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Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

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DOI:

10.3791/61830

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27 de outubro de 2020

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1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center

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Resumo

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Resumo

Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) é um fator multifuncional secreto que desempenha um papel fundamental na comunicação intercelular. Perturbações da sinalização de β TGF podem levar ao câncer de mama. TGF-β provoca seus efeitos na proliferação e diferenciação através de receptores TGF-β tipo I e tipo II da superfície celular específica (ou seja, TβRI e TβRII) que contêm um domínio de quinase serina/threonina intrínseca. Após a formação do complexo heteromérico induzido pelo TGF-β, o TβRI ativado provoca a sinalização intracelular por fosforilando SMAD2 e SMAD3. Estes SMADs ativados formam complexos heteroméricos com SMAD4 para regular genes alvo específicos, incluindo o inibidor de ativação de plasminogen 1 (PAI-1, codificado pelo gene SERPINE1). A indução da transição epitelial-mesenquimal (EMT) permite que células cancerígenas epiteliais no local primário ou durante a colonização em locais distantes obtenham um fenótipo invasivo e impulsionem a progressão do tumor. TGF-β atua como um potente indutor da invasão do câncer de mama dirigindo o EMT. Aqui, descrevemos métodos sistemáticos para investigar a sinalização de TGF-β e as respostas emt usando células epiteliais de MCF10A-RAS (M2) e células epiteliais NMuMG do mouse como exemplos. Descrevemos métodos para determinar a fosforilação SMAD2 induzida pelo TGF-β por mancha ocidental, atividade transcricional dependente de SMAD3/SMAD4 usando atividade de repórter luciferase e expressão genética alvo SERPINE1 por reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR). Além disso, os métodos são descritos para examinar o EMT induzido pelo TGF-β, medindo alterações na morfologia, expressão do marcador epitelial e mesenquimal, coloração de actina de fisomante e coloração de imunofluorescência de E-cadherin. Duas pequenas moléculas seletivas inibidores de quinase receptora TGF-β, GW788388 e SB431542, foram usados para bloquear a fosforilação SMAD2 induzida pelo T β GF, genes-alvo e alterações na expressão do marcador EMT. Além disso, descrevemos a transdiferenteação das células tumorais epiteliais de mamina mesenquimal Py2T em adipócitos. Métodos para examinar a sinalização induzida pelo TGF-β e o EMT no câncer de mama podem contribuir para novas abordagens terapêuticas para o câncer de mama.

Introdução

A citocina transformadora fator de crescimento-β (TGF-β) é o protótipo de um grande grupo de polipeptídeos regulatórios estrutural e funcionalmente relacionados, incluindo TGF-βs (ou seja, TGF-β1, -β2 e -β3), proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) e ativações1,2. Todas essas citocinas desempenham papéis importantes no desenvolvimento embrionário e na manutenção da homeostase tecidual e órgão3. A desregulamentação incorreta do TGF-β pode levar a uma grande variedade de doenças, incluindo o câncer4,5. O TGF-β desempenha um papel complexo e duplo na progressão do câncer: nas células epiteliais normais e pré-malignas, o TGF-β se comporta como um supressor de tumor, inibindo a proliferação e induzindo apoptose6,7; no entanto, no estágio final da progressão do tumor, quando as respostas citostáticas são bloqueadas pela ativação de oncogenes ou perda de genes supressores tumorais, O TGF-β atua como um potencializador de tumores promovendo a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em células cancerosas, permitindo assim a invasão de células cancerígenas e metástases, agindo sobre células no microambiente tumoral e estimulando a angiogênese e a evasão imunológica8,9,10.

O TGF-β é secretado como uma molécula precursora inativa contendo o terminal de carboxy-terminal maduro TGF-β e peptídeo associado à latência (LAP)11. Este pequeno complexo pode ser covalentemente ligado por proteína latente de ligação TGF-β (LTBP)12. A liberação de TGF-β maduros pode ser mediada pela ação de proteases específicas que cortam LAP ou pelo puxão mecânico de LAP em um processo dependente de integrin13,14. Além do LTBP, a Glicoproteína A repetições predominantes (GARP) é altamente expressa na superfície das células T regulatórias (Tregs) e desempenha um papel semelhante ao LTBP na regulação da ativação do TGF-β15,16. O GARP liga-se diretamente ao TGF-β latente através de linkagem de dissulfeto e associação não covalente. A ativação do TGF-β do complexo GARP/TGF-β requer integrins17. TGF-β maduro se liga aos receptores de quinase serina/threonina β TGF, ou seja, receptores TGF-β tipo I (TβRI) e TGF-β tipo II (TβRII)receptores 18 para iniciar a sinalização. A vinculação do TGF-β à TβRII promove o recrutamento de TβRI e a formação de um complexo heteromérico. Posteriormente, o TβRI é fosfoilado por TβRII quinase em resíduos de serina e threonina em um breve motivo glicina e serino-rico (GS), resultando em sua ativação19,20. Após a ativação, o TβRI ativado recruta e fosfolam seus substratos: os dois SMADs específicos do receptor (R-SMADs) que incluem SMAD2 e SMAD3(Figura 1). Os R-SMADs compartilham uma estrutura global semelhante com dois dos chamados domínios de homologia louca, MH1 e MH2, que são separados por uma região de linker rica em proline(Figura 2). O motivo de ligação de DNA dentro do domínio MH1 do SMAD3 não é conservado entre SMAD2 e SMAD3, e o SMAD2 não pode ligar diretamente o DNA por causa de duas inserções em seu domínio MH1 (exon 3 e L1). SMAD2 e SMAD3 podem ser ativados pela fosforilação do motivo SSXS em seu C-termini (Figura 2). O SMAD2/3 fosforilado forma complexos heteroméricos com um mediador SMAD comum, SMAD4, que se transloca para o núcleo para modular a transcrição de genes-alvo(Figura 1)7,21. Essa via de sinalização canônica do SMAD é precisamente regulada e gera respostas celulares e teciduais específicas, como a regulação do destino celular e da metástase celular tumoral e a invasão22. Além da sinalização TGF-β-SMAD, as vias de sinalização não-SMAD também podem ser ativadas diretamente por receptores para regular as respostas celulares a jusante23.

Durante a progressão do tumor, a ativação de vias dependentes de SMAD induzidas por TGF β e vias independentes de SMAD são necessárias para a indução do EMT. O EMT é um processo reversível no qual as células tumorais diferem de um fenótipo epitelial, que está associado à perda de contatos celulares-células e diminuição da polaridade apical-basal, a um fenótipo mesenquimal com motilidade aprimorada e capacidade de invasão24. O EMT é caracterizado pelo aumento da expressão de proteínas marcadores mesenquimais, incluindo N-cadherin, vimentina, Zeb2 e Snail1/2, e a regulação concomitante de marcadores epiteliais, como E-cadherin e β-catenin(Figura 3)25. No entanto, a transição de um epitelial para um estado mesenquimal é muitas vezes incompleta, e as células ganham características epiteliais e mesenquimais (E/M). Um artigo recente da Associação Internacional emIT propôs descrever o processo de células submetidas a estados fenotípicos intermediários de E/M como plasticidade epitelial-mesenquimal (EMP)26. Essa plasticidade refere-se a EMT parcial, um status híbrido de E/M, um estado emt metast, um contínuo EMT e um espectro EMT26. Durante o EMT, as células tumorais ganham propriedades de células-tronco cancerosas (CSC) e se tornam mais resistentes à apoptose induzida pelo descolamento27. Enquanto o EMT é responsável pela aquisição de um fenótipo invasivo em células tumorais primárias e impulsiona a progressão do câncer, em contraste, a transição mesenquimal-epitelial (MET) tem mostrado desempenhar um papel importante no crescimento das células tumorais disseminadas em locais metastáticos distantes28,29. Um estudo recente demonstrou que as células cancerígenas de mama derivadas do EMT podem ser transdiferenciadas em adipócitos, o que pode oferecer uma oportunidade para inibir a metástase e superar a resistência terapêutica em células tumorais e câncer recaído30. Devido ao importante papel da sinalização TGF-β na ativação do EMT na carcinogênese mamária, apresentamos protocolos detalhados para a mancha ocidental, um ensaio de repórter transcricional luciferase, reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) e imunofluorescência para a investigação de sinalização TGF-β, EMT induzido por TGF-β e a transdiferenciação de células tumorais de epiteliais mamárias hídrinas derivadas do EMT em adipóstos. Essas técnicas são as ferramentas analíticas mais utilizadas no campo da biologia celular. qRT-PCR é usado para detectar, caracterizar e quantificar os níveis de expressão mRNA de forma quantitativa. Em comparação com o PCR quantitativo (qPCR), uma técnica alternativa, a transcrição reversa (RT)-PCR pode ser usada para determinar a expressão mRNA de forma semi-quantitativa31,32. A mancha ocidental é usada para examinar níveis específicos de proteína em uma determinada amostra de lise celular com vantagens de sensibilidade e especificidade, de forma semi-quantitativa. Assim, apresentamos um fluxo de trabalho sistemático para analisar mudanças da expressão genética à expressão proteica para ajudar a investigar a sinalização TGF-β que também pode ser aplicada a outras vias de sinalização.

Protocolo

1. Análise da fosforilação SMAD2 induzida por TGF-β usando manchas ocidentais

NOTA: As células mcf10A-ras de mama humana pré-maligna foram usadas como exemplo para investigar respostas de sinalização TGF-β33. Em princípio, os métodos descritos abaixo também são aplicáveis a outras linhas celulares com resposta à β TGF.

  1. Cultura a linha de células epiteliais mamárias MCF10A-Ras a 37 °C no meio modificado da Águia (DMEM)/F12 de Dulbecco contendo L-glutamina com 5% de soro de cavalo, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina 10 mg/mL, 100 ng/mL enterotoxina, 0,5 mg/mL hidrocortisona e 1:100 penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
  2. Trippsinize células MCF10A-Ras com 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA por 1 minuto e conte células viáveis usando um contador de células.
  3. Células de sementes em placas de 6 poços a uma densidade de 5×105 células/bem.
  4. Após o crescimento noturno, trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% de albumina de soro bovino livre de ácido graxo (BSA) por 1 hora, e depois remova o meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS).
  5. Células frias em placas de 6 poços no gelo e adicionam 150 μL de amortecedor de precipitação imunológica de rádio pré-cozido (RIPA) tampão de lise (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desoxicação de sódio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 e coquetel inibidor de mini protease recém-adicionado). Deixe a lise continuar no gelo por 10 minutos.
  6. Raspe as células aderentes do prato usando um raspador de células plásticas, em seguida, transfira suavemente a suspensão da célula para um tubo de microcentrifuge pré-cozido.
  7. Centrifugar a célula lysate por 10 minutos a 150 força centrífuga(x g) a 4 °C e transfira o supernante para um tubo de microcentrifuuge fresco de 1,5 mL.
  8. Meça a concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteína compatível com detergente (DC).
  9. Carregue 30 μg de proteína de cada amostra em um gel de gel de polifamese de sulfato de sulfato de sódio de 10% de sódio (SDS-PAGE) e execute o gel a uma tensão de 100 V por 1,5-2 horas.
  10. Transfira as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinida de 45 μm (PVDF) a uma tensão de 110 V por 1-1,5 horas.
  11. Transfira a membrana PVDF para um recipiente apropriado com o lado da proteína (o lado que estava voltado para o gel) para cima, e enxágue brevemente a membrana em água destilada.
  12. Descarte a água, adicione a solução Ponceau S e coloque a membrana em uma plataforma de balanço por 1-2 minutos.
  13. Descalgue a membrana com água destilada enxaguando-a rapidamente e depois lavando-a por 1 minuto.
  14. Em seguida, coloque a membrana PVDF em uma caixa de luz, e tire uma foto para verificar se há cargas totais de proteínas iguais.
  15. Lave a membrana com soro fisiológico tris-tampão com Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) até que não haja coloração visível.
  16. Coloque a membrana no tampão de bloqueio (5% de leite desnatado na solução TBST) e incuba-a por 1 hora à temperatura ambiente.
  17. Lave a membrana duas vezes com TBST.
  18. Incubar a membrana com anticorpos primários contra fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, caseiro 34), total SMAD2/3 1:1000 e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1:1000), durante a noite a 4 °C.
  19. Lave a membrana duas vezes com TBST e incuba a membrana com um anticorpo secundário contra coelho ou rato (1:5000) por 2 horas.
  20. Incubar a membrana PVDF com substrato ECL ocidental por 30 segundos e detectar o sinal usando um sistema de imagem.
  21. Repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.

2. Análise das respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas pelo TGF-β

  1. Realize o ensaio de repórter transcricional SMAD3/SMAD4 dependente da12-luciferase.
    1. Cultura e experimentpsinize células MCF10A-Ras como descrito no Passo 1. Células de sementes em placas de 24 poços a5×10 4 células/bem e permitem que as células aderam durante a noite.
    2. No dia seguinte à semeadura, cotransfeito as células em cada poço com 100 ng do TGF-β/SMAD3-indutível (CAGA)12 repórter transcricional de luciferase construem35 e 80 ng da construção de expressão β-galactosidase usando polietilenimina (PEI). A transfecção de β-galactosidase é usada para normalizar diferenças na eficiência de transfecção entre diferentes poços. Criar todos os grupos experimentais em triplicado.
    3. Após 24 horas de incubação, as células de fome com glicose DMEM sem soro e, 6 horas depois, adicionam TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) como controle de veículo para as células.
    4. Depois de mais 24 horas de incubação, lave as células duas vezes com PBS pré-armado.
    5. Adicione 120 μL/bem 1× tampão de lise e agite suavemente a placa a 4 °C por 20 minutos.
    6. Transfira 30 μL de lise para cada poço de uma microplacão de ensaio branco de 96 poços para medir a atividade da luciferase usando um luminômetro.
    7. Transfira 50 μL de lise para cada poço de uma placa transparente de 96 poços para medir β-galactosidase.
    8. Normalize a atividade luciferase para a atividade β-galactosidase e repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.
  2. Analise a expressão de genes-alvo TGF-β usando reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR).
    1. Cultura e experimentpsinize células MCF10A-Ras como descrito no Passo 1. Células de sementes em placas de 6 poços a5×10 5 células/bem e permitem que as células aderam durante a noite.
    2. Trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) por 6 horas e, em seguida, lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.
    3. Isole o RNA total usando um kit de isolamento de RNA.
    4. Determine a concentração de RNA com um NanoDrop e realize a síntese de cDNA com 1 μg de RNA usando um kit de síntese cDNA de primeira linha.
    5. Use um sistema de detecção pcr em tempo real em tempo real para executar o PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) com cDNA diluído dez vezes em uma mistura de reação de 10 μL que inclui primers humanos específicos para frente e para trás para GAPDH (para normalização), SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1, um gene de destino TGF-β/SMAD), SMAD7 (gene alvo TGF-β/SMAD) e qPCR Master Mix. Criar todos os grupos experimentais em triplicado.
      NOTA: As sequências de primer usadas para detectar genes humanos de destino no qRT-PCR estão listadas na Tabela 1.
    6. Use as seguintes condições de reação qPCR: inicialização, 95 °C por 3 minutos; denaturação, 95 °C por 10 segundos; ressaring, 60 °C por 30 segundos; e extensão, 80 °C por 10 segundos; denaturação, ressarem e extensão são repetidas 40 vezes.
    7. Repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.

3. Análise do EMT induzido por β TGF

  1. Analise a expressão dos marcadores EMT no nível da proteína usando manchas ocidentais.
    NOTA: A análise do EMT induzido por β TGF é mostrada usando células epiteliais NMuMG do mouse como exemplo36,37.
    1. Cultura NMuMG células a 37 °C em MEMEM-high glicose média suplementada com soro bovino fetal de 10% e 1:100 Pen-Strep. Use métodos descritos no Passo 1 para isolamento e detecção de proteínas.
      NOTA: Os seguintes anticorpos são usados neste experimento: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Caracol, 1:1000; Lesma, 1:1000; Tubulin, 1:1000 (Figura 3).
  2. Analise a expressão dos marcadores EMT no nível mRNA usando PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito na Etapa 2.2.
    NOTA: Todos os primers do mouse usados para qRT-PCR, incluindo CDH1 (codificação da proteína E-cadherin), SNAILe ZEB2 (Figura 3) estão listados na Tabela 1.
  3. Analise o processo EMT usando imunofluorescência indireta e coloração direta de fluorescência.
    1. Coloração indireta de imunofluorescência de E-cadherin
      1. Coloque tampas de vidro quadrada de 18 mm estéreis em placas de 6 poços (uma tampa por poço).
      2. Semente 1×105 células NMuMG com 2 mL de DMEM completo por placa de 6 poços e permitem que as células aderam durante a noite.
      3. Mova suavemente as tampas com células aderentes para uma nova placa de 6 poços e adicione 2 mL de cultura média aos poços.
      4. Trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) por 2 dias.
      5. Remova o meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de PBS pré-armado.
      6. Fixar as células adicionando 1 mL de paraformaldeído de 4% e incubando por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de PBS.
      7. Permeabilize as células fixas com 0,1% Triton X-100 por 10 minutos em temperatura ambiente e lave as células duas vezes com PBS.
      8. Bloqueie as células com 5% de BSA em PBS por 1 hora em temperatura ambiente e lave as células duas vezes com PBS.
      9. Adicione o anticorpo primário contra e-cadherina (diluído 1:1000 em PBS) ao topo de cada deslizamento de cobertura e incubar por 1 hora à temperatura ambiente.
      10. Remova o anticorpo primário e lave o deslizamento com PBS três vezes.
      11. Adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor 555 (diluído 1:500 em PBS) ao topo de cada tampa e incubar por 1 hora à temperatura ambiente enquanto cobre com papel alumínio para proteger da luz.
      12. Remova o anticorpo secundário e lave o deslizamento com PBS três vezes.
      13. Monte o deslizamento (células voltadas para baixo) em lâminas de vidro usando meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e armazene os slides montados em uma caixa a 4 °C, protegido da luz.
      14. Observe a coloração com microscopia confocal SP8.
    2. Coloração de fluorescência direta de fisomante (F)-actin.
      1. Prepare amostras seguindo as etapas 3.3.1.1. para 3.3.1.9.
      2. Manche as células adicionando Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) por 1 hora à temperatura ambiente no escuro para visualizar o fistomante actin (F-actin).
      3. Lave as células três vezes com PBS.
      4. Monte a tampa em lâminas de vidro usando meio de montagem com DAPI e tire imagens com microscopia confocal SP8.

Resultados

Análise da sinalização de TGF-β
O passo chave na sinalização TGF-β é a fosforilação dos dois resíduos de serina terminal mais carboxy no motivo SSXS(Figura 2) por TβRI quinase38,39. Para investigar as respostas de sinalização do TGF-β, realizamos manchas ocidentais de SMAD2 fosforilado. Nas células de mama humana pré-maligna MCF10A-Ras, a fosforilação de SMAD2 aumentou significativamente em resposta à estimulação de β TGF por 1 hora, enquanto a expressão do total de SMAD2/3 não foi afetada pelo tratamento de β TGF(Figura 4A). Usando o ensaio de repórter transcricional CAGA-luc induzido pelo TGF β/4, descobrimos que o TGF-β induziu notavelmente o repórter da luciferase na linha de células MCF10A-Ras em comparação com células não tratadas(Figura 4B). Além disso, observamos que os alvos genéticos transcricionais bem caracterizados de TGF-β incluindo SMAD7 e SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1), foram altamente expressos em células MCF10A-Ras tratadas pelo T β GF(Figura 4C).

Análise do EMT induzido por β TGF
Avaliamos o EMT induzido pelo TGF β com vários métodos, como alterações morfológicas, a expressão de marcadores EMT nos níveis de mRNA e proteína e a coloração da imunofluorescência dos marcadores EMT36. As células epiteliais NMuMG tratadas com TGF-β por 1 e 2 dias mudaram de uma morfologia epitelial clássica para uma morfologia mesenquimal em forma de fuso, como mostrado pela microscopia de contraste de fase(Figura 5A). Consistente com as alterações morfológicas, observamos que o tratamento TGF-β levou a um aumento na expressão proteica de marcadores mesenquimais, incluindo N-cadherin, Caracol e Lesma37 (Figura 5B). Em contraste, a E-cadherina, um marcador epitelial, foi regulada em células NMuMG após 2 dias de tratamento de TGF-β(Figura 5B). Além disso, realizamos reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) para investigar a expressão genética dos marcadores EMT. O CDH1 (codificação da proteína E-cadherin) foi significativamente diminuído, enquanto marcadores mesenquimais como caracol e homeobox de dedo de zinco E-box-binding 2 (ZEB2) foram significativamente aumentados após a estimulação de TGF-β em células NMuMG em comparação com células não tratadas(Figura 5C). O EMT induzido por TGF-β em células NMuMG foi confirmado ainda pela coloração da imunofluorescência da e-cadherina. Após a estimulação TGF-β por 2 dias, as células NMuMG expressaram menos e-cadherina do que as células do grupo controle não induzido, conforme analisado pela microscopia confocal(Figura 5D). Além disso, as células NMuMG na presença de TGF-β formaram mais fibras de estresse actin, como mostra a microscopia confocal (Figura 5E).

SB431542 e GW788388 inibem sinalização TGF-β e EMT induzido por β TGF
SB431542 é um inibidor competitivo da ATP do domínio quinase do TβRI, também chamado de quinase activina semelhante a receptor 5 (ALK5), enquanto GW788388 inibe a atividade de quinase TβRI e TβRII. Ambos os inibidores podem inibir a sinalização do receptor TGF-β40. Assim, tratamos células NMuMG com diferentes concentrações de GW788388 na presença de TGF-β por 1 hora. Como esperado, GW788388 inibiu a fosforilação SMAD2 induzida por TGF β de forma dependente de dose(Figura 6A). Além disso, a fosforilação mediada por TGF-β de SMAD2 foi bloqueada pelo tratamento SB431542(Figura 6A). O SMAD2/3 fosforilado forma um complexo heteromérico com SMAD4 e se transloca para o núcleo para modular a transcrição dos genes-alvo. Por isso, investigamos a translocação de células SMAD2/3 em NMuMG por coloração de imunofluorescência de SMAD2/3. Os dados demonstraram que tanto o SB431542 quanto o GW788388 inibiram significativamente a translocação nuclear induzida pelo TGF-β e o acúmulo de células SMAD2/3 em células NMuMG(Figura 6B). Além disso, os efeitos inibitórios de SB431542 e GW788388 também foram observados nos níveis de expressão mRNA de importantes genes-alvo TGF-β envolvidos no EMT, incluindo PAI-1, SNAIL, E-cadherin e Fibronectin (Figura 6C). Esses dados sugeriram que o SB431542 e o GW788388 bloquearam a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF-β.

Análise da transdiferenteção de células mesenquimais de câncer de mama em adipócitos
O EMT desempenha um papel vital no aumento da plasticidade celular nos cânceres e resulta no desenvolvimento da resistência terapêutica. A plasticidade celular cancerígena pode ser diretamente direcionada e inibida com uma abordagem trans-diferenciação, como a adipogênese forçada30. Utilizamos células cancerígenas de mama de py2T, que eram derivadas da glândula mamária de um vírus mamário de camundongos vírus-polioma médio tumor-antígeno (MMTV-PyMT) transgênico, como um modelo celular de plasticidade celular induzida pelo EMT. Com base em um protocolo estabelecido41,tratamos células cancerígenas de mama py2T derivadas do EMT com a droga anti-diabética rosiglitazone por 10 dias para induzir adipogênese. A adipogênese foi avaliada pela visualização de gotículas lipídicas utilizando manchas vermelhas de óleo O. As células de gordura foram prontamente detectadas em células cancerígenas de mama py2T tratadas com rosiglitazone(Figura 7),que demonstraram que o tratamento apenas com rosiglitazone é suficiente para promover a transdiferenciação de células cancerígenas de mama derivadas do EMT em adipócitos.

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Figura 1: Sinalização TGF-β/SMAD. A sinalização TGF-β inicia-se com a vinculação de TGF-β ao receptor TGF-β tipo II (TβRII), uma quinase constitutivamente ativa, que fosforila TGF-β receptor tipo I (TβRI). Em seguida, ativado TβRI kinase fosforilatos SMAD2/3. Um peptídeo contendo o motivo SSXS de SMAD2 com dois resíduos de serina terminal carboxy foi usado para obter antisera policlonal reconhecendo fosforr-SMAD2 (p-SMAD2). Portanto, a análise da expressão p-SMAD2 por manchas ocidentais pode ser usada para determinar a ativação da via de sinalização TGF-β. O SMAD2/3 fosforilado pode formar complexos heteroméricos com SMAD4, que então se translocam para o núcleo para modular respostas transcricionais. O ensaio de repórter12-luciferase e o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para a expressão mRNA de genes-alvo TGF-β, como SMAD7 e SERPINE1 (codificação de proteína PAI-1), podem ser usados para analisar respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas por TGF-β. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Estrutura esquemática de R-SMADs (SMAD2 e SMAD3). Os domínios MH1 (azul) e MH2 (amarelo) são conservados entre R-SMADs, mas a região do linker (cinza) não é conservada. O domínio MH1 do SMAD3 abriga um motivo de ligação de DNA, enquanto o SMAD2 não pode ligar diretamente o DNA, por causa de uma inserção (exon 3) em seu domínio MH1. O domínio MH2 media a oligomerização do SMAD, interação com receptores TGF-β e vinculação de proteínas e está envolvido na regulação transcricional. SMAD2 e SMAD3 podem ser ativados pela fosforilação do motivo SSXS (em vermelho) em seu termini C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Emt induzido por β TGF. Durante a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β (EMT), as células sofrem perda de epiteliais e aquisição de características mesenquimais com maior motilidade celular e capacidade de invasão. A indução do EMT leva à expressão de marcadores mesenquimais como N-cadherin, Zeb2 e Snail1/2, bem como a baixa regulação de marcadores epiteliais, incluindo E-cadherin, β-catenin e claudin-1. A perda acumulada ou o ganho das características epiteliais/mesenquimais (E/M) faz com que uma célula entre em estados intermediários de forma reversível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Respostas de sinalização TGF-β em células MCF10A-Ras. ( A )Ascélulas MCF10A-Ras foram tratadas com ou sem TGF-β (2,5 ng/mL) por 1 hora, e as células foram imunovaladas para SMAD2 fosforilado (p-SMAD2), total SMAD2/3 e GAPDH (como controle de carga). O marcador de tamanho é mostrado à direita. Contra: Grupo de controle sem tratamento TGF-β. (B) Análise da atividade transcritória TGF-β (5 ng/mL) utilizando o repórter transcricional12-luciferase (LUC) dependente de SMAD3-SMAD4 nas células MCF10A-Ras. Os valores são normalizados para atividade β-galactosidase (βGal). Os dados são expressos como a média ± s.d,n = 3. Teste t do aluno, ***P ≤ 0,001(C)qRT-PCR análise dos genes-alvo TGF-β SMAD7 e SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1) em células MCF10A-Ras tratadas com TGF-β (2,5 ng/mL) por 6 horas. GAPDH foi usado como controle interno. Os dados são expressos como a média ± s.d,n = 3. Teste do aluno, ***P ≤ 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: EMT induzido por β TGF em células NMuMG. (A) Morfologia das células NMuMG tratadas com TGF-β (2,5 ng/mL) por 1 ou 2 dias. Na presença de TGF-β, as células NMuMG transdiferenciadas em um fenótipo mesenquimal. Barra de escala = 150 μm (B) As células NMuMG foram tratadas com ou sem TGF-β (5 ng/mL) por 2 dias, e os marcadores EMT foram analisados por manchas ocidentais. O marcador de tamanho é como indicado à direita. Contra: Grupo de controle sem tratamento TGF-β. (C) Análise da expressão genética dos marcadores EMT(CDH1 (codificação da proteína E-cadherin), SNAIL e ZEB2) em células NMuMG tratadas por 2 dias com TGF-β (5 ng/mL). GAPDH foi usado como controle interno. Os resultados são expressos como a média ± s.d., n = 3. Teste t do aluno, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) As células NMuMG foram manchadas por imunofluorescência para detectar a expressão do marcador epitelial E-cadherin (vermelho) após tgf-β (2,5 ng/mL) tratamento por 2 dias. Os núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). As imagens foram capturadas com microscopia confocal. Barra de escala = 50 μm(E) As células NMuMG foram manchadas com fluoresceína-fhalloidina (verde) para visualizar f-actina. Os núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: TGF-βsignaling e TGF-β induzido EMT foram inibidos por SB431542 e GW788388. ( A )Ascélulas NMuMG foram tratadas com 10 μM de SB431542 (SB) ou as concentrações indicadas de GW788388 (GW) na presença ou ausência de TGF-β (5 ng/mL) durante 1 hora. Os lysatos celulares foram imunoblottados para p-SMAD2, SMAD2/3 e GAPDH. (B) As células NMuMG foram tratadas com 5 μM de SB431542 (SB) ou 10 μM de GW788388 (GW) na presença ou ausência de 5 ng/mL de TGF-β por 1 hora e imunofluorescência manchada para detectar a translocação nuclear de SMAD2/3 (verde). As imagens foram capturadas com microscopia confocal. (C) A expressão de genes alvos TGF-β, incluindo PAI-1 e genes codificando marcadores EMT, incluindo SNAIL, E-Cadherin e Fibronectin, foram analisados por reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) em células NMuMG após tratamento SB ou GW e estimulação TGF-β por 48 horas. GAPDH serviu como um controle de carregamento. O controle denota células não tratadas. Esta figura foi modificada de Petersen M. et al. 34 com permissão do editor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7: Células cancerígenas de mamárias py2T derivadas do EMT podem ser induzidas a se diferenciar em adipócitos. As células cancerígenas de mama murina py2T foram estimuladas com 2 ng/mL TGF-β por 20 dias para induzir o EMT completo. Em seguida, as células foram tratadas com DMSO como controle de veículo ou rosiglitazone (2 μM) por 10 dias para permitir a diferenciação de células cancerígenas mesenquimais e induzir adipogênese. O meio era trocado a cada 2 dias. Após 10 dias de tratamento, as células foram manchadas com óleo vermelho O. Barra de escala = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

espécieNome genéticoPara a frente (5' a 3')Reverso (5' a 3')
humanoGAPDHTGCACCACCAACTGCTTAGCGGCATGGACTGTGGTCATGAG
SMAD7TCCAGATGCTGTGCCTTCCGTCCGAATTGAGCTGTCCG
SERPINE1CACAAATCAGACGGCAGCACTCATCGGGCGTGGTGAACTC
ratoGAPDHTGGCAAAGTGGAGATTGTTGCCAAGATGGTGATGGGCTTCCCG
CDH1ACCAAAGTGACGCTGAAGTCGAGGATGTACTTGGCAATGG
caracolCAGCTGGCCAGGCTCGGTGCGAGGGCCTCCGGAGCA
ZEB2TTCTGCAAGCCTCTGTAGCCTTCTGGCCCCATTGCATCAT

Tabela 1: Primers usados para qRT-PCR.

Discussão

A sinalização TGF-β/SMAD desempenha um papel fundamental na progressão do câncer de mama, pois pode promover a invasão e a metástase celular do câncer de mama induzindo o EMT7. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho lógico para investigar a sinalização iniciada pelo TGF β desde a ativação SMAD induzida por receptores até respostas transcricionais e biológicas mediadas pelo SMAD. Começamos descrevendo a análise da fosforilação SMAD2, continuamos com respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas pelo TGF-β e expressão de marcadores emIT nos níveis genéticos e proteicos para analisar a resposta de sinalização TGF-β/SMAD, e finalmente examinou o EMT induzido pelo TGF β. Utilizamos o repórter transcricional12-luciferase contendo caixas derivadas do promotor PAI-1, para monitorar a atividade da via de sinalização TGF-β/SMAD35. Esta construção de repórter requer SMAD3 e SMAD4 para ativação. Estudos anteriores mostraram que o knockdown do SMAD4 atenuado a atividade12-luciferase induzida por TGF β 437. Além do ensaio do repórter, determinar o status de fosforilação de SMADs endógenos, incluindo SMAD2 e SMAD3, é outra maneira de investigar a resposta de sinalização TGF-β. De fato, outros membros da família TGF-β, como o fator de crescimento e diferenciação (GDF)-8/myostatina e GDF-9, também transduzem sinais via proteínaS SMAD2/3, engajando o TβRI42,43,44. Além do repórter12-luciferase, vários repórteres semelhantes têm sido usados para detectar a ativação da sinalização de TGF-β. Por exemplo, um repórter transcricional (SBE)4-Lux com elementos de resposta derivados do promotor junb pode ser eficientemente induzido por TGF-β, ativações e BMPs45.

Manchas ocidentais e qPCR foram usados para analisar o EMT induzido pelo TGF-β, que são métodos clássicos para investigar a expressão de marcadores epiteliais (ou seja, E-cadherin) e marcadores mesenquimais (ou seja, N-cadherin, Caracol, Lesma e Zeb2). Também foram realizadas colorações indiretas de imunofluorescência de E-cadherin e coloração direta de fluorescência de F-actin. Esses ensaios validaram ainda mais o fenótipo mesenquimal das células após o tratamento de TGF-β. A limitação da coloração da imunofluorescência é que as células precisam ser fixadas antes da incubação com anticorpos e imagens, e é difícil investigar mudanças na expressão do marcador DET em células vivas. Recentemente, o projeto de linhas celulares de repórteres emT, como adenocarcinoma-vimentin-RFP, tornou possível monitorar a transformação de células epiteliais para células mesenquimais em tempo real através da expressão de vísquia fluorescente vermelha (RFP) marcada. Esta plataforma poderia ser utilizada para triagem de medicamentos e desenvolvimento de novas drogas46. O corante LifeAct, um peptídeo de 17 aminoácidos, que pode manchar estruturas F-actin em células vivas, está se tornando uma ferramenta valiosa para visualizar o citoesqueleto actin em tempo real sem interferir nos processos celulares47. Neste estudo, foram utilizados dois inibidores de pequenas moléculas, SB431542 e GW788388, para validar seu efeito inibidor na sinalização de β TGF e no EMT induzido pelo TGF-β. Notavelmente, GW788388 inibe potentemente a atividade TβRI e TβRII, enquanto o SB431542 tem um efeito inibidor apenas no TβRI (e ALK4 e ALK7). Estudos anteriores revelaram que o GW788388 é mais potente in vivo do que o SB43154240. Além da inibição do EMT, a GW788388 reduziu a expressão de marcadores de fibrose no rim, e a administração oral de GW788388 em camundongos diabéticos diminuiu significativamente a glomerulopatia25,48.

O EMT desempenha um papel essencial na promoção da plasticidade celular do câncer e resulta na resistência a medicamentos e metástase 49. Portanto, o direcionamento de células derivadas do EMT com drogas citotóxica específicas50 ou induzindo a redifferentição através da transição mesenquimal-epitelial (MET)51 foi proposto como uma abordagem para superar a metástase celular do câncer e a resistência à terapia. No entanto, o MET contribui para a proliferação de células cancerígenas disseminadas em órgãos distantes52, o que pode ser contraproducente ao usar a reversão terapêutica do EMT. Recentemente, um novo estudo relatou uma abordagem de transdiferenciação terapêutica, visando diretamente as células cancerígenas de mama derivadas do EMT para diferenciação em adipócitos30. O estudo de Ishay-Ronen et. al.30 usaram células cancerígenas epiteliais de murina Py2T que haviam sido submetidas a uma transição para células mesenquimais em resposta ao tratamento de longo prazo com TGF-β. Eles demonstraram que rosiglitazone em combinação com inibidores MEK aumentou a diferenciação epitelial e a adipogênese. No entanto, descobrimos que a rosiglitazone por si só era suficiente para induzir a transdiferenteção de células murinas py2T mesenquimais em adipócitos.

Em resumo, os métodos utilizados neste estudo forneceram um fluxo de trabalho lógico para investigar a sinalização de β TGF e o EMT induzido pelo TGF-β. Os dois inibidores, SB431542 e GW788388, podem bloquear respostas induzidas pelo TGF-β e EMT. Além disso, também demonstramos que a rosiglitazone sozinha induz a adipogênese em certas células de câncer de mama mesenquimais induzidas por TGF β. Embora tenhamos usado apenas várias linhas de células cancerígenas de mama para investigar respostas de β TGF, os métodos descritos aqui poderiam ser extrapolados para outras células (câncer). Aqui, usamos várias concentrações de β TGF para induzir respostas celulares. Na maioria dos tipos de células, o TGF-β exerce sua atividade biológica na faixa de concentração de 0,01-10 ng/mL53 e induz a sinalização em um padrão de dose-resposta. Nas células endoteliais primárias, incluindo células endoteliais aórticas bovinas, TGF-β induziu a expressão substancial de SMAD2 fosforilado a 0,025 ng/mL, atingiu o máximo de 0,25 ng/mL, e permaneceu neste nível em resposta a concentrações mais elevadas53. Em nosso estudo, utilizamos uma alta concentração de TGF-β (5 ng/mL) em células MCF10A-Ras para o ensaio de repórter transcricional para obter respostas fortes. A fosforilação SMAD2 e a expressão genética alvo podem ser induzidas pelo TGF-β em uma dose baixa; assim, utilizamos 2,5 ng/mL TGF-β para tratar células. No entanto, a concentração de trabalho mais adequada depende do tipo celular e dos efeitos estimados. Para determinar a melhor concentração de TGF-β, recomenda-se tratar as células com diferentes doses (de baixo a alto).

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Reconhecemos o apoio do Conselho de Bolsas Chinesa (CSC) ao J.Z. and Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC). NL) para P.t.D.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
18 mm de lado lamínulas de vidro quadradasMenzel Glä ser631-1331
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200
Alexa Fluor 488 FaloidinaThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 555 anticorpo secundárioThermo Fisher ScientificA-21422
Anticorpo anti-E-caderinaBD Biosciences610181
anticorpo anti-gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH)Merck MilliporeMAB374
Anticorpo anti-N-caderinaBD Biosciences610920
Anticorpo anti-SlugTecnologia de sinalização celular9585
anti-SMAD2 / 3Becton Dickinson610842
Anticorpo anti-caracolTecnologia de sinalização celular3879
Anticorpo anti-tubulinaTecnologia de sinalização celular2148
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA2058
Enterotoxina de cóleraSigma-AldrichC8052
Clareza Western ECL SubstratoBio-Rad1705060
kit de ensaio de proteína DCBio-Rad5000111
DMEM-glicose altaThermo Fisher Scientific11965092
DMEM-meio de glicose altaThermo Fisher Scientific11965092
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific11039047
fator de crescimento epidérmico (EGF)Merck Millipore01-107
Soro fetal bovino (FBS)BioWestS1860-500
GoTaq qPCR Master MixPROMEGAA600X
Soro de cavaloThermo Fisher Scientific26050088
HidrocortisonaSigma-AldrichH0135
InsulinaSigma-Aldrich91077C
Mini Inibidor de Protease CoquetelRoche11836153001
NucleoSpin RNA II kitBIOKE&AGUDO;
Penicilina-estreptomicina (Pen-Strep)Thermo Fisher Scientific15140148
Polietileninimina (PEI)Polyscience23966
Membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
solução Ponceau SSigma-AldrichP7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificK1621
RosiglitazoneSigma-Aldrich557366-M
Leite desnatadoCampina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad17001402
CFX Connect Detection SystemBio-Rad1855201
LuminômetroPerkin Elmer2030-0050
NanoDrop 2000/2000c EspectrofotômetrosThermo Fisher ScientificND-2000
740955

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells
Posted by JoVE Editors on 12/15/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. NMuMG was mislabeled as cancer cells.

NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-β in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

Etiquetas

Sinalização de TGF-betaFosforilação de SMAD2Western BlottingRepórter de LuciferaseqRT-PCRColoração de E-caderinaMicroscopia ConfocalGW788388SB431542
Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais
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