Fluxo de trabalho de tomografia de array para a aquisição direcionada de informações de volume usando microscopia eletrônica de varredura

Summary

Descrevemos a preparação de fitas de seções seriais e sua coleção em grande suporte de transferência para uso como amostras de tomografia de array, juntamente com procedimentos automatizados de imagem em um microscópio eletrônico de varredura. O protocolo permite a triagem, recuperação e imagens direcionadas de eventos locais, raros e a aquisição de grandes volumes de dados.

Abstract

A microscopia eletrônica é aplicada em biologia e medicina para imagens de detalhes celulares e estruturais na resolução de nanômetros. Historicamente, a Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) forneceu uma visão da ultraestrutura celular, mas na última década, o desenvolvimento dos modernos microscópios eletrônicos de varredura (SEM) mudou a maneira de olhar dentro das células. Embora a resolução do TEM seja superior quando são necessários detalhes estruturais de nível proteico, a resolução sem é suficiente para a maioria das questões relacionadas à biologia celular de nível organela. O avanço da tecnologia possibilitou soluções automáticas de aquisição de volume, como imagem serial de face de bloco (SBF-SEM) e feixe de íons focados SEM (FIB-SEM). No entanto, até hoje, esses métodos permanecem ineficientes quando a identificação e navegação para áreas de interesse são cruciais. Sem os meios para localização precisa de áreas alvo antes da imagem, os operadores precisam adquirir muito mais dados do que precisam (na SBF-SEM), ou, pior ainda, preparar muitas grades e imagem de todas (no TEM). Propomos a estratégia de "triagem lateral" utilizando a Tomografia Matriz no SEM, que facilita a localização de áreas de interesse, seguida de imagem automatizada da fração relevante do volume total da amostra. Amostras de tomografia são conservadas durante a imagem, e podem ser organizadas em bibliotecas de seção prontas para imagens repetidas. Vários exemplos são mostrados em que a triagem lateral nos permite analisar detalhes estruturais que são incrivelmente desafiadores para acessar com qualquer outro método.

Introduction

Apesar da importância das técnicas relacionadas ao EM, o esforço necessário para dominá-las mantém todo o campo restrito a um pequeno número de especialistas. Uma dificuldade significativa é a identificação e recuperação de uma Região de Interesse (ROI) nas amostras preservadas para EM. O aparecimento da mesma amostra difere consideravelmente quando analisado por microscopia óptica e após o processamento para observação EM. As alterações para amostras quimicamente preparadas incluem o encolhimento da amostra anisotropica após as etapas de desidratação (~10% em cada dimensão) e a perda de fluorescência ao usar o ósmio no protocolo de fixação e coloração(Figura 1A). Para a secção ultrathin, as amostras são incorporadas em resinas epóxi ou acrílicas utilizando diferentes estratégias(Figura 1B). Para resultados bem-sucedidos desta preparação, toda a amostra deve ser fracionada em pedaços que não excedam 1 mm x 1 mm. Para atender aos requisitos padrão das condições de observação da Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM), esta pequena porção da amostra é ainda mais seccionada para fatias de 50-150 nm de espessura. As imagens resultantes em escala de cinza mostram a organização tecidual e a estrutura organela de uma fração minuciosa de toda a amostra em maior detalhe do que qualquer outra técnica de microscopia(Figura 1C). Um conjunto de dados tem típico fornece informações 2D, teoricamente extrapoladas para entender os processos que ocorrem naturalmente em um espaço 3D em células e tecidos. A Figura 1D apresenta o desafio da aquisição de volumes ultraestruturais: se um cubo de 1.000 μm lateral for seccionado com 50 nm de espessura, 20.000 seções serão necessárias para cobrir todo o volume; para um cubo lateral de 500 μm, serão 10.000 seções. Para cobrir um volume de 50 μm x 50 μm x 50 μm, 1.000 seções "apenas" podem ser necessárias. Obter esse volume manualmente é praticamente impossível e extremamente desafiador para realizar com automação. Se, além da profundidade da amostra, precisarmos cobrir toda a superfície desses cubos hipotéticos, a cobertura de 1 μm² superfície em resolução razoável torna-se uma questão logística séria(Figura 1E). Embora para os projetos extraordinários em larga escala, como abordagens de connectômica, o grande número de seções é crucial, para a maioria dos projetos EM "mundanos", gerar mais seções necessárias para a observação apresenta uma desvantagem significativa.

Existem vários métodos para adquirir informações ultraestruturais 3D: seção serial De Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), tomografia TEM, Tomografia de Array (AT), Microscopia eletrônica de varredura de imagens de bloco serial (SBF-SEM) e Microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focado (FIB-SEM). As principais diferenças entre esses métodos são a estratégia de secção e se a aquisição de imagem está acoplado à seção geração¹. Na seção serial TEM, seções sequenciais são coletadas em grades de ranhura, imagens TEM são geradas a partir dessas sequências e alinhadas^2,3,4,5. Na tomografia TEM, a série de inclinação de 150-300 nm seções em uma grade, e quando acoplado à seção serial, fornecem uma resolução muito alta, embora relativamente pequenos volumes^6,7,8. A abordagem AT usa seção física com diversas formas manuais e semiautomáticas de seções de coleta em suporte relativamente grande, como tampas de vidro, wafers de silício ou uma fita especial. Para aquisição de imagens, o suporte é analisado no SEM, com diversas estratégias de aquisição de imagens disponíveis^{9,10,11,12,13,14,15} . Para a SBF-SEM, a secção física é realizada utilizando-se um mini-microtómeo com uma faca de diamante fixada diretamente dentro da câmara SEM, com a imagem SEM gerada a partir da superfície do bloco de resina^16,17,18,19. Para o FIB-SEM, a fonte de íon remove camadas finas da amostra, seguida de imagem automática da superfície exposta pelo SEM^20,21. A TEM-tomografia e o AT geram seções físicas, que podem ser reimagem, se necessário, enquanto FSBF-SEM e FIB-SEM eliminam a seção após a imagem. Uma combinação recente de seções físicas imagens por um SEM multi-feixe fornece uma combinação de métodos que resolve o problema do "gargalo" da velocidade de aquisição de imagem²². Cada uma dessas técnicas revolucionou a forma como os dados EM podem ser obtidos e analisados, e cada abordagem tem seus impactos práticos relacionados a uma determinada questão de pesquisa.

Dada a natureza da preparação e a escala das dimensões ultraestruturais, não é simples prever onde uma estrutura alvo específica está localizada no bloco amostral (Figure1D,E). Uma solução para a localização do ROI é gravar as imagens de todo o bloco na resolução desejada desde o início. As estruturas de interesse podem estar no volume de dados adquiridos quando longe do microscópio. O tempo de aquisição e o manuseio de dados associados a essa estratégia são problemáticos. É desejável reduzir a quantidade de dados registrados, especialmente se os ROIs forem muito menores do que o bloco tecidual, ou seja, se os objetos de interesse são tipos específicos de células (não órgãos inteiros). Diferentes técnicas correlativas de luz e microscopia eletrônica (CLEM) podem ser bem sucedidas quando a fluorescência for preservada e localizada antes ou depois da preparação dentro da mesma amostra^{23,24,25,26,27,28,29}. No entanto, muitas estruturas celulares são reconhecíveis mesmo sem correlação de fluorescência, apenas com base na ultraestrutura conhecida. Para esses casos, acreditamos que a tomografia do Array de triagem lateral proporciona uma troca de equilíbrio entre o esforço investido na localização do ROI e a qualidade da informação ultraestrutural. Usando essa estratégia, um subcontrato de seções no wafer é exibido dentro de intervalos regulares, que podem ser estabelecidos com base no tamanho e natureza do ROI. Uma vez encontradas ROIs, a aquisição de dados é configurada em uma série contínua de seções que começam antes e terminam após a seção âncora, coletando as informações relevantes de forma direcionada.

Apresentamos protocolos para AT que simplificam e aceleram a aquisição de regiões ou eventos de interesse em inúmeras seções e produzem volumes de imagem mais alinhados. A triagem lateral e a aquisição de várias etapas produzem dados com resolução muito alta em regiões precisamente visadas. O procedimento que descrevemos aborda vários desafios da aquisição de dados 3D EM, como prevê: compatibilidade com uma ampla gama de espécimes sem alterar fundamentalmente o fluxo de trabalho de preparação da amostra; localização direcionada para secção e aquisições de SEM; tempo e esforço reduzidos durante a configuração; imagem de regiões em múltiplas seções com melhor alinhamento dos volumes resultantes; e um procedimento de costura e alinhamento suave para compilar diferentes imagens em uma imagem de mosaico costurada. Optamos por demonstrar a força do nosso método com várias amostras de projetos publicados e em andamento. Acreditamos que essa abordagem pode facilitar significativamente a geração e aquisição de dados EM direcionados, mesmo para pesquisadores com experiência em EM limitada.

Protocol

NOTA: Os métodos de preparação da amostra são descritos em outros lugares^14,30,31, e não estão cobertos nesta publicação. Em suma, os exemplos mostrados foram quimicamente fixados com glutaraldeído, pós-fixado com 1% osO₄, depois tratados com acetato aquoso de uranyl antes de incorporar na resina de incorporação. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas usando congelamento de alta pressão, congelamento substituído por acetato de 0,1% de urano em acetona e embutido em resina acrílica. Os blocos amostrais foram preparados utilizando-se um método de incorporação plana que permite uma visão clara da amostra, facilitando sua orientação para a secção (Figura 1B).

1. Procedimento de geração de matriz

1. Orientação e aparamento de amostras incorporadas
   1. Usando o binóculo/microscópio, identifique e marque o ROI na superfície do bloco incorporado, arranhando levemente a superfície do bloco com uma lâmina de barbear. Isso ajudará a orientar a amostra dentro do ultramicroome e reduzirá a superfície de secção.
   2. Fixar a amostra no suporte ultramicrotome(Figura 2A).
   3. Corte a resina ao redor da amostra, primeiro com a lâmina de barbear (aparador áspero) e continue com a ferramenta de corte de diamante (aparador fino; Figura 2A). Use facas com inclinação de borda de 20° ou 90° para garantir que as superfícies superior e inferior do bloco sejam paralelas à borda de corte da faca.
      NOTA: Esta etapa é fundamental para secção serial e aquisição de fitas retas.
   4. Misture xileno e cola em proporção 3:1. Com um cílio preso a um palito, aplique esta mistura na parte superior e nas bordas inferiores do bloco aparado. Deixe secar bem.
2. Prepare o suporte de montagem da matriz A (ou seja, wafers de silício).
   1. Corte a peça do wafer usando uma ferramenta de corte de wafer (EMS), ajustando seu tamanho à meta do projeto. 2 cm x 4 cm é conveniente para observações de microscopia de luz e elétrons.
   2. Limpe o wafer em água destilada para se livrar dos escombros.
   3. Descarga de brilho/plasma limpa a superfície usando equipamento padrão. Os parâmetros precisos dependerão da máquina utilizada. Comece com os parâmetros para a descarga das grades e ajuste empiricamente o tempo. Esta etapa é crucial para uma boa disseminação das seções no suporte enquanto as seções estão secando e não devem ser omitidas.
3. Prepare o suporte de montagem de arrays B (ou seja, deslizamento de tampa de vidro)
   1. Se planejar experimentos de imuno-rotulagem multiplex, transfira as amostras em um deslizamento de cobertura para detectar melhor o sinal de fluorescência. Para melhorar a adesão ao deslizamento de tampas, use um procedimento detalhado de revestimento de gelatina é descrito anteriormente⁹.
   2. Aumente a condutividade revestindo os slides com o índio-estanho-óxido (ITO) ou ouro por evaporação. Mantenha as tampas preparadas em um ambiente limpo. Descarreto de brilho as amostras descritas em 1.2.3.

2. Secção da amostra

1. Preparação de facas AT
   NOTA: Para gerar as matrizes, utilize uma faca modificada (ATS), projetada para facilitar a aquisição de fitas longas. Facas Histo-Jumbo ou facas similares concebidas para a geração das seções em grandes suportes também podem servir para secções AT.
   1. Coloque a agulha na parte inferior da faca usando a fita adesiva espumosa e fure-a(Figura 2B). Coloque a faca ATS no suporte ultramicroome a 0°. Ajuste a borda da faca paralela à superfície do bloco usando o procedimento padrão.
   2. Leve o bloco aparado para a borda da faca em uma posição pronta para secção.
   3. Coloque o wafer/tampa dentro da bacia da faca e encha-o com água ao mesmo nível da borda da faca. Deixe a borda de diamante da faca umidificar corretamente e, se necessário, retirar a água usando a seringa presa(Figura 2C).
2. Secção e transferência de matrizes
   1. Defina o microtome aos parâmetros de corte desejados. Com a faca ATS, a distância de 50-100 nm e uma velocidade de corte de 0,6-1 mm/s são aconselháveis. Iniciar a secção (Figura 2Di).
   2. Obtenha uma fita do comprimento que cobrirá um z-volume direcionado e pare a coleção. Dependendo do tamanho do bloco, homogeneidade do tecido e tipo de resina, a fita será relativamente reta(Figura 2D-ii). Muitas amostras não produzirão fitas retas, apesar do esforço investido e do tipo de faca é usada.
   3. Dependendo do objetivo final, faça uma fita longa ou várias curtas alinhadas lado a lado. Um suporte de 2 cm x 4 cm pode convenientemente conter de 100 a 1.000 seções. O arranjo da fita na etapa de suporte é um passo que requer destreza e mãos firmes. No entanto, a curva de aprendizado para essa habilidade é rapidamente adquirida.
   4. Retire a fita da ponta da faca usando uma ponta limpa e antiaderente de um cílio colado no palito(Figura 2Diii).
   5. Usando o cílio, mova suavemente a fita acima do centro do meio de suporte. Neste ponto, use clorofórmio ou caneta de aquecimento para alongamento das seções, se necessário. No entanto, lembre-se que essa manipulação pode induzir a quebra e deformação da fita.
   6. Comece a drenar a água puxando a seringa. Para fitas mais delicadas ou uma retração de água mais lenta, deixe a água gotejar, desprendendo a seringa da mangueira. Quando o nível da água estiver baixando para o nível do wafer, controle a fita e reposicione-a, se necessário, empurrando suavemente a fita para o centro. Depois de fixar as fitas na superfície do wafer, continue drenando até que a água restante seja completamente retirada da bacia.
      NOTA: Se não usar a faca ATS de retração de água inferior, reduza cuidadosamente a água das laterais da faca ATS para não induzir turbulência.
   7. Deixe as seções no suporte dentro do banho para deixar secar completamente. Dependendo da hidroofobidade do nível de apoio e umidade ambiental, a água evaporará a uma taxa diferente(Figura 2Div). É importante deixar a amostra secar lentamente para diminuir ou evitar todas as dobras na amostra.
   8. Transfira a amostra seca para uma caixa bem fechada para proteger contra a contaminação da sujeira e coloque-a em um forno de 60 °C por pelo menos 30 minutos. Se necessário, contra-retiver seções usando metais pesados para melhorar o contraste geral.
   9. No final do procedimento, limpe cautelosamente a faca seguindo as instruções do fabricante
      NOTA: A transferência de seções múltiplas ou seriais em um wafer(Figura 2E) em comparação com a transferência em uma grade de ranhura(Figura 2F) altera totalmente a experiência de preparação em EM. A seção ininterrupta e a coleta das seções em suporte único reduz a quantidade de erros relacionados à seção e à coleta de seções frequentes na seção serial. O equivalente a 100 seções de 1000 μm x 500 μm coletadas em um wafer corresponde a 33 grades de ranhura(Figura 2G).

3. Observação da amostra

NOTA: Esta seção descreve as etapas do fluxo de trabalho implementadas usando um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Qualquer software de aquisição de imagem em qualquer SEM equipado com os detectores corretos pode ser usado, no entanto, as ações específicas do usuário diferem e muitas vezes serão mais manuais.

1. Adquira um mapa de visão geral das imagens SEM que revela os locais da seção no wafer. Uma imagem de câmera óptica incorporada ajuda na definição de um mosaico de imagem SEM que cobre uma fita de seções ou todas as seções. Crie o mosaico clicando-arraste com o mouse à direita na imagem da câmera da amostra e inicie a Aquisição Automática.
   NOTA: Configurações de imagem muito grosseiras, ou seja, tamanho de pixel de 1-2 μm e 1 μs de tempo de moradia suficiente. Esse processo é ilustrado em Material Suplementar (páginas 2-7).
2. Localize seções com a função Detecção automática do localizador de seção ou localize-as manualmente. As posições e contornos da seção são recuperados automaticamente com este software com base na correspondência de imagens. Para ilustração desse processo, consulte Material Suplementar (páginas 8 - 15).
3. Caso as imagens de visão geral não mostrem ROIs claramente, adquira imagens de maior resolução das seções. Use a função Visualização de seção para criar e adquirir imagens automaticamente. Este processo é ilustrado em Material Suplementar, páginas 16-18. As configurações de imagem devem ser escolhidas de acordo com a natureza e o tamanho do ROI que o usuário procura.
   1. Para encontrar as configurações ideais, ative a Imagem Ao Vivo no software de controle de microscópio e navegue até um ROI. Altere as configurações de imagem até que as imagens mostrem ROIs claramente, mas a aquisição de imagens não é excessivamente longa.
4. Definir regiões de imagem
   NOTA: Várias estratégias diferentes são propostas.
   1. Se apenas algumas seções precisarem ser imagens, use as imagens de seções criadas até agora para navegar nas seções relevantes e use o Visualizador Zoomable que mostra todas as imagens adquiridas em seus locais relativos originais para olhar todas as seções. Uma vez que uma seção seja encontrada que deve ser imageda em alta resolução, crie uma região de imagem com clique-arrastar. Escolha configurações de imagem de alta resolução e armazene as configurações em um modelo. Reumisso modelo para outras seções.
   2. Para encontrar eventos particularmente pequenos ou difíceis de detectar eventos raros, use a abordagem de triagem lateral. Crie manualmente uma região de imagem com configurações de imagem de alta resolução em cada décima seção ou em uma seção por fita e adquira as imagens. Revise as imagens e as seções de marca que contenham o ROI no software ou tome uma nota.
      1. A partir de seções que contêm o ROI, navegue para frente e para trás através do conjunto de seção e crie regiões de imagem de alta resolução nos mesmos locais relativos enquanto a estrutura ainda estiver visível na seção. Isso pode ser feito manualmente ou usando o procedimento descrito nos próximos passos.
   3. Adquira imagens em mais de dez seções consecutivas. Clique em Iniciar o Refinamento de posição após ampliar a imagem para aumentar a precisão dos locais de seção registrados conforme descrito no manual. Isso diminui a variabilidade de posição das séries de imagens. O procedimento é ilustrado e explicado nas páginas material suplementar 19-21.
   4. Clique em arrastar em qualquer seção para definir uma região de imagem enquanto segura a tecla Alt e selecione Criar conjunto de azulejos no menu de contexto que é aberto quando o botão do mouse é liberado. O software cria então regiões de imagem no mesmo local relativo em todas as seções que foram encontradas ou marcadas anteriormente. É possível limitar a imagem a uma faixa específica de seções com o controle deslizante Seção Span.
      NOTA: Este procedimento pode ser repetido com qualquer número de regiões de imagem e, portanto, permite gravar muitas pequenas imagens de alta resolução em vez de gravar uma única imagem maior em cada seção.
   5. Uma vez criado, configure a contagem de pixels, tamanho do pixel, layout de revestimento, tempo de moradia dos pixels, etc. em cada série de imagens, conforme necessário. Uma vez que as séries de imagens são criadas e configuradas, todas elas são listadas em uma sugestão de trabalho.
5. Configure funções automáticas e inicie a aquisição de imagens
   1. Crie uma série de imagens separada para funções automáticas usando o mesmo método descrito na etapa anterior. Mova a série de imagens para uma posição na seção que contém estruturas de alto contraste.
   2. Defina a série de imagens para 1024 x 884 pixels e escolha um tamanho de pixel correspondente à maior resolução usada na série de imagens configurada nas etapas anteriores. Na lista de funções automáticas, verifique Auto Focus e Auto Stigmator.
   3. Selecione Por seção nos controles de sequência de aquisição e certifique-se de que a imagem de funções automáticas seja o primeiro item da lista. Inicie a aquisição da imagem clicando no botão Executar ao lado da sugestão de trabalho. Esses procedimentos são ilustrados em Material Suplementar, páginas 22-23.
      NOTA: Não é necessário pré-focar manualmente em cada seção. Durante a sessão de gravação, sempre que o microscópio avançar para uma nova seção, as funções automáticas serão executadas antes que todas as outras imagens sejam gravadas nesta seção.

4. Alinhamento e análise de dados

1. Exportação de dados
   1. Certifique-se de que os dados são salvos em formato .tif, para que não haja necessidade de uma função de exportação dedicada. Classifique os dados em uma estrutura de pasta que corresponda diretamente às camadas e elementos da Árvore de Camadas.
   2. Uma vez que os mosaicos de imagem tenham sido gravados, use a função StitchAll para costurar automaticamente todas as telhas.
2. Alinhamento de pilha e corte em Fiji
   NOTA. Muitos pacotes de software (gratuitos e comerciais) podem ser usados para trabalhar com dados do Array Tomography. As etapas abaixo são mostradas com o programa de código aberto Fiji³² porque ele está amplamente disponível e contém todas as funções necessárias.
   1. Importe uma pilha de imagens (ou imagens costuradas) em Fiji como uma pilha virtual.
   2. Se o contraste/brilho precisar ser normalizado, escolha Contraste Aprimorado... do menu Processo. Defina Pixels Saturados para 0,1 ou menos e verifique Processar todas as fatias.
   3. No menu Plugins, escolha o Registro | Alinhamento da pilha linear com SIFT.
   4. Escolha Rigid ou Affine no menu suspenso de Transformação Esperada. Caso contrário, mantenha as configurações padrão. Inicie o alinhamento clicando em OK.
      NOTA: Carregar os dados como Virtual Stack permite que Fiji manuseie pilhas de qualquer tamanho. A saída do alinhamento é criada em RAM; no entanto, isso pode limitar o tamanho máximo de pilhas que podem ser processadas. Nesse caso, use o Register Virtual Stack Slices, que é uma implementação de pasta para pasta do mesmo algoritmo de registro. Uma vez que o registro esteja concluído, carregue os dados de saída como uma pilha virtual.
   5. Corte a pilha de imagens clicando em Crop para que contenha apenas o ROI.
   6. Salve a pilha como uma única imagem .tif ou uma série de imagens .tif.
      NOTA: Etapas críticas da Tomografia matriz são mostradas na Figura 3.

Results

Os exemplos abaixo visam demonstrar a versatilidade dos fluxos de trabalho recomendados. As ilustrações do estudo de caso são projetos para os quais tivemos dificuldade em obter resultados satisfatórios com quaisquer outras técnicas. Escolhemos o adulto Drosophila para ilustrar desafios típicos que se pode encontrar com numerosos tipos de amostras. Este órgão tubular de cerca de 6mm de comprimento, 500-1000 μm em seção transversal, é dividido em diferentes regiões com uma função única e composição celular (Figura 4A)³³. Dependendo da orientação de secção, as dimensões do perfil intestinal e sua aparência na seção variam. As seções orientadas transversal ou longitudinal são relativamente grandes, e apenas um casal pode ser colocado em uma única grade TEM(Figura 2F). Apenas uma pequena porção do tecido pode ser imageda na FIB, e para o SBF-SEM, a dificuldade é semelhante a qualquer amostra não homogênea. A AT fornece uma troca eficiente para a análise dessas amostras e a incorporação plana facilita a localização do ROI. Aparamento cuidadoso do excesso de resina ao redor da área selecionada (Figura 4B) é importante para uma coleta eficiente das matrizes da área relevante(Figura 4C). Centenas de seções podem ser coletadas em um único wafer sequencialmente ou aleatoriamente(Figura 4D). Dependendo da questão da pesquisa, a triagem e aquisição de amostras exigirá uma estratégia diferente, que nos dividimos arbitrariamente em vários cenários. Para ilustrar diferentes cenários apresentados de forma mais direcionada, escolhemos diversos estudos de caso do diferente projeto de pesquisa.

Análise de numerosas estruturas grandes distribuídas aleatoriamente de 1 a 10 μm de faixa(Figura 4E)
Frequentemente, os dados ultraestruturais são necessários para validar uma hipótese que surgiu a partir de várias abordagens experimentais, comparando uma condição padrão e experimentalmente alterada. Nesses casos, várias seções são tipicamente coletadas aleatoriamente em grades e rastreadas para localização e imagem das áreas de interesse. Essa tática é geralmente menos sistemática e limitada a um pequeno número de seções analisadas. Sugerimos a gravação de visões gerais de dezenas/ centenas de seções de resolução média a partir de uma determinada fita(Figura 4D). Para seções típicas de 70 nm, 200 seções terão aproximadamente 14 μm, que conterão numerosas células, total ou parcialmente, concluídas dentro de meia hora. Como primeiro passo, a visão geral de baixa resolução de toda a fita é registrada, e a visão geral ajuda a omitir as seções que mostram artefatos de preparação (por exemplo, dobras, sujeira). Após, a aquisição pode ser realizada manual ou automaticamente diretamente em partes selecionadas da seção, ou em uma seção inteira, utilizando imagens únicas ou de mosaico, seguida de costura(Figura 4E). Depois, imagens da área selecionada podem ser adquiridas usando parâmetros de alta resolução. Por exemplo, mitocôndrias, núcleos e microvilli podem se beneficiar de um método tão estatisticamente melhorado (Figura 4Ei-iii).

Análise de múltiplas estruturas pequenas e pouco distribuídas de 500 a 1.000 nm de alcance (Filme Suplementar 1)
Neste cenário, o ROI não pode ser simplesmente identificado em uma varredura de visão geral de baixa ampliação, e imagens de alta resolução são necessárias. Em amostras tem convencionais, o zoom tedioso dentro e fora da seção é necessário até que o recurso necessário seja encontrado. Muitas vezes, a imagem de vários locais independentes em múltiplas amostras é mais relevante estatisticamente do que a geração de um único grande volume. Nesses casos, a complexidade da aquisição manual cresce exponencialmente. Embora várias soluções TEM permitam as aquisições automáticas ou a triagem de múltiplas grades, o tamanho da grade e os desafios de secção serial frequentemente tornam a abordagem incompatível para muitas amostras. Para casos semelhantes, geramos um mapa completo de média resolução de um ROI global em várias seções em uma resolução suficiente para identificar as estruturas de interesse. Durante esta etapa de triagem lateral, é aconselhável saltar várias seções de cada vez, visando atingir pelo menos uma parte da estrutura de interesse quando abordado aleatoriamente. Isso dependerá em grande parte das dimensões globais da estrutura: por exemplo, se o tamanho total da estrutura for de 500 nm e as seções forem de 50 nm de espessura, pelo menos nove seções sequenciais seguidas provavelmente conterão uma parte da estrutura de interesse. Dessa forma, o salto de 6-7 seções deve ser eficiente para encontrar muitos tipos diferentes de estruturas em múltiplas áreas. A aquisição automática dos mapas de mosaico resolvidos das seções selecionadas permite uma triagem cuidadosa dessas seções após sua aquisição. Uma vez que um mapa de alta resolução é adquirido, vários ROIs podem ser cortados ou usados para definir áreas de imagem locais adicionais em ROIs (Filme Suplementar 1). Golgi, centrículos, junções, microtúbulos, diferentes tipos de vesículas são bons exemplos das estruturas que podem se beneficiar desse cenário (Filme Suplementar 1).

Análise de ROIs de grande porte pouco distribuídos em amostras grandes (Figuras 4F-4H)
Esse cenário envolve eventos raros, que são frequentemente descritos como "uma agulha em um palheiro" no qual o problema não está na identificação do ROI, mas em sua localização. Para muitas amostras a abordagem correlativa não é uma opção válida, mas frequentemente o ROI tem uma ultraestrutura reveladora e, quando localizado, pode ser identificado com alta confiabilidade. Para essas amostras, é essencial aplicar aquisição multinível, começando pelas amostras pré-examinadas com dezenas a centenas de seções em resolução média. No software aqui utilizado, existem duas estratégias diferentes para obter conjuntos de imagens de várias seções: gravar as imagens de visualização em uma resolução mais alta ou adquirir um Conjunto de Telhas de Matriz com configurações adequadas(Figura 4F). Diferentes tipos de células especializadas no intestinode Drosophila são distribuídos aleatoriamente (por exemplo, haste, células enteroendócrinas) e finos seccionados em orientação aleatória. No entanto, eles podem ser visualmente distinguidos após a triagem das imagens obtidas usando parâmetros de alta resolução, seja de seções únicas ou como uma coleção de imagens seriais(Figura 4G). Após o alinhamento, as pilhas podem ser renderizadas utilizando diferentes soluções de software(Figura 4H, Filme Suplementar 2).

Cenário 1: Organoides intestinais (Figura 5A)
Organoides estão se tornando uma das ferramentas mais modernas das ciências da vida moderna. Este modelo de órgão 3D quase fisiológico derivado de células-tronco torna possível um estudo preciso de uma série de processos biológicos in vivo, incluindo renovação tecidual, resposta a medicamentos e medicina regenerativa. Recentemente introduzidos mini-tubos intestinais³⁴ abrem uma nova geração de tecnologia organoide, muito semelhante à fisiologia do tecido in vivo, composição do tipo celular e homeostase, permitindo amplas perspectivas para modelagem de doenças, interação hospedeiro-micróbio e descoberta de medicamentos. No entanto, quando a caracterização ultraestrutural é necessária, a localização de diferentes tipos de células em tecidos tão grandes usando amostras aleatórias pode ser desafiadora. Além disso, em ensaios variáveis de "infecção", é fundamental garantir que a análise revele diferentes estágios de desenvolvimento que afetam o tecido. Para esses estudos, a cobertura estatisticamente significativa da amostra é central, mas difícil de alcançar utilizando a abordagem tradicional do TEM on-grade. O cenário 1 é benéfico nesses casos: muitas seções sequenciais podem ser geradas em um wafer(Figura 5Aii) e rastreadas utilizando parâmetros de baixa resolução para localização das áreas gerais de interesse(Figura 5Aiii; setas). Essas áreas podem ser direcionadas para análise suplementar utilizando parâmetros avançados de aquisição (Figuras 5Aiv e Figura 5Av). Quando uma estrutura relevante é detectada (tipicamente um cluster de 5-10 seções uma vez em cada 100-300 seções), é fácil se concentrar em cada uma das estruturas de interesse e adquirir imagens únicas manualmente ou usar os recursos de automação para adquirir volumes de imagem em várias seções.

Cenário 2: Drosophila pupal notum ( Figura5B)
Estudar a divisão celular e os mecanismos que controlam a progressão através do ciclo celular é crucial para entender processos padrão e alterados em organismos multicelulares. As informações que existem são frequentemente derivadas de sistemas unicelulares; no entanto, essa solução carece do contexto crítico das interações 3D entre as células em um tecido. Uma monocamada unicelular do notum, a parte de trás em desenvolvimento da larva Drosophila, é um modelo perfeito para a interação entre as células epiteliais em geral e divisão celular em particular³⁵. É um modelo estabelecido para estudos de interações moleculares e celulares usando a combinação dos dados disponíveis por microscopia fluorescente e manipulações genéticas. A abscisão, última etapa da divisão celular, assegura a separação final entre duas células divisórias, e caracterizar as mudanças estruturais que ocorrem durante a abscisão é essencial para a nossa compreensão da mitose. No entanto, as divisões mitóticas no notum não são fáceis de localização no nível ultraestrutural: as células são relativamente grandes, em comparação com a zona de abscisão(Figura 5B). A razão entre o tamanho geral da zona de abscisão e a superfície da seção para cobrir é grande(Figura 5Bi). Embora seja possível localizar a zona de abscisão utilizando os métodos TEM ou SBF-SEM^36,a tarefa é trabalhosa. Com este cenário, as imagens de visão geral automática de média resolução dos saltos de 20-40 seções podem ser usadas para localização das células divisórias(Figura 5Bii). Quando essas células são identificadas, as seções servem como âncora para um exame mais aprofundado das seções nas proximidades, e inúmeras células divisórias podem ser encontradas e selecionadas para análise posterior. Dessa forma, a zona de abscisão pode ser localizada e imagem em sua totalidade(Figura 5Biii). Dependendo da pergunta, imagens únicas de alta resolução ou sequências de imagem 3-7 podem ser coletadas para cobrir a profundidade da estrutura (Figura 5Biv).

Cenário 3: Neurônios tanicites do rato (Figura 5C)
O mouse fornece um modelo bem estabelecido para o desenvolvimento cerebral e é bem documentado em diferentes níveis, inclusive pelo EM. Embora diferentes métodos automatizados de blocos de blocos de série tenham sido usados extensivamente para estudar o tecido cerebral, há casos em que o AT é melhor adaptado para coletar os dados necessários. O hipotálamo é um modelo de neurociência bem estabelecido, uma parte do cérebro que contém múltiplas funções neuronais. Os tanycytes hipotalâmicos representam um subconjunto particular de células ependymoglial que revestem a parte inferior do terceiro ventrículo, com processos extraordinariamente longos (até 300 μm) e pés de extremidade grandes (~5 μm)³⁷. Isso os torna inconvenientes para a análise pelos métodos TEM ou FIB. A tarefa é ainda mais complicada quando vários tanycytes independentes precisam ser localizados e analisados. Uma das abordagens para facilitar essa tarefa pode ser o direcionamento semi-correlativo, no qual o mapa da fluorescência é obtido a partir das amostras fluorescentes rotuladas antes de fixar e incorporar para EM. A secção é realizada na área capturada pela combinação das informações posicionais da amostra de fluorescência e da réplica de plástico embutida plana. Depois disso, o cenário AT 3 pode ser usado: as imagens de mosaico de visão geral de alto nível são geradas para revelar as regiões com clusters de pés de extremidade tanycyte. Posteriormente, os recursos de automação no software são usados para configurar a aquisição de sequências das imagens de uma ou várias áreas em uma única imagem ou modo de azulejos. Essas imagens podem ser analisadas separadamente, como pilhas alinhadas ou renderizadas depois disso.

O poder do método AT permite a "atualização" relativamente fácil dos dados de 2D para 3D: os mapas estão disponíveis a partir da aquisição primária, e os volumes podem ser obtidos a partir da área selecionada e de suas proximidades. A pilha resultante pode ser alinhada e posteriormente renderizada. É essencial determinar de antemão qual resolução e qualidade de imagem são necessárias para encontrar ROIs. A imagem deve permitir o reconhecimento dos ROIs, mas não além desse valor, porque o tempo de aquisição é proporcionalmente ao tempo de moradia dos pixels e ao quadrado inverso do tamanho do pixel.

Figura 1: Desafios da preparação da amostra EM e aquisição de volume. (A) A perda de fluorescência e encolhimento ocorre devido a uma alta concentração de metais pesados e desidratação durante a preparação da amostra. (i) Um desenho esquemático de um espécime observado sob LM (ii) o mesmo espécime preparado para EM, que se torna completamente opaco e perde cerca de 10% de seu volume. (B) A incorporação da amostra é tipicamente feita usando resinas epóxi ou acrílicas. Os blocos tradicionais (i) podem ser usados com sucesso para amostras homogêneas que não requerem uma orientação específica. Blocos planos (ii) são úteis quando é essencial segmentar e orientar sob o microscópio, uma área precisa destinada à secção, por exemplo, em amostras não homogêneas ou procedimentos de microscopia correlativa. (C) De todo o volume amostral, apenas uma fração limitada é representada em uma única seção de 50 nm, fornecendo uma imagem 2D de uma amostra 3D, frequentemente em uma orientação desconhecida. (D) Para ilustrar o problema de registrar volumes excessivamente grandes versus direcionamento preciso, escolhemos três cubos concêntricos com os rostos de 1000, 500 e 50 μm organizados para incluir uma hipotética amostra de 1000 x 500 x 500 μm (marrom escuro). Se esses cubos de amostra hipotético forem completamente seccionados com fatias de 50 nm, para cobrir todo o volume, será necessário um total de 20.000, 10.000 e 1.000 fatias, e 800 tb, 100 tb e 100 gb, em conformidade (resolução de imagem 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8 bits). Isso mostra a importância de planejar a aquisição de dados EM apenas para adquirir o volume mínimo necessário. (E) Cobrir uma grande área de superfície amostral em alta resolução apresenta um problema semelhante ao de grande volume. A ação de várias imagens de alta resolução em uma é uma solução útil para esse problema. No entanto, para cobrir uma superfície de 1 mm x 1 mm usando o quadro 2024 x 1048 em ampliação de 10.000x exigirá um grande número de telhas, o que pode se tornar desafiador para costurar. Além disso, se as seções forem compactadas ou distorcidas variavelmente durante o corte, as pilhas de dados resultantes se tornarão quase impossíveis de alinhar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O fluxo de trabalho para a geração direta das matrizes de seções em suporte grande. (A) Para aparamento apertado utilizando a ferramenta de corte, os blocos são fixados dentro do suporte de microtómetro. Esta etapa ajuda a garantir lados paralelos de um bloco e também reduz a resina vazia ao redor da amostra. (B) Uma faca modificada para aquisições de seções AT. Um grande barco facilita a transferência das seções e sua manipulação durante a seção de amostras e transferência no suporte. Uma grande bacia permite a manipulação das seções; o sistema de drenagem limita o movimento das fitas durante a etapa de drenagem, o fundo plano torna a secagem gradual do suporte confiável. (C) A faca, pronta para seção com um wafer de descarga de brilho colocado no fundo da bacia e água nivelada até as bordas. A construção da faca mantém a agulha embutida, sem interferir no suporte. (D) Geração de matriz, vista superior na área de seção de microtómetros. (i) As primeiras seções geralmente são fáceis de obter, pois se aderem umas às outras e formam uma fita regular. (ii) Quando mais seções são adicionadas à fita, e ela se torna mais longa, a fita perde sua estabilidade e frequentemente curva. É fundamental manter as sequências organizadas em sequência em preparação para a etapa de aquisição de imagens. (iii) Quando uma fita de seções atinge o comprimento desejado, ela é cuidadosamente separada da borda da faca usando um cílio. (iv) A água é drenada da bacia; o wafer permanece dentro até que esteja totalmente seco. Esta etapa é essencial, pois ajuda a endireitar as seções e evitar a formação das micro dobras. O wafer é colocado no forno a 60°C por pelo menos 30 minutos para anexar as seções no suporte. (E) Exemplo de wafers com as seções transferidas. Embora seja conveniente obter fitas retas e precisas, amostras reais impedem a formação dessas fitas ideais na maioria dos casos. No entanto, mesmo fitas "desleixadas" são muito informativas para o grande número de casos, e a importância da fita "limpa" dependerá de uma estratégia de pesquisa para a qual as seções são coletadas. Barra de escala 1 cm. (F) Exemplo grades de ranhuras com as seções seriais. Mesmo quando muitas seções são coletadas em uma grade, ainda é uma pequena fração do que pode ser coletado em um único wafer. A habilidade necessária para dominar a transferência das seções em uma grade (grade de ranhura em particular) representou um gargalo significativo para dominar a preparação da amostra de microscopia eletrônica. Barra de escala 500 μm. (G) Não importa qual método de coleta de seção tenha sido utilizado, os pontos fortes da abordagem AT é a relativa facilidade de geração de seções sequenciais, em comparação com a coleção on-grid. Se for considerado um bloco amostral de 1000 μm x 500 μm, não há problema em caber cerca de 100 seções em um wafer de 2 cm x 4 cm (i). As seções do mesmo tamanho em uma grade de ranhura caberão apenas três seções/grade no máximo (ii). Fornecemos uma imagem dimensionada para mostrar quantas grades podem ser necessárias para cobrir o mesmo número de seções, sem mencionar a dificuldade de coletar seções seriais na grade. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Etapas críticas do fluxo de trabalho da tomografia do array. Esquema do fluxo de trabalho para a aquisição autônoma de pilhas de imagens de alta resolução. Todas as etapas preparatórias são automatizadas (símbolos de engrenagem verde) e não requerem nenhuma ação a ser executada manualmente, seção por seção. As pilhas de imagens podem ser alinhadas em qualquer software de análise de imagem capaz de alinhamento rígido automático ou afim. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Três cenários de aquisição com intestino adulto Drosophila como modelo de demonstração. (A) desenho de um drosophila midgut dissecado, com três regiões principais designadas por cores diferentes: anterior, média e posterior. (B) Bloco plano aparado no qual um intestino é orientado para seção transversal. Observe que a quantidade de resina vazia é cuidadosamente equilibrada ao redor do tecido que contém a região de interesse (retângulo branco). (C) Seções seriais transversais estão flutuando na superfície da água dentro da bacia da faca AT. Todas as imagens foram adquiridas no modo sem elétron secundário usando o detector de espelhos com o contraste inverso. (D) Imagem de mosaico costurada de seções seriadas transversais em um wafer. A barra de escala é de 1000 μm.(E)Seção transversal através do intestino Drosophila. Barra de escala 20 μm. A imagem é um mosaico costurado de imagens de médio alcance 7 x 7. Insets - imagens de ampliação e resolução mais elevadas das regiões específicas de interesse: (ii) núcleo, (iii) borda de pincel e (i) mitocôndrias. Barra de escala 5 μm para todos. (F) Uma imagem de médio alcance de uma seção transversal através do intestino que está mirando a localização de células em desenvolvimento (quadrado). Barra de escala é de 20 μm. (G) A matriz direcionada de seções seriais coletadas com base na área localizada durante a análise da seção presente no painel F. Barra de escala é de 10 μm. (H) O modelo 3D é renderizado com base na sequência de pilha de 50 seções obtidas a partir da aquisição serial direcionada no painel G. Por favor clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Estudos de caso para os cenários de aplicação at. (A) Localização de diferentes estruturas celulares no organoide intestinal. i Microchip de silício incorporado. Barra de escala = 200 μm. (ii) Uma imagem de mosaico costurada de 127 seções transversais através da parte central do chip. Barra de escala = 1500 μm (iii) Quatro imagens de baixa resolução de uma seção transversal completa através da porção do organoide intestinal. Setas apontam para o potencial local de interesse. A barra de escala é de 20 μm. (iv) ROIs diferentes, direcionados a micrografos de baixa resolução selecionados para análise posterior. Barra de escala = 10 μm. (v) Imagem de alta resolução da célula infectada de interesse. A análise da mesma região nas seções adjacentes pode fornecer informações 3D direcionadas, se necessário. Barra de escala = 5 μm. (B) Localização midbody em Drosophila melanogaster pupal notum. i Uma visão esquemática de uma pupa drosophila dissecada. Notum exposto para a dissecção (bege) após a remoção da parte da cutícula protetora (marrom). A linha preta designa a direção de secção (ii) Uma seção transversal através da área apresentada no diagrama. A imagem combina imagens SEM 3x7 sequencialmente tiradas de alta resolução costuradas em um painel de mosaico. O retângulo preto delimita a área que contém uma célula divisória. Barra de escala é de 15 μm. (iii) Uma imagem ampliada na célula divisória do painel ii. Nesta ampliação e resolução, o corpo médio é evidente (setas brancas). Toda a seção é analisada para encontrar as células divisórias. Saltar entre diferentes fitas de seções em intervalos de 20-30 seções durante a etapa de triagem lateral permite localizar numerosos pares de células divisórias. A barra de escala é de 5 μm (iv) quando uma célula divisória é localizada, imagens sequenciais do corpo médio coletadas de quatro seções ao redor do corpo médio delimitadas pelo quadrado amarelo no painel (iii). Barra de escala é de 1 μm. (C) Tanycytes endfeet localização em hipotálamo de rato. i Imagem de fluorescência de uma fatia de vibratome. Os tanycytes expressam proteína fluorescente tdTomato (vermelho). Um retângulo branco delimita a área de interesse. Barra de escala 500 μm. (ii) Mesma seção de vibratome preparada para EM será cuidadosamente aparada em torno da área de interesse com base na correlação indireta de informações fluorescentes do painel (i). A linha branca pontilhada representa a área de secção ultrathin. A barra de escala é de 50 μm para ambos os painéis. (iii) Seção transversal através da fatia de vibratome na área de interesse. A imagem do mosaico SEM é composta por 75 imagens costuradas. Várias seções são alvo de triagem lateral e imagens com parâmetros semelhantes. As seções são analisadas "offline" para encontrar o ROI - o tanycyte endfeta. O retângulo preto representa a área que contém o ponta dos tanycyte. Esta seção servirá como uma âncora para análises posteriores. A barra de escala é de 15 μm. (iv) Imagem de alta resolução e alta ampliação dos pés de tanycyte ao redor de um vaso sanguíneo. Após a localização inicial do ROI em uma seção, a sequência z é coletada das seções adjacentes rio acima até a seção de âncora (painel iii). Barra de escala 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Problemas durante a ultramicomia, coleta de seção e armazenamento de seção podem levar a artefatos. (A) Seções de amostra cerebral em um wafer. A maior parte da resina vazia se desprendeu do tecido e se dobrou em si mesma (sépia). A caixa preta tracejada designa uma área usada para conter toda a seção. Barra de escala 500 μm. (B) Uma pequena dobra local na superfície de uma seção de zebrafish de 50 nm de espessura. Barra de escala 1 μm. (C) Marca da faca na superfície de uma seção cerebral do rato de 70nm. Barra de escala 5 μm. (D) O cabelo (asterisco) na superfície do wafer que cobre parcialmente uma seção muscular de zebrafish. Em amarelo, o tecido é direcionado para a análise. Em rosa, uma célula costumava servir de referência para o tamanho da área afetada. E-Notochord de zebrafish com rugas no canto inferior direito (setas pretas), onde o tecido neural denso (sombreado em azul) beira o tecido muscular mais macio e a resina vazia (setas pretas). Barra de escala 10 μm. (F) Segmentação de volume de uma pilha de 50 imagens como em E, mostrando que esta região apresentava rugas na maioria das seções. Polígono tracejado a área mostrada na barra G. Escala 10 μm. (G) Visão XY da mesma segmentação de volume que em F, mostrando as rugas como traços pretos curtos na metade direita do bloco. Observe que o alinhamento da pilha nas partes restantes do tecido não é afetado pelas rugas. Balança a barra 5 μm. (H) Projeção XZ da mesma área que em G, mostrando as rugas em todas as 50 seções. Barra de escala 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme suplementar 1: Uma imagem de montagem em alta resolução de uma seção transversal através de Drosophila anterior midgut. Imagem mosaica de uma imagem SE-MD SEM invertida. 352 telhas de imagem separadas foram automaticamente adquiridas com resolução de 5 nm e costuradas para apresentar toda a seção transversal. É possível ampliar para mais detalhes e obter uma cobertura exaustiva dos dados, usando a mesma imagem. Junções apertadas, microtúbulos, diferentes tipos de vesículas podem ser ao dar zoom. Barra de escala é de 10 μm. Por favor clique aqui para baixar este filme.

Filme suplementar 2: renderização de células intestinais de Drosophila. Cinquenta imagens de mosaico alinhados das seções na área de divisão das células intestinais. Renderização de IMOD das bordas celulares (azul, turquesa e laranja) e núcleos (brancos). Clique aqui para baixar este filme.

Materiais Complementares. Clique aqui para baixar este arquivo. 

Discussion

A microscopia eletrônica dá uma visão da ultraestrutura das células e organismos, para as quais muitas vezes é desejável imagens de estruturas de interesse em seu contexto tridimensional. Apesar de inúmeras táticas EM para análise ultraestrutural, ainda não há uma solução "padrão-ouro". A principal razão é a grande variedade de amostras, muitas questões biológicas, que frequentemente requerem uma abordagem personalizada. O fluxo de trabalho AT proposto foi projetado para minimizar o tempo necessário para processamento de amostras, aquisição de dados, avaliação e armazenamento. Além disso, a faca modificada fornece uma ferramenta útil para simplificar a aquisição de arrays. O layout compacto de seções em wafers é conveniente, tanto para a observação quanto para o armazenamento subsequente das amostras. Este arranjo permite a "Triagem Lateral" das amostras movendo-se horizontalmente da fita para a fita e escaneando apenas uma seção em cada uma, reduzindo significativamente o tempo necessário para localização de um ROI. Os cenários propostos de aquisição de dados facilitam o direcionamento de áreas pequenas e distribuídas aleatoriamente. Uma vez encontrado, a AT/SEM restringe a imagem de alta resolução precisamente ao volume de juros, seja realizada manualmente ou com a ajuda da função automática. AT para volumes limitados pode ser concluído manualmente, com o operador navegando através da amostra e definindo regiões de imagem um a um. O módulo automatizado do software fornece uma estratégia flexível de aquisição de imagens para imagens de pequenas áreas em grandes seções. A automação neste software permite gravar grandes imagens de alta resolução em centenas de seções, alcançando volumes semelhantes aos SBFI. A gravação de imagens de visão geral de todas as seções simplifica a localização do ROI e reduz o tempo gasto no microscópio. Uma vez que as seções não são prejudicadas durante o registro de visões gerais e visualizações de resolução mais alta, a AT/SEM permite reutilizar a amostra para coletar dados adicionais de outros ROIs ou em uma resolução mais alta.

O tempo de aquisição de imagens é um dos aspectos mais importantes (e mais caros) do EM 3D e, portanto, deve ser considerado no design do experimento. Embora não seja surpreendente que a imagem de grandes áreas deva mais tempo do que a imagem de pequenas áreas, é fácil subestimar o impacto: Dependendo dos parâmetros de imagem selecionados, o tempo de aquisição em cada seção pode variar de segundos a horas. Os parâmetros críticos de imagem incluem o tamanho do campo de visão, resolução e tempo de moradia. Assumindo uma resolução de destino de 10nm por pixel e 1 μs de tempo de moradia, a imagem de um campo de 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm, ou 500 μm x500 μm leva 4 segundos, 100 segundos ou 2.500 s para gravar. Podemos multiplicar esses tempos de imagem por seção pelo número de seções para estimar o tempo necessário para o trabalho completo de imagem. Longos tempos de imagem por seção podem ser aceitáveis se o número de seções for pequeno ou se o tempo da ferramenta do microscópio não for de nenhuma preocupação.

No entanto, é necessário limitar o tempo de gravação a um trabalho noturno ou a um trabalho de fim de semana na maioria dos casos. Um aspecto igualmente crítico do EM 3D que deve ser considerado, é a quantidade e a estrutura dos dados de imagem resultantes. O registro dos campos de imagem acima mencionados em 100 seções gera 400 mb, 10 gb ou 250 gb de dados de imagem, respectivamente; as imagens de 500 μm x 500 μm representam a questão adicional de ser maior que 2 gb cada. Muitos dos programas de software usados para avaliação de dados não podem abrir imagens deste tamanho.

Para reduzir o tempo de imagem, é importante escolher o tempo de moradia do pixel para atender aos requisitos da relação sinal-ruído para a avaliação de dados subsequente (por exemplo, reconstrução, rastreamento) e limitar as gravações a ROIs definidas. A extensão AT do software facilita a aquisição de imagens em pequenas áreas em seções seriais. O software suporta fluxos de trabalho manuais e automáticos e muitas variantes semiautomáticas: as áreas de imagem podem ser posicionadas manualmente e focadas em cada seção, ou o usuário pode usar os recursos automáticos de localizador de seção e alinhamento de posição. Dependendo do nível de automação escolhido e suportado pelo tipo de amostra ou metas de imagem, o tempo necessário para configurar a aquisição de imagens em centenas de seções pode levar um dia de trabalho inteiro (feito manualmente) ou apenas alguns minutos. Em princípio, a Tomografia Array torna mais desafiador do que outros métodos EM 3D para adquirir pequenos ROIs; a colocação imprecisa da região em seções consecutivas deve ser compensada pela aquisição de áreas maiores. Por exemplo, se o ROI tiver 20 μm x 20 μm de tamanho e a variabilidade de posição de seção para seção dos campos de imagem for de 10μm, é preciso adquirir imagens de 40 μm x 40 μm para ter certeza de que o ROI está totalmente capturado em cada imagem, em cada seção. A variabilidade da posição de imagem do mundo real varia de 100 μm a < 10 μm, dependendo da disponibilidade ou qualidade dos recursos de software para alinhamento de posição ou paciência do usuário. Com este software, 10 μm podem ser alcançados sem muita intervenção manual na maioria das amostras.

Como qualquer técnica, o AT tem vários pontos fracos que podem influenciar a aquisição bem-sucedida de dados, e muitos são semelhantes a outros métodos baseados em secções. A falta de distribuição homogênea de resina vazia versus tecido pode resultar em matrizes curvas ou quebradas. Em casos extremos, as seções podem se desvincular do suporte(Figura 6A). A compressão variável ou alongamento durante o processo de corte pode criar dobras que podem interromper a amostra em regiões variáveis em seções subsequentes(Figura 6B). Marcas de faca podem aparecer na superfície das seções coletadas usando uma faca danificada(Figura 6C). Diferenças nas condições de secção podem induzir diferenças ocasionais de compressão e espessura da seção. Partículas de poeira ou sujeira podem pousar em uma seção e obscurecer parcialmente a zona de interesse(Figura 6D). A aquisição de imagens pode falhar devido a funções imperfeitas de auto-contraste, foco automático e auto-estigmator. O posicionamento de áreas de imagem criadas automaticamente pode ser variável e pode não capturar o ROI em todas as seções.

Vários problemas podem surgir na fase de costura e alinhamento. A costura automática de aquisições de telhas de mosaico pode falhar, por exemplo, por causa do grande espaço vazio dentro da amostra. Devido a uma mudança drástica de forma em 3D, pilhas de imagens podem ser desafiadoras para registrar. Programas especialmente desenvolvidos (por exemplo, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB ou MAPS-AT) podem facilitar o alinhamento semiautomático^32,38,39,40. Seções mais desafiadoras podem ser alinhadas manualmente usando software de edição de fotos. Infelizmente, alguns conjuntos de dados podem ser impossíveis de alinhar corretamente.

Grandes amostras são desafiadoras para seções seriais TEM que se encaixam em grades; por outro lado, muitos projetos não justificam a aquisição automática de longa duração utilizando a FIB/SEM ou a SBF-SEM. O AT é uma alternativa simples a uma seção serial tediosa TEM onde a coleta e manipulação de seções seriais em um wafer são mais simples do que com as grades de ranhura. Várias estratégias foram desenvolvidas para facilitar a coleta das matrizes, e compartilhamos nosso método para expandir o kit de ferramentas existente. Nos casos em que a identificação do ROI é desafiadora, o AT-SEM oferece uma vantagem fundamental, com a triagem eficiente das amostras em que a resolução em escala de organela em 50 a 500 seções é necessária. Para volumes maiores, as estratégias AT de coleta automática podem ser coletadas de forma eficiente se forem necessárias mais seções. As amostras AT podem ser reimagem várias vezes, facilitando imagens direcionadas de áreas de alta resolução com base em imagens de visão geral adquiridas anteriormente. Acreditamos que a análise direcionada e a redução do excesso de preços pela AT/SEM proposta aqui diminui os requisitos de mão-de-obra e armazenamento de dados. Em última análise, bibliotecas de seções podem ser coletadas e mantidas para posterior reutilização e consulta. Para aquisição de volume, as abordagens FIB ou SBF-SEM oferecem uma excelente solução sempre que o ROI é fácil de identificar na face do bloco ou se grandes volumes 3D são necessários para a análise. No entanto, o FIB/SBF-SEM é menos eficiente quando a imagem de pilha de alta resolução deve ser coletada de um ROI definido de forma direcionada. Para concluir, os métodos propostos para triagem de amostras AT e o uso de imagens de visão geral de resolução média permitem limitar a aquisição de imagens às partes relevantes do array de seção. O objetivo preciso das regiões de imagem acelera o tempo de dados e simplifica a avaliação dos dados.

Em resumo, embora o conceito de AT/SEM não seja novo, seu uso ainda não é tão difundido quanto seus méritos sugerem. No geral, fornece um procedimento complementar a outros métodos EM existentes. O AT/SEM é compatível com a mais ampla gama de protocolos de preparação de amostras e fluxos de trabalho de imagem e pode ser feito em qualquer microscópio FIB/SEM ou SBF-SEM como técnica de acompanhamento. Neste artigo, concentramos-nos no AT para o registro de dados ultraestruturais de amostras menos propensas a serem tratadas com sucesso por outros métodos. Esperamos que o procedimento descrito para a coleta conveniente de seções e estratégias de aquisição consideravelmente automatizadas ajude nas primeiras tentativas para aqueles que nunca encontraram o método e ajude a aperfeiçoá-lo para aqueles que já têm alguma experiência.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting
AT faca de corte	Diatome	DUATS3530	Diatome Jumbo
faca Faca de diamante para aparar 90°	Diatome	DTB90	Diatome trimming 20° Faca de vidro
Adesivo de contato Pattex		PCL3C
Bolacha de silício	Ted Pella	16015	Resistência: 1-30 Ohms Tipo P: (Boro) (1 plano primário) Rugosidade: 2 nm Sem revestimento superior de SiO2 TTV: = < 20 µ m Wafer é polido em um lado
Ultramicrótomo	Leica UC6		Alternativa: Leica UC7
Kit de clivagem de wafer	EMS	7642	EMF, cutelo de amostra pequena, CatNo. 7652
Aquisição de imagem
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternativas: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Mapas 3 para SEM com fluxo de trabalho correlativo e O Array Tomography	Thermo Fisher Scientific	1135932	Maps fornece automação de fluxos de trabalho de imagem SEM e permite a importação de dados de terceiros para CLEM e navegação.
Análise de imagem
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira é um software de visualização e análise de dados 3D com várias funções práticas para reconstrução de dados de Tomografia de Matriz.
Processamento de imagem	Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (Veja o texto para referências)