Artigo de método

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

DOI:

10.3791/61879

⸱

14 de março de 2021

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A geração de cardiomiócitos humanos (CMs), fibroblastos cardíacos (CFs) e células endoteliais (CE) de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) proporcionou uma oportunidade única para estudar a interação complexa entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsionam o desenvolvimento de tecidos e doenças. Na área de modelos de tecido cardíaco, várias abordagens tridimensionais sofisticadas (3D) usam cardiomiócitos pluripotentes induzidos derivados de células-tronco (iPSC-CMs) para imitar relevância fisiológica e ambiente de tecido nativo com uma combinação de matrizes extracelulares e crosslinkers. No entanto, esses sistemas são complexos para fabricar sem experiência em microfabização e requerem várias semanas para se auto-montar. Mais importante, muitos desses sistemas não possuem células vasculares e fibroblastos cardíacos que compõem mais de 60% dos não-miócitos no coração humano. Aqui descrevemos a derivação de todos os três tipos de células cardíacas de iPSCs para fabricar microtissues cardíacas. Esta técnica de moldagem de réplica fácil permite a cultura de microtissue cardíaco em placas de cultura celular multi-bem padrão por várias semanas. A plataforma permite o controle definido pelo usuário sobre tamanhos de microtissue com base na densidade inicial de semeadura e requer menos de 3 dias para que a automontagem atinja contrações microtissuas cardíacas observáveis. Além disso, as microtissues cardíacas podem ser facilmente digeridas, mantendo alta viabilidade celular para interrogatório unicelular com o uso de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq). Imaginamos que este modelo in vitro de microtissues cardíacas ajudará a acelerar os estudos de validação na descoberta de medicamentos e modelagem de doenças.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A descoberta de medicamentos e a modelagem de doenças no campo da pesquisa cardiovascular enfrentam diversos desafios devido à falta de amostras clinicamente relevantes e ferramentas translacionais inadequadas1. Modelos pré-clínicos altamente complexos ou supersimplificados em modelos de célula única in vitro não apresentam condições fisiocessiológicas de forma reprodutível. Portanto, várias plataformas miniaturizadas projetadas em tecido evoluíram para ajudar a preencher a lacuna, com o objetivo de alcançar um equilíbrio entre a facilidade de aplicação de forma de alta produtividade e a recapitulação fiel da função t....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Meio, reagente, preparação de placas de cultura

  1. Solução de lavagem celular para cultura celular: Use 1x salina tamponada de fosfato (PBS) ou solução de sal balanceada Hanks (HBSS) sem cálcio ou magnésio.
  2. Mídia de diferenciação de cardiomiocócito
    1. Prepare a diferenciação Média #1 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 mais insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).
    2. Prepare a diferenciação Média #2 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 menos insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).
    3. Prepare a purificação Média #3 adicionando suplemento (50x B27 mais insulina) a 500 mL cardiomiocó....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caracterização de icometria e citometria de fluxo de CMs, CEs e CFs derivados do iPSC
Para gerar microtissues cardíacas compostas por iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs, todos os três tipos de células são diferenciados e caracterizados individualmente. A diferenciação in vitro de iPSCs para iPSC-CMs melhorou nos últimos anos. No entanto, o rendimento e a pureza dos iPSC-CMs diferem de linha para linha. O protocolo atual produz mais de 75% de iPSC-CMs puros que começam a bater espontaneamente por v.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para gerar microtissues cardíacas a partir de iPSC-CMs pré-diferenciados, iPSC-CEs e iPSC-CFs, é essencial obter uma cultura altamente pura para um melhor controle dos números celulares após a compactação celular inibida pelo contato dentro das microtissues cardíacas. Recentemente, Giacomelli et. al.18 demonstraram a fabricação de microtissues cardíacas utilizando iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs. As microtissues cardíacas geradas usando o método descrito consistem em ~5.000 células (70% iPSC-CMs, 15.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. é co-fundador da Khloris Biosciences, mas não tem interesses concorrentes, pois o trabalho aqui apresentado é completamente independente. Os outros autores não relatam conflitos.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos à Dra. O apoio ao financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco (TRDRP) da Universidade da Califórnia, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de 12 poçosFisher Scientific08-772-29
Micro-moldes 3DMicrotecidos12-81
Placas de 6 poçosFisher Scientific08-772-1B
Solução de Enxágue AutoMACSThermo Fisher ScientificNC9104697
B27 Suplemento menos InsulinaLife TechnologiesA1895601
Suplemento B27 mais InsulinaLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, matriz qualificada por hESCBD Biosciences354277
Anticorpo T de Troponina CardíacaMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeadsMiltenyi130-097-857
CD31 AnticorpoMiltenyi130-110-670
CD31 MicroesferasMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Kit de Apoptose de Células Mortas com Anexina V FITC e PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, glicose alta (4,5 g/L) sem meio11960044
meio basal DMEM/F-12Gibco11320033
solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), sem cálcio, sem magnésioLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Fetal bovino serumLife Technologies10437
Kit LifeFactors de Fibroblastos Sem Soro LifeLIneCell TechnologyLS-1010
Meio RPMI sem glicoseLife Technologies11879-020
Soro de cabraLife Technologies16210-064
FGF-básico humanoThermo Fisher Scientific13256029
Human VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS Colunas de classificaçãoMiltenyi130-042-401
MACS BSA Solução de estoqueMiltenyi130-091-376
Tampão de enxágue MACSMiltenyi130-091-222
Separador MidiMACSMiltenyi130-042-302
RPMI médioLife Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Anticorpoconjugado Scientific Red
Vimentin Alexa Fluor® 488 D SistemasIC2105G
formato glutamina

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Microtecidos Card acosFra o Vascular EstromalCitometria de FluxoSequenciamento de RNA de C lula nicaMicroscopia ConfocalT cnica de Molde de AgaroseDensidade de Semeadura CelularAn lise da Fun o Contr tilColora o por Imunofluoresc ncia

Artigos relacionados