Artigo de método

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

DOI:

10.3791/61812

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25 de outubro de 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Neste artigo

Resumo

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Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Resumo

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Hepatócitos primários são usados extensivamente em pesquisas in vitro hepáticas, especialmente em estudos de metabolismo de glicose. Uma técnica base foi adaptada com base em diferentes necessidades, como tempo, trabalho, custo e uso primário de hepatócitos, resultando em vários protocolos primários de isolamento hepatócito. No entanto, os numerosos passos e os preparativos demorados de reagentes no isolamento primário do hepatocitado são grandes desvantagens para a eficiência. Depois de comparar diferentes protocolos para seus prós e contras, as vantagens de cada um foram combinadas, e um protocolo rápido e eficiente de isolamento hepatócito primário foi formulado. Dentro de apenas ~35 min, este protocolo poderia produzir tanto, se não mais, hepatócitos primários saudáveis como outros protocolos. Além disso, os experimentos de metabolismo de glicose realizados usando os hepatócitos primários isolados validaram a utilidade deste protocolo em estudos in vitro de metabolismo hepático. Também revisamos e analisamos extensivamente a importância e o propósito de cada etapa deste estudo para que os futuros pesquisadores possam otimizar ainda mais esse protocolo com base nas necessidades.

Introdução

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O fígado serve como um dos órgãos mais importantes no corpo de vertebrados devido ao papel vital que desempenha em inúmeras funções de suporte à vida, como digestão alimentar, circulação sanguínea e desintoxicação. O uso de hepatócitos primários de camundongos na cultura vitro é cada vez mais popular em estudos de metabolismo de carboidratos e carcinoma hepático. Por isso, é importante desenvolver um método conveniente para o isolamento primário do hepatocito do camundongo, mantendo sua função fisiológica inata. Devido à sua função como um centro do metabolismo da glicose, o fígado também é central para a produção e armazenamentode glicose 1. Experimentos com hepatócitos primários in vitro são imperdíveis para a maioria dos estudos de metabolismo de glicose. Portanto, durante anos, vários grupos de pesquisa desenvolveram protocolos para o isolamento primário do hepatocite do rato.

O procedimento geral do isolamento do hepatocito do camundongo é primeiro liberar sangue no fígado com um líquido isotomótico, como salina tamponada com fosfato (PBS) ou Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e, em seguida, usar solução contendo colagem para dissociar hepatócitos. Esses protocolos compartilham um procedimento geral, mas diferem em reagentes e passos baseados em diferentes necessidades. No entanto, preparar reagentes necessários e realizar passos de isolamento levam tempo. No desenvolvimento do presente protocolo, a eficiência foi definida como prioridade, com todos os reagentes prontos para uso e disponíveis no mercado, e o menor número possível de etapas. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método rápido e eficiente para isolar hepatócitos primários do rato, sem comprometer a pureza e viabilidade primária isolada.

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Protocolo

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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (8 semanas de idade).

1. Preparação:

  1. Misture o William's E Medium (GlutaMAX Supplement) com 10% de FBS e 1% solução antibiótico-antimíctica para tornar a cultura média.
  2. Filtrar 25 mL de meio de colagenase-dispase (por exemplo, Liver Digest Medium) através de um filtro de seringa de 0,45 μm para remover detritos de partículas.
  3. Quente 50 mL de H2O destilado duplo (ddH2O), 35 mL de médio de perfusão (por exemplo, Médio de Perfusão de Fígado) (ou 50 mL pela primeira vez usando este protocolo), e 25 mL de meio de colagenase-dispase filtrado em um banho de água de 45 °C por 30 min.
  4. Dentro de uma capa de cultura tecidual estéril, misture 2 mL de HBSS 10x e 18 mL de Percoll em um tubo de 50 mL para fazer 20 mL 1x Percoll-HBSS e manter no gelo ou 4 °C.
    NOTA: 1x Percoll-HBSS pode ser mantido a 4 °C por pelo menos 6 meses.
  5. Dentro de uma capa de cultura de tecido estéril, despeje 30 mL de meio de lavagem (por exemplo, Hepatocyte Wash Medium) em uma placa de Petri limpa, e mantenha no gelo.
  6. Submerse o tubo de bombeamento na água de um banho de água de 45 °C. Os resultados são mais confiáveis se a temperatura ambiente estiver em 25 °C.
  7. Prepare 2 mL de anestésicos 1x misturando 225 μL de Cetamina HCL, 93,75 μL de Xilazina e 1681 μL de 1x PBS.
  8. Anestesiar um rato usando um método aprovado. Aqui o rato foi injetado intraperitonealmente com 150 μL de anestésicos 1x. Realize os testes para perda de reflexos, como reação ao beliscão do dedo do dedo para garantir anestesia total.
  9. Fixar o mouse de costas na almofada de dissecção por quatro membros, fixando ou usando fita adesiva à prova d'água ou outros métodos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da instituição (ou equivalentes).
  10. Prepare fórceps esterilizados e tesouras para dissecção. Para evitar uma possível contaminação, conduza todas as etapas dentro de um capô estéril.

2. Procedimento:

  1. Usando uma bomba peristáltica, comece a bombear ddH2O aquecido a uma velocidade de 4 mL/min por 5 min. Mude o tubo de bombeamento da água para um meio de perfusão aquecido.
  2. Desinfete o abdômen do camundongo anestesiado com 70% de EtOH e corte aberto com uma tesoura para expor o fígado, a veia portal e a veia inferior (IVC).
  3. Pare a bomba peristáltica. Insira um cateter de 24 G (por exemplo, Cateter IV Fechado, 24 G, 0,75 IN) no IVC. Comece a bombear e corte a veia do portal aberta.
  4. Continue bombeando até que o líquido liberado esteja limpo (em torno de 3-5 min). Pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Tenha cuidado para não deixar bolhas de ar entrarem no IVC.
    NOTA: Este passo é para remover o máximo de sangue possível do fígado.
  5. Altere o tubo de bombeamento do meio de perfusão para o meio de colagenase-dispase. Continue bombeando até que todos os 25 mL do meio de colagenase-dispase sejam esgotados enquanto fazem a etapa 2.6.
  6. Pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado.
    NOTA: Nesta fase, a perda completa de sangue é fatal para o rato. A morte do rato pode ser confirmada por falta de batimentos cardíacos após o experimento. Descarte a carcaça de acordo com as políticas de instalação.
  7. Isole todo o fígado sem vesícula biliar ao meio de lavagem de 30 mL na placa de Petri no gelo.
  8. Rasgá-lo em pedaços com fórceps para liberar hepatócitos primários em solução. Esta etapa transformaria o meio de lavagem em uma solução nublada cheia de hepatócitos primários liberados e pequenos pedaços de fígado.
  9. Filtre a solução nublada na etapa 2.8 através de um coador de células de 70 μm no Percoll-HBSS de 20 mL em um tubo de 50 mL no gelo. Misture invertendo o tubo 20 vezes.
  10. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
  11. Dentro da capa da cultura tecidual, aspire o supernante. Lave a pelota com 30 mL frio de meio de lavagem.
  12. Centrifugar a 50 x g por 5 min a 4 °C.
  13. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 25 mL do meio de cultura (ou outros volumes apropriados) dentro da capa da cultura tecidual.
  14. Conte o número da célula e emplaque as células nas placas de cultura desejadas de acordo com o projeto experimental.
    NOTA: Hepatócitos primários devidamente isolados de um rato de 8 semanas de idade são geralmente suficientes para serem banhados em quatro placas de 6 poços ou quatro placas de 12 poços.

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Resultados

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Para testar a eficiência, foi realizado o presente protocolo primário de isolamento do hepatocito em camundongos C57BL/6 femininos de 8 semanas. O apego e a pureza dos hepatócitos primários isolados foram testados. O isolamento primário do hepatócito é usado para uma grande variedade de experimentos em fisiologia hepática, como efeitos hepáticos de drogas e metabolismo de glicose, atividade biomarcadora farmacêutica2, sensibilidade à insulina e produção de glicose. Portanto, as atividades dos hepa...

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Discussão

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Vários protocolos primários de isolamento de hepatocitas foram desenvolvidos. Eles também foram mantidos otimizados e adaptados com base em diferentes necessidades (Tabela 1). Os protocolos de isolamento são geralmente compostos de duas partes: perfusão (incluindo digestão enzimápica) e purificação.

A perfusão pode ser realizada com todo o fígado in vivo 2,20,21,22,23 ou com lóbulos hepáticos dissecados <...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 5R01HD095512-02 a S.W.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
Placa de 12 poçosFALCON353043Revestimento não necessário
Placa de 6 poçosde 353046FALCONnão necessário
Sinalização Celular2920S
(100x), EstabilizadaSinalizaçãoA5955
97635S
anti-GAPDHSinalização celular2118S
anti-p-AKT (S473)Sinalização celular9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Sinalização celular84192S
Filtro de células, 70 µ mCELLTREAT229483
Cateter IV Fechado, 24 Gauge 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM, sem glicose, sem glutamina, sem vermelho de fenolThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChromBioAssay SystemsEBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
Cabra Anti-rato IgG Anticorpo SecundárioLI-COR926-68070
Cabra Anti-coelho IgG Anticorpo SecundárioLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatócito Lavagem MédioGibco17704-024
IBMXCell Signaling13630S
Insulina LillyNDC 0002-8215-01
Cetamina HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutaminaGibco25030081
Fígado Digest MédioGibco17703-034Alíquota dentro do capuz de cultura de tecidos para 25 mL cada em tubo de 50 mL e manter em -20 ° C freezer
Fígado Perfusão MediumGibco17701-038
Caneta StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Bomba PeristálticaGilsonMinipuls 2Capaz de bombear a 4 mL/min
Placa de PetriFisherbrand08-757-12
CentrífugaRefrigeradaSorvallLegend RTCapaz de centrifugar tubo de 50 mL a 4 & C
L-lactato de SódioSigma-AldrichL7022
Piruvato de SódioGibco11360070
Seringa Filtro, PVDF 0.45 µ mCELLTREAT229745
Becton Dickinson329461de 0,5 mL
Becton Dickinson30965360 mL
de 15250061Gibco0,4%,
de 430052Corningde 15 mL
Corning43029050 mL
Tanque de banhoCorningCLS6783Ou qualquer tanque de banho-maria capaz de aquecer até 45 > C
Guilherme' s E Medium (Suplemento GlutaMAX)Gibco32551020
Xilozina (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10
Revestimento anti-AKT Solução Antimistótica Antibiótica de celular anti-FOXO1 Sigma-Aldrich Kit de ensaio de glicose Seringa de 30 mm de diâmetro, seringa , solução Trypan Blue de, tubo tubo , água de

Referências

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