Artigo de método

Um método simples de secção seca para obter seção de resina de tamanho inteiro e suas aplicações

DOI:

10.3791/61822

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23 de janeiro de 2021

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1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Esta técnica permite a preparação rápida e simples da seção de resina de tamanho inteiro para a observação e análise de células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões da semente.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A morfologia, o tamanho e a quantidade de células, grânulos de amido e corpos proteicos em sementes determinam o peso e a qualidade das sementes. São significativamente diferentes entre diferentes regiões de sementes. Para ver as morfologias das células, grânulos de amido e corpos proteicos de forma clara, e analisar quantitativamente seus parâmetros de morfologia com precisão, a seção do tamanho de sementes é necessária. Embora a seção de parafina de todo o tamanho de sementes possa investigar o acúmulo de materiais de armazenamento em sementes, é muito difícil analisar quantitativamente os parâmetros de morfologia das células e materiais de armazenamento devido à baixa resolução da seção espessa. A seção de resina fina tem alta resolução, mas o método de secção de resina de rotina não é adequado para preparar a seção em tamanho inteiro de sementes maduras com um grande volume e alto teor de amido. Neste estudo, apresentamos um método simples de secção seca para preparar a seção de resina de todo o tamanho das sementes. A técnica pode preparar as seções de tamanho integral transversal e longitudinal de sementes em desenvolvimento, maduras, germinadas e cozidas embutidas na resina branca LR, mesmo para sementes grandes com alto teor de amido. A seção de tamanho inteiro pode ser manchada com brilho fluorescente 28, iodo e R250 azul brilhante Coomassie para exibir especificamente a morfologia de células, grânulos de amido e corpos proteicos claramente, respectivamente. A imagem obtida também pode ser analisada quantitativamente para mostrar os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes.

Introdução

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As sementes vegetais contêm materiais de armazenamento, como amido e proteína, e fornecem energia e nutrição para as pessoas. A forma, o tamanho e a quantidade de materiais de célula e armazenamento determinam o peso e a qualidade das sementes. As células e materiais de armazenamento em diferentes regiões de sementes possuem morfologias significativamente diferentes, especialmente para algumas culturas de cereais de alta amilolose com inibição da enzima de ramificação de amido IIb1,2,3. Por isso, é muito importante investigar as morfologias das células e materiais de armazenamento em diferentes regiões de sementes.

A secção de parafina é um bom método para preparar a seção de todo o tamanho das sementes e pode exibir a estrutura tecidual das sementes e o acúmulo de material de armazenamento em diferentes regiões de sementes4,5,6. No entanto, as seções de parafina geralmente têm 6-8 μm de espessura com baixa resolução; assim, é muito difícil observar e analisar quantitativamente a morfologia dos materiais celulares e de armazenamento. As seções de resina geralmente têm 1-2 μm de espessura e alta resolução e são muito adequadas para observar e analisar a morfologia dos materiais celulares e de armazenamento7. No entanto, o método rotineiro de secção de resina tem dificuldade em preparar a seção de todo o tamanho das sementes, especialmente para sementes com grande volume e alto teor de amido; assim, não há como observar e analisar a morfologia das células e materiais de armazenamento em diferentes regiões da semente. A resina branca LR é uma resina acrílica e exibe baixa viscosidade e forte permeabilidade, levando a suas boas aplicações na preparação da seção de resina de sementes, especialmente para grãos maduros de cereais com grande volume e alto teor de amido. Além disso, a amostra embutida na resina branca LR pode ser manchada facilmente com muitos corantes químicos para exibir claramente a morfologia das células e materiais de armazenamento sob microscópio leve ou fluorescente7. Em nosso artigo anterior, relatamos um método de secção seca para preparar as seções de tamanho inteiro de grãos de cereais maduros embutidos em resina branca LR. O método também pode preparar a seção de tamanho inteiro do kernel de cereais em desenvolvimento, germinado e cozido8. A seção de todo o tamanho obtido possui muitas aplicações na observação e análise de micromorfologia, especialmente para visualização clara e análise quantitativa das diferenças de morfologia dos materiais celulares e de armazenamento em diferentes regiões da semente8,9.

Esta técnica é apropriada para pesquisadores que desejam observar a microestrutura do tecido e a forma e o tamanho das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes usando microscópio leve. As imagens de seções de tamanho inteiro manchadas especificamente para exposição de células, grânulos de amido e corpos proteicos podem ser analisadas por software de análise de morfologia para medir quantitativamente os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões da semente. Para demonstrar a aplicabilidade técnica e as aplicações de seção de todo o tamanho das sementes, investigamos as sementes maduras do estupro de milho e oleosa e os grãos de arroz em desenvolvimento, germinados e cozidos neste estudo. O protocolo contém quatro processos. Aqui, usamos o kernel de milho maduro, que é o mais difícil na preparação das seções de todo o tamanho das sementes devido ao grande volume e alto teor de amido, como uma amostra para exibir os processos passo a passo.

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Protocolo

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1. Preparação de sementes incorporadas à resina (Figura 1)

  1. Fixar seis grãos maduros de milho em 10 mL de glutaraldeído tamponado de fosfato de 2,5% (0,1 M, pH7.2) a 4 °C por 48 h. Os pesquisadores podem escolher outras misturas fixas, concentrações fixas e condições de fixação de acordo com seus objetivos de pesquisa e tipos de tecidos.
  2. Tire os grãos e corte-os longitudinalmente ou transversalmente até 2-3 mm de espessura usando uma lâmina afiada de dupla lateridade, e fixá-los em 10 mL de 2,5% de glutaraldeído tampão-fosfato (0,1 M, pH 7.2) novamente por 48 h.
  3. Lave as amostras três vezes com 10 mL de tampão fosfato de 0,1 M (pH 7,2) por 30 minutos todas as vezes.
  4. Desidratar as amostras no aumento dos graus de solução aquosa do etanol (10 mL) de 30% para 50%, 70%, 90% uma vez e 100% três vezes por 30 minutos todas as vezes.
  5. Infiltrar-se nas amostras em 10 mL aumentando os graus de solução de resina LR White diluída com etanol de 25% para 50%, 75% uma vez e 100% duas vezes a 4 °C por 12 h todas as vezes.
  6. Prepare os pedestais para amostras antes de incorporar. Adicione 0,25 mL de resina branca 100% LR em um tubo centrífuga de 2 mL e polimerize-a a 60 °C por 48 h.
  7. Adicione sucessivamente a resina branca LR pura (0,5 mL) e a amostra infiltrada no tubo centrífuga com um pedestal. Endireitar as amostras com a agulha anatômica e polimerizá-las a 60 °C em forno por 48 h.

2. Seccional seca para preparação de seção de tamanho inteiro(Figura 1)

  1. Retire os grãos embutidos do tubo centrífuga e corte o excesso de resina ao redor da amostra usando uma lâmina afiada.
  2. Fixar o bloco de resina no suporte de amostra de ultramicrotome (EM UC7), e cortar a resina supérflua na superfície da amostra e ao redor da amostra com uma lâmina.
  3. Polir a superfície da amostra finamente com uma faca de vidro até que uma seção completa possa ser formada.
  4. Coloque um pequeno gancho de cobre cerca de 2 mm acima da borda da lâmina antes de cortar e corte a amostra em uma seção de 2 μm. O papel do gancho é evitar o curling para cima da seção.
  5. Coloque o gancho sob a seção para apoiá-lo quando a seção ficar longa.
  6. Adicione 100 μL de água em um slide não tratado e transfira cuidadosamente a seção completa e ininterrupta para a água com a pinça.
  7. Para suavizar a seção enrugada, aqueça e seque a amostra na mesa de achatamento a 50 °C durante a noite.
    1. Se a seção desmoronar ou chorar, estenda o tempo para cada infiltração de resina da amostra de 12h a 24 h ou 48 h.
    2. Se a seção tiver algumas linhas paralelas à faca, aperte firmemente o bloco de amostra. Se a seção tiver algumas linhas verticais para a faca, por favor, use uma faca nova.

3. Coloração e observação da seção

NOTA: Para observar a estrutura tecidual e a morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos, colori as seções com manchas específicas de acordo com o propósito da pesquisa. Aqui, usamos o iluminador fluorescente 28, solução de iodo e R250 azul brilhante Coomassie para manchar as paredes celulares, grânulos de amido e corpos proteicos, respectivamente.

  1. Para observar a morfologia das células, colori a seção com 40 mL de 0,1% (w/v) de brilho fluorescente 28 solução aquosa em um frasco de coloração de vidro compacto de 70 mL a 45 °C por 10 minutos e, em seguida, enxágüe-a com água corrente por 5 min. Observe e fotografe a seção sob um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD.
  2. Para observar a morfologia dos grânulos de amido, colorique a seção com 40 μL de solução de iodo (0,07% (w/v) I2 e 0,14% (w/v) KI em 25% (v/v) glicerol) por 1 min, e cubra a amostra contendo solução de iodo com um tapa de cobertura. Veja e fotografe a amostra sob um microscópio leve equipado com uma câmera CCD.
  3. Para observar a morfologia dos corpos proteicos, mergulhe a seção com 40 mL de ácido acético de 10% (v/v) em um frasco de coloração de vidro compacto de 70 mL por 10 min a 45 °C, e, em seguida, manchá-lo em 40 mL de 1% (w/v) Coomassie azul brilhante R250 em 25% (v/v) isopropanol e 10% (v/v) ácido acético por 15 min a 45 °C. Lave as seções manchadas com água corrente por 5 minutos e seque-as. Observe e fotografe a seção sob um microscópio leve equipado com uma câmera CCD.

4. Análise quantitativa dos parâmetros de morfologia

  1. Processar e analisar quantitativamente as imagens fotografadas para área, eixo longo/curto e arredondamento de células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões de sementes usando software de análise de morfologia (software Image-Pro Plus 6.0) seguindo exatamente os procedimentos de Zhao et al.9.

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Resultados

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Método simples de secção seca para obter uma seção de tamanho de sementes inteira
Estabelecemos um método simples de secção seca para preparar uma seção de sementes em tamanho inteiro embutida em resina LR-branca(Figura 1). O método pode preparar seções transversais e longitudinais de todo o tamanho com espessura de 2 μm(Figura 2-5, Figura Suplementar 1-4). Por exemplo, a semente madura do estupr...

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Discussão

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As sementes são o recurso renovável mais importante para alimentos, forragem e matéria-prima industrial, e são ricas em materiais de armazenamento, como amido e proteína. A morfologia e a quantidade de células e o conteúdo e configuração dos materiais de armazenamento afetam o peso e a qualidade das sementes7,12. Embora a tecnologia de estereologia e análise de imagem possa medir o tamanho e a quantidade de células em uma região de tecido, elas estão em falta em ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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O financiamento foi fornecido pela National Natural Science Foundation of China (32071927), pelo Projeto de Talentos da Universidade de Yangzhou e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Frasco de coloração de vidro compacto (5 lugares)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Coomassie azul brilhante R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Cobertura de lamínulaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Lâmina de dupla faceGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Etanol absolutoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Mesa de achatamentoLeicaHI1220
Microscópio de fluorescênciaOlympusBX60
Branqueador fluorescente 28Sigma-Aldrich910090
Tiras de vidroLeica840031
Solução de glutaraldeído 50% em águaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
GlicerolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
IodoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
IsopropanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
microscópio de luzOlympusBX53
LR Resina brancaÁgar ScientificAGR1281A
FornoShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co., Ltd.9023A
Iodeto de potássioSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
SlideSangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.
PinçasSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Fosfato de sódio dibásico dodecahidratadoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Fosfato de sódio monobásico di-hidratadoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
UltramicrótomoLeicaEM UC7
A501931E678013A100472F518211A500737A600875A600232A500538A507048A100512F518101F519022A607793A502805

Referências

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  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
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  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
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  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
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