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Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

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DOI:

10.3791/61803

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21 de fevereiro de 2021

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1Department of Biomedicine, University Hospital Basel and University of Basel, 2Division for Hematology, University Hospital Basel and University of Basel, 3Department of Internal Medicine, Hematology and Oncology, University Hospital Tübingen

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Resumo

Dentro do mesmo paciente, a ausência de ligantes NKG2D (NKG2DL) expressão superficial foi demonstrada para distinguir subpopulações leucêmicas com propriedades de células-tronco (chamadas células-tronco leucêmicas, LSCs) de células leucêmicas de contrapartida mais diferenciadas que não possuem potencial de iniciação da doença, embora carreguem mutações genéticas específicas de leucemia semelhantes. NKG2DL são bioquimicamente altamente diversos mhc classe I-like auto-moléculas. Células saudáveis em condições homeostáticas geralmente não expressam NKG2DL na superfície celular. Em vez disso, a expressão desses ligantes é induzida após a exposição ao estresse celular (por exemplo, transformação oncogênica ou estímulos infecciosos) para desencadear a eliminação de células danificadas através de lise através de células imunes expressas por receptores NKG2D, como células assassinas naturais (NK). Curiosamente, a expressão da superfície NKG2DL é seletivamente suprimida em subpopulações LSC, permitindo que essas células evitem a vigilância imunológica mediada por NKG2D. Aqui, apresentamos uma análise lado a lado de dois métodos diferentes de citometria de fluxo que permitem a investigação da expressão da superfície NKG2DL em células cancerosas, ou seja, um método que envolve reconhecimento pan-ligante e um método envolvendo coloração com múltiplos anticorpos contra ligantes únicos. Estes métodos podem ser usados para separar subpopulações celulares negativas nkg2DL viáveis com propriedades de células-tronco de câncer putativos de NKG2DL positivo não-LSC.

Introdução

As células NK são efeitos importantes do sistema imunológico inato que podem reconhecer e eliminar células malignas ou células saudáveis estressadas (por exemplo, por uma infecção viral) sem estimulação prévia de antígeno1. Esse processo é fortemente regulado através de um complexo repertório de receptores ativadores — como receptores de citotoxicidade natural (NCRs), NKG2D e CD16 — e receptores inibitórios que são em grande parte representados por receptores semelhantes à imunoglobulina assassina (KIRs)2. A ligação de KIRs com moléculas de antígeno leucócito humano (HLA) em células somáticas garante o auto-reconhecimento e transmite tolerância celular NK. Por outro lado, a ausência de auto-reconhecimento e o aumento da vinculação de receptores ativados aos seus ligantes nas células-alvo desencadeiam a liberação de grânulos citotóxicos que levam à citotoxicidade mediada por células NK1. Finalmente, as células NK podem exercer citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) vinculando-se ao receptor de ativação CD16 a alvos que expressam a porção fc de Ig (RF)2. Além da citotoxicidade direta, as células NK também podem desencadear a liberação de citocinas conectando o inato com o sistema imunológico adaptativo3.

NKG2D é um receptor de ativação importante expresso em NK, NKT, γδ T, e células T CD8+4 que permitem que tais células imunes citotóxicas reconheçam e lise NKG2D ligand (NKG2DL) expressem células-alvo. Células saudáveis geralmente não expressam NKG2DL. Em vez disso, a expressão NKG2DL é regulada em células malignas ou infectadas por vírus para torná-las favoráveis à liberação imunológica5.

A família humana NKG2DL compreende oito moléculas conhecidas entre as quais as duas moléculas relacionadas à cadeia MHC I A e B (MICA e MICB6) e as proteínas de ligação citomegalovírus UL16 1-6 (ULBP1-67). A expressão de NKG2DL é regulada nos níveis transcricional, pós-transcricional, bem como nos níveis pós-translacional8. Como tal, enquanto a expressão NKG2DL é comumente não detectável na superfície de células saudáveis, nKG2DL mRNA9 e expressão de proteína intracelular foram relatados em tecidos saudáveis. A relevância funcional de tal expressão e os mecanismos subjacentes a tais padrões de expressão discretos permanecem a ser definidos10.

A regulação mecanicista da expressão NKG2DL nas células cancerosas é uma área fascinante de investigação. Vias conhecidas por estarem envolvidas tanto no estresse celular, por exemplo, na via de estresse de choque térmico9, ou em vias associadas a danos no DNA, como a ataxia telangiectasia mutada (ATM) e a via Rad3 relacionada (ATR)11,bem como infecções virais ou bacterianas foram diretamente ligadas à indução da expressão NKG2DL12. No entanto, mesmo que a expressão superficial do NKG2DL tenha sido efetivamente induzida, essa expressão pode ser perdida novamente através do derramamento mediado proteolítico, um mecanismo associado à fuga imunológica e ao prognóstico clínico ruim em alguns cânceres13.

A ausência de nKG2DL de superfície celular também pode desempenhar papéis importantes em pacientes com LMA. Aqui, o tratamento com quimioterapia intensiva muitas vezes induz a remissão, mas a recaída ocorre frequentemente a partir de células-tronco leucmicas (LSC), que sobrevivem seletivamente às quimioterapias e evitam a resposta imune. Como mostramos recentemente, os LSCs, por exemplo, escapam da lise celular NK suprimindo a expressão de superfície NKG2DL14.

Inversamente, a ausência de expressão NKG2DL superficial pode ser usada como um método para identificar e isolar viávelmente subpopulações putativas semelhantes a troncos de células de subpopulações leucêmicas de contrapartida em massa. Aqui, apresentamos duas abordagens citométricas de fluxo que podem ser usadas para detectar a expressão da superfície NKG2DL e, assim, identificar células-tronco nkg2DL negativas na leucemia e talvez também em outros cânceres: Um método para reconhecimento da superfície pan-ligante e um método envolvendo coloração com anticorpos uni ou agrupados reconhecendo proteínas NKG2DL conhecidas.

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Protocolo

As amostras dos pacientes foram coletadas após aprovação do Conselho de Revisão ética dos Hospitais Universitários de Basileia e Tuebingen.

1. Biotintilação da proteína de fusão NKG2D

NOTA: Esta etapa é realizada com um kit de biotiningação (ver Tabela de Materiais) de acordo com a instrução do fabricante. Esta etapa do protocolo deve ser realizada pelo menos 24 horas antes da coloração. A proteína de fusão NKG2D biotinilada deve ser armazenada a -20 °C.

  1. Descongele tanto a biotina, quanto os tubos de proteína de fusão NKG2D à temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Se as células precisarem ser estéreis para uso experimental adicional (injeção em camundongos, ensaios da unidade formadora de colônias, etc.), reconstitua a proteína de fusão sob uma capa de fluxo laminar para evitar contaminação. Caso contrário, cada passo pode ser realizado em um banco.
  2. Gire rapidamente os 50μg de proteína de fusão NKG2D liofilizada. Adicione 500 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para reconstituir o pó e misturar completamente usando uma micropipette P1000.
  3. Adicione 100 μL da proteína de fusão NKG2DL a um tubo de biotina para obter uma concentração final de estoque de 100 μg/mL.
  4. Misture bem a solução com um resususus com uma micropipette P100.
  5. Incubar a solução de proteína/biotina de fusão em um RT controlado por 24 h. A proteína de fusão está pronta para uso.

2. Descongelamento de células AML primárias

NOTA: Aproximadamente 5.000.000 células leucêmicas congeladas por paciente armazenadas em nitrogênio líquido foram descongeladas e depois usadas para os ensaios imediatamente. As células leucêmicas foram obtidas e congeladas como descrito anteriormente15. Resumidamente, amostras de sangue periférico coletadas de pacientes com LMA e altas porcentagens de células de explosão (>90% das explosões entre as células mononucleares) foram processadas com uma separação gradiente de densidade para obter células mononucleares e, posteriormente, congeladas no soro da panturrilha fetal (FCS) contendo 10% de solução de sulfóxido de dimetil (DMSO). O número de células altamente variado entre os pacientes em dependência da concentração de leucócitos no paciente (faixa: 1.000.000 a 30.000.000 células leucêmicas por mL sangue).

  1. Meio RPMI pré-aquecido contendo 10% de FCS a 37 °C usando um banho de água. Para cada frasco de células AML (até 30.000.000 células em 1 mL FCS + 10% DMSO), adicione 10 mL de meio pré-aquecido a um tubo de reação de 15 mL.
  2. Remova o criovial contendo LMA primária do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele imediatamente as células usando um banho de água de 37 °C. Mova suavemente o tubo para frente e para trás na água, permitindo que o conteúdo do frasco descongele até que haja apenas um pequeno cristal de gelo.
  3. Transfira imediatamente as células descongeladas para o tubo de média contenção e enxágue o frasco usando 1 mL de meio.
  4. Centrifugar as células a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernasce sem perturbar a pelota.
  5. Lave as células com 5 mL de meio RPMI contendo 10% de FCS e centrífuga a 300 x g por 10 min.

3. Contagem celular

  1. Resuspende a pelota de célula em um volume conhecido de meio RPMI contendo 10% de FCS.
  2. Transfira um pequeno volume da suspensão celular para um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL e dilua em uma proporção conhecida com azul tripano ou qualquer outro corante alternativo que permita discriminação celular viva/célula morta.
  3. Use qualquer dispositivo para contar as células.
  4. Centrifugar as células a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernasce sem perturbar a pelota.

4. Coloração de células AML primárias usando a proteína de fusão NKG2D biotinilada

  1. Prepare o tampão de coloração suplementando 500 mL PBS com albumina de soro bovino (BSA) e ácido traacético etilenodiaminete (EDTA) a uma concentração final de 0,07 mM e 2 mM, respectivamente. Ajuste o pH (7.2-7.4) se necessário.
  2. Resuspengem a pelota celular com tampão de coloração a uma concentração final de 0,5 x 107 células/mL.
    NOTA: Opcionalmente, antes da coloração, as células podem ser incubadas com um agente de bloqueio (por exemplo, hIgG (1μg/ml) por 30 min no RT ou no agente de bloqueio fcr)..
  3. Transfira 100 μL da suspensão celular para uma placa de fundo U de 96 poços e centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
  4. Prepare uma mistura mestre de proteína de fusão NKG2D biotinilada para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 μL por poço com uma concentração final de 10 μg/mL por poço.
  5. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 4.4 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
    NOTA: Reduza o volume final de acordo com o número de células para reduzir a quantidade de proteína de fusão necessária para a coloração.
  6. Incubar a suspensão da célula por 25 min na RT ou 50 min a 4 °C.
  7. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço com uma pipeta multicanal de 300 μL.
  8. Centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
  9. Repita as etapas 4.7 e 4.8.
    NOTA: A coloração descrita aqui é realizada em uma cultura celular de 96 poços placa de fundo U. Portanto, as etapas de lavagem são realizadas duas vezes devido à pequena capacidade de volume dessas placas. A coloração também pode ser realizada em outros tubos e as etapas de lavagem podem então ser realizadas apenas uma vez usando um volume maior.
  10. Prepare uma mistura mestra usando Streptavidin-PE (ver Tabela 1 para diluições) para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 μL.
    NOTA: Adicione anticorpos de seleção para o tipo de interesse do seu celular, como por exemplo, CD33, CD34.... para AML.
  11. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 4.10 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
  12. Incubar as suspensões celulares por 15 min em RT ou 30 min a 4 °C no escuro.
  13. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço com uma pipeta multicanal de 300 μL.
  14. Centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
  15. Repita as etapas 4.13 e 4.14.
  16. Prepare uma solução de tampão de coloração incluindo 7-AAD (7-Aminoactinomicina D, 1:1000) ou qualquer reagente para distinguir entre células vivas e mortas.
  17. Pelotas de células resuspendas em tampão de coloração de 200 μL + 7-AAD preparados na etapa 4.16 no uso de uma micropipette multicanal de 300 μL.
  18. Analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo.

5. Coloração de anticorpos anti-NKG2DL únicos únicos ou agrupados

  1. Use a mesma suspensão celular da etapa 4.2.
  2. Transfira 100 μL da suspensão celular para uma placa de fundo U de cultura celular de 96 poços usando uma pipeta multicanal de 300 μL e centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
  3. Prepare uma mistura mestre de anticorpos para cada anticorpo primário ou anticorpos agrupados (ver Tabela 2 para diluições) para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 μL.
  4. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 5.3 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
  5. Incubar as células por 25 min na RT.
  6. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço usando uma pipeta multicanal de 300 μL.
  7. Centrifugar a cultura celular 96-bem placa de fundo U a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
  8. Repita as etapas 5.6 e 5.7.
  9. Prepare uma mistura mestre de anticorpos adicionando o anticorpo secundário (ver Tabela 2 para diluições) para que as células sejam resuspended em um volume final de 50 μL por poço.
  10. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 5.9 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
  11. Incubar por 15 min no RT ou 30 min a 4 °C no escuro.
  12. Lave adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço usando uma pipeta multicanal de 300 μL.
  13. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
  14. Repita as etapas 5.12 e 5.13.
  15. Pelotas de células resuspendas em tampão de coloração de 200 μL contendo 7-AAD preparados na etapa 4.16.
  16. Analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo, conforme descrito na etapa 6.

6. Aquisição de dados

NOTA: Certifique-se de que os controles semanais de qualidade do citômetro de fluxo sejam realizados para garantir que os lasers estejam funcionando corretamente. Para o protocolo aqui apresentado, é realizado um processo semanal de Cytometer and Tracking (CTS) com contas relativas para verificar o desempenho a laser em todos os canais. Após o CTS, 10.000 eventos são registrados usando as contas de 8 picos como controle interno. Todos os picos devem estar na mesma posição dentro de seus portões e bem separados um do outro.

  1. Crie a compensação matricial para subtrair a sobreposição espectral entre detectores com contas ou com células16.
  2. Registo 10.000 eventos para as celas não manchadas e as únicas contas manchadas. Para os controles de fluorescência menos um (FMO), registos recordem 50.000 eventos e para as amostras manchadas completas registram até 100.000 eventos.
    NOTA: Alternativamente, podem ser realizadas amostras únicas manchadas nas células. Se assim for, certifique-se de que as células tenham um sinal positivo para o marcador desejado.
  3. Adquira uma única célula manchada ou amostra de contas para cada fluoróforo usado no experimento para revelar a quantidade de sobreposição espectral. Use o criador de compensação do dispositivo de citometria de fluxo para calcular valores de derramamento e aplicar a matriz de compensação a todas as amostras medidas.
    NOTA: Os anticorpos secundários não podem ser utilizados para a criação de indenizações usando contas se a compensação for calculada com contas. Dependendo do tipo de contas de compensação, anticorpos secundários não podem ser usados para compensação com contas.
  4. Para os controles FMO e as amostras manchadas completas com a proteína de fusão, em primeiro lugar, selecione as células com base em sua dispersão dianteira (FSC) e dispersão lateral (SSC). Após a exclusão de doublets, portal as células com base em sua negatividade para 7-AAD (PercP-Cy5.5) sinal para excluir as células mortas (ver passo 5.15). O enredo final mostra a expressão de CD34 (eixo Y) e NKG2DL (eixo X) em singlets vivos.
  5. Para os anticorpos anti-NKG2DL únicos, aplique a mesma estratégia nas amostras, mas note que a positividade de ligantes está no Alexa Fluor 488 e não no canal PE.
  6. Ajuste os portões de acordo com os controles FMO para a estratégia de gating das etapas 6.4 e 6.5 (ver Tabela 3) para que os controles FMO apropriados realizem este experimento: No software de análise, desenhe um portão sobre a fração negativa. Ao registrar a amostra totalmente manchada, as células acima do portão criado anteriormente são positivas para o marcador analisado.

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Resultados

Ambos os protocolos aqui apresentados permitem o enriquecimento da LSC AML por meio de análises citométricas de fluxo utilizando CD34, um marcador conhecido de LSC17, em combinação com a expressão de superfície NKG2DL, utilizando reconhecimento pan-ligante ou colorindo com anticorpos agrupados contra ligantes individuais. Na Figura 1,mostramos que as amostras de LMA analisadas são positivas para CD34 e NKG2DL, mas também existem subpopulações negativas, o que é mostra...

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Discussão

Aqui apresentamos dois métodos citométricos de fluxo que podem detectar a expressão da superfície NKG2DL em células LMA primárias humanas. Mostramos que ambos os métodos de detecção podem ser usados em conjunto com outras manchas de anticorpos (por exemplo, detectando a expressão CD34). Manchas semelhantes também podem ser realizadas em outros tipos de células primárias e linhas celulares.

Recentemente, mostramos que a ausência de NKG2DL na superfície das explosões de pacientes AML pode enriqu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (179239), da Fundação para o Combate ao Câncer (Zuerich), da Fundação Wilhelm Sander à CL (2019.042.1) e da Fundação Novartis para pesquisa médico-biológica para C.L. Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie 765104. Agradecemos o apoio da Instalação de Citometria de Fluxo em Basileia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
7-amminoactinomicina D (7-AAD)InvitrogenA1310Corante de viabilidade
96 placa de poço U fundoSarstedt83392550096 Placa de poço para o nosso citômetro de fluxo
APC Mouse Anti-Human cd34BD555824Anticorpo que detecta CD34
RRID: AB_398614
Albumina de soro bovinoPanReac AppliChemA1391,0050Componente da coloração tampão
Ácido etilenodiaminotetracéticoRoth8043.1Componente do tampão de coloração Soro
de bezerro fetal (FCS)BioConcept2-01F10-IComponente do meio RPMI suplementado
FlowJo 10.2BD/Software que permite a análise de dados para a experiência de citometria de fluxo
IgG anti-coelho de cabra (H+L) Alexa Fluor 488Thermo ScientificA21222Anticorpo secundário que detecta os anticorpos primários para MICA e MICB
RRID: AB_1037853
proteína quimera humana NKG2D Fc, CFR& D1299-NK-050Proteína de fusão detectando todos os NKG2DLs
RRID:
Anticorpo ULBP-1 humanoR& DAF1380Anticorpo que detecta ULBP1
RRID: AB_354765
Anticorpo humano ULBP-2/5/6R& DAF1298Anticorpo que detecta ULBP2/5/6
RRID: AB_354725
Anticorpo ULBP-3 humanoR& DAF1517Anticorpo que detecta ULBP3
RRID: AB_354835
Anticorpo policlonal MICAThermo ScientificPA5-35346Anticorpo que detecta MICA
RRID: AB_2552656
Anticorpo policlonal MICBThermo ScientificPA5-66698Anticorpo que detecta MICB
RRID: AB_2663413
Kit de biotinilação de anticorpos de uma etapa 1 tira, para 8 reaçõesMiltenyibiotec130-093-385Kit de biotinilação para a proteína de fusão NKG2DL
Solução salina tamponada com fosfatoSigma AldrichD8537-500MLComponente do tampão de coloração
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488Thermo ScientificA11034Anticorpo secundário detectando os anticorpos primários para os ULBPs
RRID: AB_2576217
Partículas de calibração do arco-íris (8 picos) 3,0 umSpherotech Inc.RCP-30-20AGrânulos usados para manutenção de dispositivos de citometria de fluxo
Meio RPMISigma AldrichR8758-500MLMeio de cultura de células
RayBright Universal Compensation BeadsRaybiotech137-00013-100Grânulos usados para criar a matriz de compensação
Estreptavidin, R-Ficoeritrina Conjugado (SAPE) - 1 mg/mLInvitrogenS866Etapa secundária para a detecção da proteína de fusão NKG2DL biotinilada

Referências

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