z لهياكل muropeptide المتوقعة وبرامج قاعدة بيانات MS (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، يمكن العثور على مكتبة m / z من >6000 muropeptides المحتملة في المرجع12.
    2. حدد التعليق التوضيحي للموروببتيد المتوقع بناء على درجة المطابقة والأهمية البيولوجية للموروببتيد المتوقع ، أي اختر الموروببتيد الأكثر احتمالا ليكون موجودا في العينة البيولوجية.
    3. قم بتأكيد التعليق التوضيحي المتوقع ل muropeptide يدويا من خلال مقارنة قمم m / z لمخطط كروماتوجرام MS / MS ب m / z المتوقع لجميع الأجزاء المحتملة لهيكل muropeptide معروف (على سبيل المثال ، الشكل 4).
      1. عرض بيانات MS و MS / MS باستخدام برنامج عرض الكروماتوجرام (انظر جدول المواد ، الشكل 4).
      2. ارسم بنية muropeptide المتوقعة باستخدام محرر جزيئي (برنامج رسم التركيب الكيميائي) (انظر جدول المواد ، الشكل 4 ، أقحم رمادي). استخدم أداة تجزئة الكتلة لإظهار m / z لشظايا MS عند كسر كل رابطة إما بشكل فردي أو مجتمعة.
        ملاحظة: اعتمادا على طاقة التجزئة المستخدمة في MS / MS ، يمكن أن يحدث التجزئة عند أي رابطة في بنية muropeptide . ومع ذلك ، فإن بعض الروابط مجزأة بسهولة / بشكل متكرر عند مستويات طاقة أقل. على سبيل المثال ، يحدث التجزئة في السلسلة الجانبية للببتيد في أغلب الأحيان عند رابطة الأميد بين الأحماض الأمينية. أثناء تقييم التجزئة ، من المهم ملاحظة أن بقايا GlcNAc مجزأة بسهولة من الببتيد الموروبيتد. لذلك ، يجب تقييم تجزئة بنية muropeptide المعروفة مع وبدون GlcNAc. نظرا لتجزئة GlcNAc في المصدر ، قد تمثل العديد من الميزات المستخرجة في المعالجة الطيفية (القسم 3.1) بنية muropeptide واحدة. إذا وجدت ، يجب دمج هذه الميزات وإعادة تقييم التحليل التفاضلي.
      3. قارن جميع الأجزاء المحتملة لهيكل muropeptide الذي تم تحديده (القسم 3.3.3.2) بمخطط كروماتوجرام MS / MS (القسم 3.3.3.1). لتأكيد التعليق التوضيحي muropeptide ، يجب العثور على قمم m / z لأجزاء متعددة في مخطط كروماتوجرام MS / MS مع نافذة محاذاة m / z ضئيلة للغاية (الشكل 4).
      4. من أجل توضيح هوية muropeptide في حالة تجزئة MS / MS الغامضة ، كرر الأقسام 2.2.2 إلى 2.2.3 مع العينات (القسم 2.1.9) للحصول على بيانات MS / MS إضافية تتضمن قائمة سلائف مفضلة من m / z ووقت الاحتفاظ مع طاقات تصادم تجزئة MS / MS إضافية.
    4. بالنسبة للكيانات المشتركة التي تم التعليق عليها على أنها نفس muropeptide ، قم بتشغيل التحليل التفاضلي (القسم 3.2.2) مرة أخرى ودمج المعالم المستخرجة.
  4. تقييم التغيرات العالمية في تعديلات الموروببتيد
    1. قم بتحرير ملف .csv (القسم 3.2.4) من muropeptides ذات الدلالة الإحصائية العالية للتغيير لتضمين عمود واحد لكل تعديل muropeptide . املأ هذا العمود بتسمية لكل موروببتيد مشروح (القسم 3.3) (على سبيل المثال ، الأسيتيل مقابل de-N-acetylated GlcNAc أو MurNAc).
    2. قم بتحميل ملف .csv المعدل إلى Perseus22,23. قم باستيراد قيم الكثافة التي تمت تسويتها إلى مربع الاستيراد الرئيسي وقم باستيراد تعيين التعديل إلى مربع الاستيراد الفئوي.
    3. ضمن التعليقات التوضيحية للصفوف ، انقر فوق التعليقات التوضيحية بشكل قاطع على الصفوف وأضف ملفات بيانات إلى كل معلمة تجريبية.
    4. ضمن الاختبار ، انقر فوق اختبارين نموذجيين لإجراء اختبار t للطالب (القيمة p < 0.05 ، FDR < 0.05 ، s0 = 1).
    5. انقر فوق 1D لإجراء تعليق توضيحي 1D22,23. يشير التعليق التوضيحي 1D FDR < 0.05 إلى تغيير كبير في الوفرة لتعديل muropeptide بين المعلمات التجريبية المختبرة. سيؤدي تعيين قيمة العتبة (s0) = 1 إلى عرض درجات FDR للتعليق التوضيحي 1D لجميع muropeptides.
    6. ضمن برنامج الرسوم البيانية (انظر جدول المواد) ، قم بإنتاج خريطة حرارية لتغيير أضعاف الوفرة لكل تعديل muropeptide وإظهار درجة التعليق التوضيحي 1D لإثبات الأهمية (الشكل 5B). يمكن إنتاج تغيير الطي لكل تعديل muropeptide في Microsoft Excel باستخدام الشدة الأولية لجميع muropeptides الفردية التي تحتوي على التعديل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أدت زيادة حساسية الكشف عن آلات MS إلى جانب برنامج التعرف على الذروة عالي الطاقة إلى تحسين القدرة على عزل ومراقبة وتحليل تركيبات المواد للعينات المعقدة بتفاصيل دقيقة للغاية. باستخدام هذه التطورات التكنولوجية ، بدأت الدراسات الحديثة حول تكوين الببتيدوغليكان في استخدام تقنيات استخراج ميزة LC-MS الآلية12،13،14،24 مقارنة بالمنهجية القديمة القائمة على HPLC 11،25،26،27،28،29،30،31 . على الرغم من وجود العديد من حزم برامج استخراج الميزات العامة المتاحة ، إلا أن البرامج التجارية التي تستخدم استخراج الميزات العودية سريعة وقوية للغاية من خلال تحديد ودمج جميع الشحنات والنظائر والإصدارات المقربة لكل muropeptide الموجودة في مجموعة بيانات LC-MS (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم أوقات الاستبقاء الأولية، والأنماط النظيرية للسمات المستخرجة لإعادة تقييم (تكرار) مجموعة البيانات لضمان التحديد الدقيق لكل سمة في جميع ملفات البيانات. لذلك ، تساعد الخوارزمية العودية في التحقق من صحة وزيادة الثقة في تحديد الذروة. لا تقوم معظم برامج استخراج الميزات العامة بتجميع الشحنات / النظائر ، إلخ. وسيتطلب ذلك كخطوة يدوية إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون البرامج العامة أقل قوة حيث يتم استخراج الميزات بشكل منفصل داخل كل ملف بيانات وليس كمجموعة بيانات كاملة ، والتي تعد جزءا من الخوارزمية العودية.

تم استخدام بروتوكول الببتيدوغليكوميك المقدم هنا مؤخرا لفحص التغيرات التركيبية ل PG بين حالتين للنمو الفسيولوجي ، وهما العوالق السباحة الحرة والأغشية الحيوية المجتمعيةالثابتة 12. باستخدام QTOF MS عالي الحساسية إلى جانب استخراج الميزة العودية ، تم التعرف على 160 من الببتيدات الموروبية المتميزة وتتبعها. يمثل هذا ثمانية أضعاف عدد الببتيدات الموروبيبتيدات التي تم تحديدها في هذا الكائن سابقا29،32 ، وأكثر من ضعف الببتيدات الموروبيبتيدات التي تم تحديدها باستخدام منهجيات أخرى في الكائنات الحية الأخرى10،14،24.

يتم تسهيل ربط كل قمة m / z المستخرجة من بيانات MS مع muropeptide معين عن طريق الإحالة المرجعية مع قاعدة بيانات لهياكل muropeptide المعروفة والمتوقعة. تتم مقارنة مخطط كروماتوجرام MS / MS للتجزئة (الشكل 4) لكل ميزة مستخرجة بملف تعريف التجزئة (الشكل 4 ، أقحم رمادي) ل muropeptide المقترح باستخدام قاعدة البيانات.

يمكن عرض بيانات Peptidoglycomic بعدة طرق مختلفة اعتمادا على الإعداد التجريبي والأسئلة المطروحة. يمكن أن يشمل هذا التحليل البياني تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ، ومخططات التشتت ، ومخططات البراكين ، والخرائط الحرارية ، وتحليل التجميع الهرمي. على سبيل المثال ، تسلط مخططات البراكين الضوء على الببتيدات الموروبية التي تظهر حجما كبيرا ذا دلالة إحصائية من تغير الوفرة بين الظروف المختبرة (الشكل 5 أ). يمكن فحص هذه الببتيدات الموروببتيدات المختارة التي تمثل تغيرات كبيرة في الوفرة بين الظروف المختبرة لمزيد من التعديلات على الموروببتيد. يمكن أن تشمل هذه التعديلات وجود بدائل الأحماض الأمينية ، أو تغييرات الأستيل ، أو وجود نشاط الأميداز. عند فحصها معا ، يمكن فحص العديد من الببتيدات الموروببتيدات التي تمتلك نفس التعديل بحثا عن اتجاه نحو حالة تجريبية واحدة (الشكل 5 أ - النقاط المميزة باللون الأخضر) وتقييم المجموعة بأكملها للأهمية (الشكل 5 ب). يمكن أن يشير تتبع تعديل muropeptide بهذه الطريقة إلى نشاط إنزيمي معين يتأثر بالمعلمة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تشير القيم المتطرفة من هذا الاتجاه إلى نشاط إنزيمي له خصوصية معينة أو وظيفة بيولوجية معينة (الشكل 5 أ - النقاط المميزة باللون البرتقالي).

Figure 1
الشكل 1: مثال على تركيب الببتيدوجليكان سالب الجرام النموذجي. (أ) في البكتيريا سالبة الجرام، يقع الببتيدوغليكان في المحيط بين الأغشية الداخلية والخارجية. (ب) يتكون الموروببتيد الواحد من جلوكوزامين N-acetyl المرتبط ب β-1،4 (GlcNAc) (أزرق) وحمض موراميك N-acetyl (MurNAc) (أرجواني) مع سلسلة جانبية ببتيد ملحقة (برتقالية). يمكن ربط السلسلة الجانبية للببتيد بالسلسلة الجانبية للموروببتيد المجاور لإنتاج الببتيدوغليكان الناضج الشبيه بالشبكة (A). يتضمن التنقية عزل الببتيدوغليكان من الخلية بأكملها ككيس حيث تم تجريد جميع المواد الخلوية الأخرى. ج: صورة مجهرية إلكترونية لكيس ببتيدوجليكان. وبالمقارنة ، يمكن أن يتكون PG إيجابي الجرام من مجموعة أكبر من الاختلافات في البنية وهو جزء من التصنيف التصنيفي إيجابي الجرام33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: سير عمل Peptidoglycomics. إعداد العينة. الخطوة الأولى ، تنمو والخلايا البكتيرية بيليه (القسم 1.1). الخطوة 2 ، تنقية الببتيدوغليكان ساكولي بنسبة 4 ٪ SDS تغلي (القسم 1.2). الحصول على البيانات. الخطوة 3 ، الهضم الأنزيمي للساكولي لإنتاج الببتيدات عن طريق كسر الارتباط β-1،4 بين N-acetylglucosamine (GlcNAc) وحمض N-acetylmuramic (MurNAc) من العمود الفقري الببتيدوغليكان (القسم 2.1). الخطوة 4 ، تحليل شدة الموروببتيد من خلال LC-MS / MS (القسم 2.2). تحليل البيانات. الخطوة 5 ، يحدد استخراج الميزة العودية ويجمع جميع الشحنات والمواد المضافة والنظائر المرتبطة بببتيد muropeptide واحد (القسم 3.1). الخطوة 6 ، تحديد الببتيدات الموروبية من خلال مقارنة التجزئة المتوقعة مع كروماتوجرام MS / MS (القسم 3.3). الخطوة 7 ، التحليل التفاضلي المعلوماتي الحيوي (القسم 3.2) مقارنة التغيرات التركيبية الببتيدوغليكان بين المعلمات التجريبية المختلفة. الخطوة 8 ، فحص التغير العالمي في تعديلات muropeptide ضمن المعلمات التجريبية المختلفة باستخدام التعليق التوضيحي 1D (القسم 3.4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على استخراج ميزة عودية. بالنسبة للموروببتيد الذي يمثل سلسلة جانبية ببتيدية من الألانين (A) ، فإن iso-ᴅ-glutamate (E) ، وحمض الميزو ديامينوبيميليك (m) ، والألانين (A) مرتبط ب AE m A للسلسلة الجانبية muropeptide المجاورة (1864.8 m / z). تتضمن الميزة المستخرجة ل 1864.8 م / ض الشحنات (+1 و +2 و +3) ، والمواد المضافة (مثل الصوديوم والبوتاسيوم) ، وفقدان GlcNAc (1 أو 2 GlcNAc) ، وقمم نظيرية متعددة لكل شكل (على سبيل المثال ، أقحم مكبر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تجزئة الموروببتيد وتحديد هويته. للتعليق التوضيحي ، يتم إعطاء كل ذروة m / z (ميزة) مستخرجة من مخطط كروماتوجرام MS بنية muropeptide مقترحة بناء على التشابه مع مكتبة muropeptide . لتأكيد هذا الهيكل المقترح ، يتم إنشاء شظايا MS / MS المتوقعة باستخدام برنامج رسم كيميائي (أقحم رمادي). تتم مقارنة هذا التجزئة المتوقعة بكروماتوجرام MS / MS. عندما تتطابق الأجزاء المتوقعة (أقحم رمادي) مع مخطط كروماتوجرام MS / MS ، يتم تأكيد بنية muropeptide المقترحة. تم تعديل الرقم من المرجع12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التحليل التفاضلي لتركيب الببتيدوغليكان. (أ) مخطط بركان لتغير الطية ودلالة إحصائية للتغيرات في شدة الموروببتيد بين الببتيدوغليكان المنقى من P. aeruginosa المزروع إما كعوالق سباحة حرة أو مستنبت بيوفيلم ثابت. يتم تسليط الضوء على جميع الببتيدات التي لها تعديل يمثل تغييرا في ترتيب الأحماض الأمينية النموذجي داخل السلسلة الجانبية للببتيد. يتم تمييز الببتيدات المستبدلة بالأحماض الأمينية التي أظهرت اتجاها نحو انخفاض الوفرة في الببتيدوغليكان المشتق من الأغشية الحيوية باللون الأخضر. تم تمييز الأحماض الأمينية التي حلت محل الببتيدات التي كانت متطرفة لهذا الاتجاه وأظهرت وفرة متزايدة في الببتيدوغليكان المشتق من الأغشية الحيوية باللون البرتقالي. (ب) خريطة حرارية لتغير الطيات العالمية في وفرة جميع الأحماض الأمينية المستبدلة ببتيدات الموروببتيدات مع زيادة الوفرة (البرتقالية) وانخفاض الوفرة (الخضراء) في الأغشية الحيوية. تم إعادة تجميع هذه الببتيدات الموروببتيدات وتقييمها لمعرفة ما إذا كان استبدال الأحماض الأمينية قد حدث على المونومرات أو الثنائيات المتشابكة أو ما إذا كان قد تم استبدال الرابع (AE m +) أو الخامس (AE m A +) أو كلا الأحماض الأمينية (AEm ++). تم تقييم أهمية كل مجموعة من الببتيدات muropeptides من خلال التعليق التوضيحي 1D مع FDR < 0.05 للأهمية ويتم عرض درجة 1D المرتبطة بها. لا يمكن إجراء التعليق التوضيحي 1D إلا على أكثر من 2 muropeptides (على سبيل المثال ، تم العثور على استبدال AEm ++ فقط على اثنين من muropeptides). لذلك ، في هذه الحالة ، يجب فحص الأهمية بالنسبة للببتيدات الموروبية الفردية وليس على المجموعة. تم تعديل الرقم من المرجع12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة لتنقية الببتيدوغليكان من الثقافات البكتيرية ، وعملية للكشف عن LC-MS وتحليل التركيب باستخدام تقنيات المعلوماتية الحيوية. هنا ، نركز على البكتيريا سالبة الجرام وستكون هناك حاجة إلى بعض التعديلات الطفيفة لتمكين تحليل البكتيريا إيجابية الجرام.

ظل إعداد muropeptides تقريبا كما هو منذ أن تم إنتاجه لأول مرة في ستينيات القرن العشرين9،11،15. بمجرد تنقيته ، يتم هضم sacculi (القسم 1.2.18) في muropeptides الفردية باستخدام إنزيم muramidase mutanolysin من Streptomyces globisporus. يستوعب Mutanolysin بنية PG عن طريق كسر الارتباط β-1،4-glycosidic الذي يطلق الببتيدات الموروببتيدات الفردية التي تتكون من ثنائي السكاريد GlcNAc-MurNAc مع سلسلة جانبية من الببتيد الملحق ويتضمن أي تعديلات أو روابط متقاطعة (الشكل 1).

كان أحد قيود المنهجية السابقة المستخدمة لدراسة تكوين PG هو التحديد اليدوي للببتيدات الموروببتيدات التي تستغرق وقتا طويلا. نظرا للتعقيد والصعوبة ، قد تكون أو لا تكون المواد المضافة و / أو الشحنات و / أو النظائر مدرجة في التحليل. بالإضافة إلى ذلك ، قصرت معظم الدراسات التحليل على أكثر الببتيدات وفرة ، وبالتالي أسهل في تنقيتها. لذلك ، بسبب الطبيعة المعقدة للمنهجية ، تم إجراء عدد قليل نسبيا من التحليلات التركيبية التفصيلية عالية المستوى PG. وقد استخدمت التحليلات من النوع "الأومي" التحسينات التكنولوجية الحديثة لإنتاج مجموعات بيانات LC-MS الكبيرة والمعقدة نسبيا وتحليلها إحصائيا من أجل نظرة عامة رفيعة المستوى على النظم البيولوجية. سيمكن تطبيق peptidoglycomics من تحليل تكوين PG بتفاصيل دقيقة للغاية.

ضمن peptidoglycomics ، يقلل استخراج الميزات العودية من عبء العمل اليدوي ويزيد من الدقة من خلال فحص جميع ملفات البيانات مرة واحدة. يتم استخدام خوارزمية استخراج الميزة العودية لتحديد ومحاذاة وتجميع الميزات الطيفية الفريدة (قمم m / z) عبر ملفات بيانات كروماتوغرافية متعددة LC-MS مما يجعل تحديد قمم muropeptide m / z آليا. تستخدم هذه الخوارزمية مطابقة الأنماط النظيرية التي تأخذ العديد من النظائر المحتملة ، والمواد القربانية الأيونية ، وحالات الشحن وتكثف القمم المتعددة m / z في مركب واحد (أو ميزة) تمثيلية ، والتي ستمثل في هذه الحالة muropeptide واحد (الشكل 3). يتم التحقق من مجموعة المعالم الطيفية من خلال مقارنة وقت الاستبقاء ، m / z ، ومطابقة النمط النظيري داخل كل ملف بيانات كروماتوغرافي لضمان استخراج قوي للميزة في مجموعة البيانات بأكملها. قد لا تتضمن خوارزميات العثور على الميزات العامة مطابقة النظائر أو محاذاة أو تجميع أو التحقق من قمم m / z عبر عينات متعددة وستتطلب معالجة بيانات يدوية إضافية لإنجاز استخراج هذه الميزة.

بمجرد تحديد الميزات ، تتعامل خوارزميات التحليل التفاضلي المعلوماتية الحيوية مع مجموعة البيانات الكبيرة جدا ككل ، مما يسمح بإجراء مقارنات وتفسيرات مفيدة من البيانات المعقدة. يعد استخدام هذه التحليلات الرسومية المعلوماتية الحيوية طريقة قوية لتصور وتفسير مجموعات البيانات الكبيرة لفحص الاتجاهات التي قد تشير إلى العمليات البيولوجية. في الآونة الأخيرة فقط تم استخدام هذه التحليلات الرسومية عالية القوة لفحص الببتيدوغليكان بتفصيل دقيق للغاية12. يقوم التحليل التفاضلي (القسم 3.2) بتقييم التغيرات في وفرة الببتيدات الموروببتيدات الفردية بين الظروف التجريبية المختلفة. ومع ذلك ، في سياق الخلايا البكتيرية الكاملة ، يمكن أن يؤدي نشاط الإنزيمات المعدلة ل PG إلى العديد من هياكل الموروببتيد المتميزة اعتمادا على خصوصية النشاط التحفيزي (أي أن إضافة مجموعة الأسيتيل على السكاريد الثنائي يمكن أن يكون مع أو بدون تعديل السلسلة الجانبية للببتيد). لذلك ، فإن تقييم تغيرات الوفرة العالمية لتعديل معين عبر جميع الببتيدات المشروحة الفردية سيعطي نظرة ثاقبة على النشاط الأنزيمي الذي يعمل على PG (الشكل 5) لذلك ، يتم استخدام التحليل التفاضلي للتحقيق في تغيرات وفرة الببتيدات الفردية ؛ في حين أن التعليق التوضيحي 1D يفحص تغييرات الوفرة لتعديل PG معين. يسمح التحليل التفاضلي للاقتران مع التعليق التوضيحي 1D بتقييم تكوين PG على مستوى muropeptide الفردي وأيضا كمؤشر للنشاط الأنزيمي PG الكلي.

أثناء التحليل التفاضلي ، من المهم ملاحظة أن PG يتكون من عدد قليل من الببتيدات الموروببتيدات الوفيرة للغاية والعديد من الببتيدات الموروببتيدات منخفضةالوفرة 12. لذلك ، فإن خط الأساس مهم جدا من أجل إزالة أي تحيز من الببتيدات عالية الوفرة خلال الخطوات اللاحقة للتحليل. أيضا ، نظرا لاختبارات t المتعددة التي تم إجراؤها ، يجب تطبيق تصحيح إحصائي لتقليل الإيجابيات الخاطئة. غالبا ما يكون الافتراضي هو معدل الاكتشاف الكاذب بنجاميني هوشبيرج (FDR)19. من الممكن إجراء تصحيحات أخرى مثل معدل الخطأ العائلي Bonferroni الأكثر تحفظا (FWER)20,21.

ضمن برنامج المعلوماتية الحيوية ، يتم أيضا تعيين بنية متوقعة لذروة m / z المحددة في استخراج الميزات. وتستفيد التحليلات الأخرى من النوع "الوميكي" (مثل التحليل البروتيني) من توافر قواعد بيانات مركبة كبيرة، تسمح بتحديد المركبة من خلال مطابقة أطياف التجزئة التنبؤية. حاليا ، لا توجد مكتبة تجزئة متوقعة من muropeptide ولا يزال تأكيد تحديد muropeptide خطوة يدوية. ومع ذلك ، مع تطور قواعد بيانات تجزئة الببتيدوغليكوميك وإتاحتها للجمهور ، ستصبح خطوة التحديد اليدوي هذه أكثر آلية ويمكن الوصول إليها من خلال إزالة أو تقليل القسمين 3.3.3 و 3.3.4 بشكل كبير.

في الإشريكية القولونية ، يتكون PG من ~ 3.5 × 106 muropeptides لكل خلية34. ضمن حدود الكشف عن QTOF MS ، حتى أقل الببتيدات muropeptides وفيرة لا تزال تمثل مئات النسخ من muropeptide واحد داخل الخلية12. لذلك ، فإن فهم التغييرات حتى في أقل الببتيدات الوفيرة قد يوفر رؤى مفيدة حول النشاط البيولوجي للإنزيمات المستهدفة ب PG داخل الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة جنيفر جيديس ماك أليستر والدكتور أنتوني كلارك على مساهماتهم في تحسين هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التشغيلية المقدمة من مركز القاهرة لحقوق الإنسان الممنوحة ل C.M.K (PJT 156111) و NSERC Alexander Graham Bell CGS D الممنوحة ل EMA تم إنشاء الأرقام في BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

التراجع، العدد 164، الببتيدوغليكان، الببتيدات الموروببتيدية، قياس الطيف الكتلي، استخراج المعالم، التحليل التفاضلي، المعلوماتية الحيوية، الببتيدوغليكوميكس
التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter