Artigo de método

Estudando a Atividade de Neuropeptídeos e Outros Reguladores do Sistema Excretório no Mosquito Adulto

DOI:

10.3791/61849

⸱

24 de agosto de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, York University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve metodologias por trás do ensaio ramsay, microeletrodos seletivos de íons, técnica de eletrodo seletivo de digitalização (SIET) e ensaios de contração in vitro, aplicados para estudar o sistema excretório de mosquitos adultos, composto pelos túbulos e traseiros malpighianos, para medir coletivamente as taxas de íons e secreção de fluidos, atividade contratil e transporte transepitelial.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudos de fisiologia de insetos, particularmente nas espécies que são vetores de patógenos causando doenças em humanos e outros vertebrados, fornecem a base para desenvolver novas estratégias para o controle de pragas. Aqui, uma série de métodos são descritos que são rotineiramente utilizados para determinar os papéis funcionais de neuropeptídeos e outros fatores neuronais (ou seja, aminas biogênicas) no sistema excretório do mosquito, Aedes aegypti. Os túbulos malpighianos (TM), responsáveis pela formação primária da urina, podem continuar funcionando por horas quando removidos do mosquito, permitindo medidas de secreção de fluidos após tratamentos hormonais. Como tal, o ensaio ramsay é uma técnica útil para medir as taxas de secreção de MTs isolados. Microeletrodos seletivos de íons (ISME) podem ser usados sequencialmente para medir concentrações de íons (ou seja, Na+ e K+) no fluido secretado. Este ensaio permite a medição de vários MTs em um determinado momento, determinando os efeitos de vários hormônios e drogas. A Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização usa ISME para medir a tensão representativa da atividade iônica na camada não írpara adjacente à superfície dos órgãos de transporte de íons para determinar o transporte transepiteno de íons em tempo real. Este método pode ser usado para entender o papel dos hormônios e outros reguladores sobre absorção de íons ou secreção através da epitélio. Os ensaios de contração de porca também são uma ferramenta útil para caracterizar neuropeptídeos mioativos, que podem aumentar ou reduzir a capacidade deste órgão de remover o excesso de fluido e resíduos. Coletivamente, esses métodos fornecem uma visão de como o sistema excretório é regulado em mosquitos adultos. Isso é importante porque a coordenação funcional dos órgãos excretórios é crucial para superar desafios como o estresse de dessecação após o término e antes de encontrar um hospedeiro vertebrado adequado para obter uma farinha de sangue.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A manutenção dos níveis de sal e água nos insetos permite que eles tenham sucesso em muitos nichos ecológicos e ambientais, utilizando uma variedade de estratégias de alimentação1. A maioria dos insetos desenvolveu mecanismos para regular a composição de seu hemoglifo dentro de limites estreitos, a fim de suportar os diferentes desafios associados ao seu ambiente particular2. Os insetos terrestres são frequentemente confrontados com o desafio de conservar a água e o sistema excretório sofre anti-diurese para evitar a perda de água e alguns sais essenciais, evitando, portanto, a dessecação. Em contraste, a diurese ocorre ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fazendo pratos forrados de silicone

NOTA: Esta etapa deve ser feita antes dos experimentos. Esses pratos serão feitos para preparar o prato de ensaio para dissecções, e para experimentos de ensaio de contração.

  1. Prepare o silicone usando um kit de elastômero de silicone seguindo as recomendações do fabricante. Misture os componentes líquidos de duas partes a uma razão de 10 a 1. Misture suavemente e completamente invertendo, mas certifique-se de minimizar a formação de bolhas.
  2. Despeje o elastômero de silicone em pratos padrão de cultura de poliestireno descartável de 60 mm a uma profundidade normalmente entre 7-9 mm. P....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aplicação de DH31 contra MTs não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes (Figura 1A). Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em MTs estimulados por DH31. A Figura 1B demonstra o uso de eletrodos seletivos de íons para medir as concentrações na+ nas gotícul.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao ingerir uma refeição de sangue, os insetos hematófagos enfrentam o desafio do excesso de solutos e água em seu hemolymph2. Para lidar com isso, eles possuem um sistema excretório especializado, que é fortemente controlado por fatores hormonais, permitindo que os insetos iniciem rapidamente a diurese pós-prandial. O ensaio ramsay e o uso de microeletrodos seletivos de íons permite a medição das taxas de secreção de fluidos, juntamente com concentrações de íons e taxas de transporte em MTs de ins.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants to AD e J-PP. A AL e a FS receberam prêmios NSERC CGS-M em apoio à sua pesquisa de pós-graduação.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringas de 1 mLFisher Scientific14955456
placas de Petri de 35 mmCorning Falcon (Fisher Scientific)C351008
Tubos filamentosos capilares de vidro borosiclado
(OD 1 mm, ID 0,58 mm, comprimento 100 mm)		World Precision Instruments1B100F-4usado para eletrodos
de referência ISMETubos filamentados capilares de vidro borosílicos
(OD 2 mm, ID 1,12 mm, comprimento 102 mm)		World Precision Instruments1B200F-4usado para eletrodos de referência SIET
Tubos não filamentados capilares de vidro borosillicado
(OD 1,5 mm, ID 1,12 mm, comprimento 100 mm)		World Precision InstrumentsTW150-4usado para eletrodos ISME e SIET
CO2 padDiamedGEN59-114
Solução de dimetiltrimetilsililaminaSigma-Aldrich41716
Gaiola de FaradayPersonalizadaPode ser fabricada por oficina mecânica local
Cloreto férricoSigma-Aldrich157740
Fórceps (Dumont #5)Ferramentas de Ciência Fina91150-20
Placa de Petri de VidroFisher Scientific08-748A
Óleo mineral hidratadoFisher Scientific8042-47-5A marca específica não é importante
INFINITY1-2CB câmera de vídeoLumineraINFINITY1-2CB
Micromanipuladores (canhoto e destro)World Precision InstrumentsMMJL e MMJRA marca específica não é importante, desde que o manipulador de alta qualidade
Óleo mineral, LightFisher Scientific0121-4
Pinos Minutien (aço inoxidável de 0,1 mm)Ferramentas de Ciência Fina26002-10
Argila de modelagem não endurecedorSargent ArtMarca específica não é importante
Microscópio de luz Olympus (PARA SIET)SistemaOlympus
Pipeta de plástico Pasteur (transferência) FisherScientific13-711-7M
Poli-L-lisina solução (0,1 mg/mL)Sigma-AldrichA-005-M84 kDa
Cloreto de polivinila (PVC)Sigma-Aldrich81395
Ferramentas de Belas Ciências10050-00
Cabo de bisturiFerramentas de Ciências Finas10053-09
Drosophila de Schneider sistema SIET
Eletrônica Aplicávelsistema personalizadoDetalhes disponíveis em: http://www.applicableelectronics.com/overview
Fio de prataWorld Precision InstrumentsAGW1010
Coquetel de ionóforo de sódio II AFluka99357
Pratos padrão de poliestireno Petri (cultura)FisherbrandFB012921Qualquer tamanho funcionaria, mas pratos de 60 mm são bons para dissecações e ensaio
Estereomicroscópio com micrômetro ocularNikonSMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Extrator de pipetasSutter InstrumentsFGPN7
Sylgard 184 Kit de elastômero de siliconeDow Chemical CompanyNC9285739
TetrahidrofuranoSigma-Aldrich401757
VWR agitador avançado de placa de aquecimento - alumínioVWR9578Marca específica não é importante
personalizado Lâmina de bisturi médio Sigma-Aldrich S0146

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
  2. Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Exper....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Regula o de Neuropept deosT bulos de MalpighiEnsaio de RamsayMicroeletr dos Seletivos a onsT cnica de El trodo Seletivo a ons de VarreduraEnsaios de Contra o do Intestino PosteriorMedi o de Secre o de FluidoAn lise de Transporte de onsAedes aegypti

Artigos relacionados