Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.

Abstract

As realizações tecnológicas da proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massa (MS) abrem muitas vias desconhecidas para analisar o proteome global de um organismo em condições variadas. Esta poderosa estratégia aplicada às interações de patógenos microbianos com o hospedeiro desejado caracteriza de forma abrangente ambas as perspectivas para a infecção. Aqui, o fluxo de trabalho descreve a quantificação sem rótulos (LFQ) do infectome de Cryptococcus neoformans, um patógeno intracelular facultativo fúngico que é o agente causador da doença mortal criptococcose, na presença de células macrófagos imortalizadas. O protocolo detalha as técnicas adequadas de preparação de proteínas para células patógenas e mamíferos dentro de um único experimento, resultando em submissão adequada de peptídeos para análise de cromatografia líquida (LC)-MS/MS. A natureza genérica de alto rendimento do LFQ permite uma ampla gama dinâmica de identificação e quantificação de proteínas, bem como transferência para qualquer configuração de infecção por hospedeiro-patógeno, mantendo extrema sensibilidade. O método é otimizado para catalogar perfis extensos e imparcial de abundância de proteínas de um patógeno em condições de imitação de infecções. Especificamente, o método aqui demonstrado fornece informações essenciais sobre a patogênese C. neoformans, como a produção de proteínas necessárias para a virulência e identifica proteínas críticas de hospedeiro que respondem à invasão microbiana.

Introduction

A prevalência de infecções fúngicas invasivas está aumentando muito e está correlacionada com taxas inaceitáveis de mortalidade elevadas, mais comumente relatadas em indivíduos com predisposições imunodeficientes¹. Cryptococcus neoformans é um notória patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivência intracelular dentro de células macrófagos hospedeiras. Intervenção antifúngica inadequada resulta em disseminação fúngica e manifestações de risco de vida de meningite criptocócica e meningoencefalite^2,3. O aumento global do status imunocomprometido exigiu um aumento paralelo no uso de agentes antifúngicos, nos quais muitas espécies fúngicas, incluindo C. neoformans, têm evoluído cada vez mais resistência para^4,5,6. Portanto, é imprescindível implementar tecnologias robustas e eficientes para responder a questões biológicas vitais sobre resposta à defesa do hospedeiro e patogênese microbiana.

A nova era do avanço tecnológico na espectrometria de massa (MS), incluindo a geração de poderosos gasodutos computacionais e bioinforáticos, fornece a base para uma visão integrativa para análise em larga escala da pesquisa hospedeira-patógeno^7,8. A análise proteômica convencional orientada pela patogênese geralmente perfila a visão da infecção da perspectiva hospedeira ou patógena, incluindo metodologias abrangentes como perfil de correlação de proteínas, cromatografia de afinidade combinada com proteômica e interactomics⁹. As investigações sobre a virulência de patógenos perigosos em um sistema hospedeiro são de imensa importância clínica; no entanto, a aplicação de uma análise de dupla perspectiva em um único experimento foi anteriormente considerada inatingível. Por exemplo, a perspectiva do patógeno em relação à infecção é frequentemente sobrecarregada por proteínas hospedeiras altamente abundantes, resultando em sensibilidade reduzida para a detecção de proteínas fúngicas de baixa abundantes⁷. Além disso, a alta complexidade amostral convida muitos alvos a investigar em um único sistema experimental e se mostra desafiador para elucidar mecanismos de ação para uma proteína patógena específica.

A proteômica de baixo para cima é uma técnica popular de MS que permite a preparação de amostras gerenciáveis, na qual os peptídeos são gerados pela digestão enzimática específica da sequência seguida pela separação, identificação e quantificação da cromatografia líquida pela MS^10,11. Aqui, apresentamos um método demonstrando uma estratégia de aquisição dependente de dados com o objetivo de alcançar uma cobertura imparcial de um proteome baseado em infecção ou "infectome". Especificamente, a quantificação sem rótulos (LFQ) libera a dependência de rótulos químicos ou metabólicos para identificação robusta e precisa de alterações no nível de proteínas em múltiplos proteomes, reduzindo as etapas de manuseio e processamento de amostras^12,13. Esta aplicação universal interroga proteínas produzidas em um dado momento dentro de uma célula independente de qualquer produção de proteína esperada; assim, novos insights podem ser descobertos que são críticos para a infecção.

O fluxo de trabalho descrito aqui é otimizado para explorar mudanças no nível de proteína de C. neoformans durante condições de imitação de infecções com células imunes hospedeiras(Figura 1). Em vez de depender do isolamento e separação dos tipos celulares, essa abordagem extrai o hospedeiro e o proteome patógeno juntos, e utiliza a separação bioinformática usando dois bancos de dados específicos do organismo para distinguir a produção de proteínas específicas das espécies. Este método oferece vantagens para um número ilimitado de amostras a serem processadas sem as etapas de preparação extra dispendias necessárias em estudos de rotulagem ou fracionamento baseados em isótopos. Além disso, este fluxo de trabalho suporta protocolos otimizados de extração de proteínas transferíveis para uma ampla gama de patógenos fúngicos e bacterianos capazes de atingir e infectar células imunes hospedeiras. No geral, este protocolo descreve as etapas para concluir uma extração de proteína imparcial e processamento de amostras para MS de alta resolução, seguida de dados e análise estatística, capaz de fornecer uma riqueza de conhecimento de proteínas fúngicas significativas para infecção combinada com o perfil abrangente da resposta à defesa do hospedeiro.

Protocol

Uma linha imortalizada de macrófagos derivados de camundongos BALB/c foram usados para o seguinte protocolo aprovado pelo Protocolo de Utilização animal da Universidade de Guelph 4193. Notavelmente, outras cepas de camundongos ou outras fontes de células imortalizadas podem ser aplicadas ao protocolo delineado com testes suficientes para otimizar os parâmetros detalhados. O protocolo a seguir navegará pelas etapas que começam com um frasco congelado de células macrófagos. As células são armazenadas em 10% FBS (soro bovino fetal), 1% L-glutamina e 5% pen/estreptomicina (penicilina-estreptomicina) à mistura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e 20% DMSO (sulfóxido de dimetil).

1. Cultivo de C. neoformans

1. Usando um estoque de glicerol, raia wildtype C. neoformans strain (H99) em levedura-extrato peptone dextrose (YPD) placa de ágar para isolar colônias únicas.
2. Incubar durante a noite por 16 h a 37 °C em uma incubadora estática.
3. Selecione uma única colônia de neoformans selvagens e variedade e cultura em 5 mL de caldo YPD em um tubo de ensaio de 10 mL com tampa solta. Atuar em quadruplicação.
4. Incubar durante a noite por 16 h a 37 °C em uma incubadora de agitação a 200 rpm.
5. No dia seguinte, a subcultura de cada cultura durante a noite em uma diluição de 1:100 em caldo YPD de 3 mL.
6. Medir a densidade óptica (OD_600nm) valores da cultura fúngica para determinar a fase de registro médio. Dependendo do espectrofotômetro, a cepa selvagem C. neoformans atinge a fase de registro médio comumente após a incubação de 6 a 8 h em YPD com valores gerais de_{OD 600nm} variando de 1,0 a 1,5.
7. Uma vez que as células atinjam a fase de tronco médio, pegue uma alíquota de 10 μL de suspensão de células fúngicas em um tubo de microcentrifuge limpo de 1,5 mL e dilua 1:100 em salina tamponada de fosfato estéril de 1x (PBS). Conte o número de células usando um hemótmetro.

2. Cultivo de células macrófagos

NOTA: Certifique-se de que o ambiente de trabalho seja esterilizado antes do trabalho de cultura celular.

1. Preparação do meio de cultura celular
   1. Meio assoleiumado por antibióticos: Adicione 10% FBS (soro bovino fetal), 1% L-glutamina e 5% Pen/Strep (Penicilina-Estreptomicina) à mistura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtrar o meio através de um sistema de filtro completo de 0,2 μm e armazenar a 4 °C.
   2. Meio sem antibióticos: Siga o protocolo idêntico, mas omita a mistura Pen/Strep.
2. Células macrófagos semeadas
   NOTA: O meio assoleado com antibióticos (2.1.1.) deve ser aquecido a 37°C antes do trabalho de cultura celular.
   1. Descongelar o frasco de células macrófagos rapidamente em banho de contas de 37 °C.
   2. Lave as células da solução de congelamento reutilizando as células em meio suplementado por antibióticos de 1 mL.
      NOTA: É necessária precaução extra para garantir que as células não se desemontem devido à tubulação severa.
   3. Transfira células resuspended para um tubo estéril de 15 mL.
   4. Células de pelotas por centrifugação a 400 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   5. Remova cuidadosamente o supernante com uma pipeta sorológica ou aspirador de vácuo.
   6. Levemente resuspend pelotas em 10 mL de antibiótico suplementado médio.
   7. Células suavemente pipetas resuspended em um prato tratado de cultura celular de 60 x 15 mm.
   8. Incubar prato a 37 °C com 5% de CO₂ durante a noite.
3. Passagem inicial de células macrófagos
   NOTA: Os estoques de células congeladas normalmente contêm entre 5 a 10 milhões de células por frasco (aproximadamente 1 mL). No dia seguinte, as células macrófagos que sobreviveram ao protocolo de semeadura irão aderir ao fundo do prato de cultura celular e estarão prontas para a passagem.
   1. Meio aquecido com antibióticos (passo 2.1.1) a 37 °C antes do trabalho de cultura celular. Certifique-se de que o ambiente de trabalho seja esterilizado antes do trabalho de cultura celular. Visualize as células usando um microscópio leve para garantir que as células sejam aderidas e saudáveis.
   2. Remova o meio de cultura celular do prato com uma pipeta sorológica ou um aspirador de vácuo.
   3. Adicione suavemente 5-7 mL de PBS de temperatura ambiente estéril (salina tamponada com fosfato) ao prato de 60 x 15 mm.
   4. Incline suavemente o prato para lavar as células aderidas.
   5. Remova o PBS usando uma pipeta sorológica ou aspirador de vácuo.
   6. Adicione 1 mL de PBS frio (armazenado a 4 °C) às células, incline o prato para distribuir PBS sobre todas as células e deixe descansar em temperatura ambiente por 1 min.
   7. Solte as células por toques suaves do prato, pipetting PBS frio contra as células, ou usando um raspador de células.
   8. Adicione 9 mL de meio suplementado a antibióticos ao prato.
   9. Em um novo prato de 60 x 15 mm, adicione 9 mL de meio fresco suplementado por antibióticos e 1 mL de células resuspended do prato original.
   10. Uma vez preenchido o número de placas de passagem desejadas, as células resuspended do prato original podem ser descartadas.
   11. Incubar o novo prato nas configurações mencionadas acima (passo 2.2.8).
   12. Realize a passagem subsequente quando as células atingirem 70-80% de confluência (aproximadamente a cada 2 dias, dependendo da linha celular e média utilizada).
       NOTA: As células macrófagos devem ser aprovadas no mínimo cinco vezes antes dos experimentos de infecção. Dependendo da linha celular, os experimentos de infecção devem ser realizados por 25 a 30 passagens. Após 25 a 30 passagens, as células devem ser congeladas ou descartadas. A seção 2.4 ou 2.5 pode ser escolhida com base nos planos experimentais. A seção 2.4 será usada para as seguintes seções.
4. Semeadura de células macrófagos antes da infecção
   1. Execute as etapas do protocolo de passagem 2.3.1 a 2.3.7.
   2. O uso de um hemótmetro ou contador automatizado de células determina a densidade celular (células/mL).
   3. Transfira 0,3 x 10⁶ células macrófagos em um único poço de uma placa de cultura celular de 6 poços.
   4. Ajuste o volume total de poço para 1 mL usando meio suplementado por antibióticos (etapa 2.1.1).
   5. Repetimos as etapas 2.4.3 e 2.4.4 até que 8 poços tenham sido preenchidos (4 poços preenchidos em duas placas separadas).
   6. Opcionalmente, encha os dois poços restantes com 1 mL de PBS de temperatura ambiente para manter os níveis de umidade durante a incubação.
   7. Permitir que as células cresçam em condições de incubação mencionadas na etapa 2.2.8 por 2 d antes da infecção.
5. Semeando células macrófagos no dia da infecção
   1. Execute as etapas do protocolo de passagem 2.3.1 a 2.3.7.
   2. O uso de um hemótmetro ou contador automatizado de células determina a densidade celular (células/mL).
   3. Sementes 1,2 x 10⁶ células macrófagos em um único poço de uma placa de cultura celular de 6 poços.
   4. Ajuste o volume total de poço para 1 mL usando meio suplementado por antibióticos (2.1.1).
   5. Repita 2.4.3 e 2.4.4 até que 8 poços tenham sido preenchidos (4 poços preenchidos em duas placas separadas).
   6. Opcionalmente, encha os dois poços restantes com 1 mL de PBS de temperatura ambiente para manter os níveis de umidade durante a incubação.
   7. Incubar células em condições mencionadas na etapa 2.2.8 por 3 h para permitir que as células aderam aos poços.

3. Infecção de células macrófagos com C. neoformans

NOTA: Ao atingir 70-80% de confluência, haverá aproximadamente 1,2 x 10⁶ células macrófagos por poço. Para alcançar a multiplicidade desejada de infecção (MOI) de 100:1, são necessárias 1,2 x 10⁸ células fúngicas para cada reação. As culturas devem ser definidas de acordo em quadruplicato biológico.

AVISO: Um MOI de 100:1 alcançou resultados desejáveis em nosso grupo de pesquisa e é feito como uma sugestão aos leitores. Um MOI mais baixo pode ser necessário para cepas c. neoformans mais infecciosas ou para linhas de células macrófagos menos resistentes. A verificação da infecção (seção 3.5) pode ser usada para determinar o MOI ideal para neoformans C. particulares – combinações de macrófagos.

1. Preparação de células fúngicas
   1. Siga o passo 1 para o crescimento de C. neoformans para a fase de registro médio.
   2. Coletar e centrífugas a 1.500 x g por 10 minutos, lavar suavemente a pelota com PBS de temperatura ambiente estéril e repetir para um total de três lavagens.
   3. Células resuspendas em meio de cultura celular livre de antibióticos (passo 2.1.2) para alcançar uma concentração de 1,2 x 10⁸ células/mL.
2. Preparação de células macrófagos
   1. Visualize cada poço na placa de 6 poços para garantir que as células tenham atingido 70-80% de confluência. Alternativamente, as células podem ser medidas para alcançar aproximadamente 1,2 x 10⁶ células macrófagos por poço.
   2. Siga os passos 2.3.1 a 2.3.4.
3. Co-cultura de C. neoformans e células macrófagos
   1. Adicione 1 mL das células neoformans de C. resuspended (passo 3.1.3) a 4 poços contendo células macrófagos preparados na seção 3.2.
      NOTA: O número de placas necessárias precisará ser calculado antes do início do experimento. Adicione 1 mL de meio livre de antibióticos (passo 2.1.2) a poços vazios.
   2. Permitir que as células incubam em condições listadas (etapa 2.2.8) por 3 h.
   3. Remova o meio de cultura celular da placa com uma pipeta sorológica ou um aspirador de vácuo.
   4. Adicione suavemente 1 mL de PBS de temperatura ambiente estéril.
   5. Incline suavemente a placa para lavar células extracelulares não ligadas ou não-fagocólicas C. neoformans.
   6. Remova o PBS usando uma pipeta sorológica ou aspirador de vácuo, repita para um total de três lavagens. Repita 3.3.4 a 3.3.5 mais duas vezes.
4. Macrófagos não infectados
   1. Da mesma forma, use 4 poços de uma placa de 6 poços para servir atuar como amostras somente de macrófago. Adicione 1 mL de meio livre de antibióticos (passo 2.1.2) a esses poços.
   2. Repetir passos 3.3.2 a 3.3.6.
5. Verificação da infecção
   NOTA: Utilizando um ensaio de citotoxicidade, a proficiência em infecções pode ser medida. O protocolo a seguir destacará a aplicação de um produto de citotoxicidade para medir a versão LDH (lactato desidrogenase). Outros produtos de citotoxicidade também podem ser usados.
   1. Preparação da infecção por C. neoformans de células macrófagos
      1. Repete as etapas 1, 2 e 3 (até 3,5). O ensaio LDH pode ser realizado em triplicado, se preferir.
      2. Seguindo o passo 3.3.6, adicione 1 mL de meio livre de antibióticos (2.1.2) a cada poço na placa de 6 poços.
      3. Repetimos os passos 2.4.3 e 2.4.4 até 3 poços mais 3n poços foram preenchidos (onde n é o número de pontos de tempo medidos).
      4. Incubar células em condições listadas na etapa 2.2.8.
      5. Nos pontos de tempo selecionados (por exemplo, 1, 3, 6, 12 e 24 horas) coletam supernascentes para medição da versão LDH de acordo com as instruções do fabricante
      6. Ao mesmo tempo, as células macrófagos não infectadas serão lícitas para o valor determinado para a citotoxicidade máxima.
      7. Calcular a citotoxicidade da seguinte forma:
         

4. Coleta de amostras

1. Coleção de macrófagos não infectados e co-cultura
   1. Adicione 1 mL de PBS frio às células (de 3,3,6 e 3,4,2) e deixe descansar à temperatura ambiente por 1 min.
   2. Solte as células da placa por toques suaves da placa ou suave pipetação de PBS frio contra as células.
      NOTA: O raspador de células deve ser evitado, pois isso pode causar lise das células.
   3. Células resuspensadas de pipeta em um tubo de 15 mL.
   4. Centrífugas células a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente, e remova o sobrenante.
   5. Células de processo (conforme detalhado na etapa 5) imediatamente ou flash congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para processamento posterior.

5. Proteome celular

NOTA: A lise suficiente deve ser otimizada para o tipo de célula analisada (ou seja, a quantidade de ciclos e amplitudes depende do tamanho da pelota celular e da porcentagem de potência do modelo sonicator da sonda).

1. Lise celular macrófago infectada
   1. Células de pelotização resuspend (passo 4.1.5) em 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) consistindo de uma tábua de coquetel inibidor de protease recém-dissolvida.
      NOTA: Um comprimido de coquetel inibidor de protease é adicionado a 10 mL de gelo frio de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) antes de iniciar o experimento.
   2. Sonda sonicate células em um banho de gelo para 15 ciclos de 30 s on e 30 s off, para lise as células.
   3. Centrífugas células brevemente para 30 s a 400 x g, cuidado para não formar uma pelota, apenas para remover líquido nas laterais dos tubos seguido de transferência de amostra para um tubo de microcentrifuge lo-bind de 2 mL.
   4. Adicionar 1:10 volume de 20% SDS a uma concentração final de 2%.
   5. Adicione 1:100 volume de 1 M dithiothreitol (DTT) a uma concentração final de 10 mM e misture a amostra completamente por pipetação, seguida de incubação em um bloco de aquecimento térmico a 95 °C por 10 min a 800 rpm agitação. Em seguida, frio à temperatura ambiente (o resfriamento pode ser feito no gelo).
   6. Adicione 1:10 volume de 0,55 M iodoacetamida (IAA) para obter uma concentração final de 55 mM e misture a amostra completamente por pipetação. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 20 minutos.
   7. Adicione 100% de acetona para obter uma concentração final de 80% de acetona e armazene a amostra durante a noite a -20°C para precipitar proteínas.
2. Digestão proteica
   1. No dia seguinte, colete a pelota precipitada por centrifugação por 10 min a 10.000 x g e 4 °C. Descarte a supernasce e lave a pelota com 500 μL de acetona de 80%. Repita para um total de duas lavagens. Pelota seca de ar à temperatura ambiente após as lavagens.
   2. Resolubilize a pelota proteica em 100 μL de 8 M de ureia/40 mM HEPES, para garantir a solubilização completa, vórtice ou sonicato em um banho de água gelada para 15 ciclos de 30 s on e 30 s off.
      NOTA: O ajuste do volume de ureia/HEPES é determinado no tamanho da pelota celular precipitada, se ocorrerem alterações todos os volumes a jusante devem ser ajustados adequadamente.
   3. Quantifique a concentração de proteínas usando um ensaio proteico (por exemplo, ensaio de proteína BCA) de acordo com as instruções do fabricante e ajuste para medição de fundo por normalização em branco com 8 M de ureia/40 mM HEPES.
   4. Adicione 300 μL de 50 mM de bicarbonato de amônio para obter uma concentração final de 2 M de ureia.
      NOTA: Oportunidade de normalizar a concentração de proteínas para medições a jusante, sugerida para digerir 100 μg de proteína e armazenar a amostra não digerida restante por congelamento de flash em nitrogênio líquido e depois armazenar a -20 °C para curto prazo, ou a -80 °C para longo prazo.
   5. Adicione 2:50 (v/w) relação enzima/proteína da mistura de protease trypsin/Lys-C no gelo e bata suavemente no tubo para misturar, incubar durante a noite à temperatura ambiente.
   6. Após a incubação, pare a digestão adicionando solução de parada de volume 1:10 (20% acetonitrilo, 6% ácido trifluoroacético) e amostras de centrífuga a 10.000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
   7. Recolher supernacidos (consiste em peptídeos digeridos) e descartar quaisquer detritos pelleted ou precipitado.
3. Desalting de peptídeo
   1. Ative uma dica de extração C18 Stop And Go (STAGE) (consistindo em 3 camadas de resina C18 em uma ponta de pipeta de 200 μL) adicionando 100 μL de acetonitrila e centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
   2. Equilibre a ponta C18 STAGE adicionando 50 μL de tampão B (80% (v/v) acetonitrilo, 0,5% (v/v) ácido acético) e centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
   3. Equilibre a ponta C18 STAGE adicionando 200 μL de tampão A (2% (v/v) acetonitrilo, 0,1% (v/v) ácido trifluoroacético, 0,5% (v/v) ácido acético) e centrífuga a 1.000 x g por 3-5 min.
   4. Adicione ~50 μg de amostra digerida na ponta C18 STAGE e centrífuga a 1.000 x g por 3-5 min, ou até que a amostra passe através da coluna de spin. O flash congele a amostra digerida restante em nitrogênio líquido e armazene a -20°C, até que seja necessário.
   5. Lave a ponta C18 STAGE com 200 μL de Buffer A e centrífuga a 1.000 x g por 3-5 min.
   6. Adicione 50 μL tampão B à ponta C18 STAGE e centrífuga a 500 x g por 2 min. Colete peptídeos elucidos em tubos PCR de 0,2 mL.
   7. Seque os peptídeos elucidos em uma centrífuga a vácuo por 30-40 min em velocidade máxima. Amostras completamente secas podem ser armazenadas à temperatura ambiente ou a -20 °C até serem processadas.
      NOTA: Os peptídeos secos e desácidos são submissões de amostras apropriadas para instalações de espectrometria de massa para processamento e podem ser enviados à temperatura ambiente.

6. Espectrometria de massa

1. Reconstituir peptídeos em 10 μL Buffer A e medir a concentração necessária para injetar ~1,5 a 3 μg de peptídeos na coluna MS. A quantidade de amostra dependerá da instrumentação.
2. Use um gradiente pré-determinado de acetonitrilo (aproximadamente 5-60%) em ácido acético de 0,5% sobre um tempo desejado (por exemplo, 2 h) para separar peptídeos por cromatografia líquida de alto desempenho, seguido de ionização eletrospray no espectrômetro de massa.
3. Adquira varreduras de MS usando um espectrômetro de massa de alta resolução no modo de aquisição dependente de dados(m/z 300 a 1650).
   NOTA: A porcentagem e o comprimento do gradiente são determinados pelo experimento e pelo usuário. As configurações precisas do espectrômetro de massa dependem da instrumentação, do experimento e da preferência do usuário.

7. Análise de dados

NOTA: Os dados de MS podem ser processados com inúmeros pipelines de bioinformática. Neste protocolo, descrevemos o processamento usando as plataformas MaxQuant e Perseus disponíveis publicamente, mas recomendamos que usuários individuais avaliem ferramentas bioinformáticas apropriadas para a análise, preferência e uso.

1. Carregue arquivos de dados não processados (diretamente do instrumento MS) usando o software MaxQuant. Identificar proteínas sob os parâmetros de pesquisa MaxQuant modificados; mínimo de dois peptídeos únicos necessários para identificação de proteínas usando uma abordagem chamariz alvo para uma taxa de descoberta falsa de 1%, implementar quantificação livre de rótulos com correspondência entre corridas, incorporar os organismos ARQUIVO FASTA obtido do banco de dados UniProt (ou seja, Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) para identificar e quantificar peptídeos presentes com o motor de busca Andromeda. Consulte as ferramentas online do Público MaxQuant para tutoriais detalhados (ver Tabela de Materiais).
2. Carregue o arquivo de saída MaxQuant ('proteingroups.txt') em Perseus.
3. Linhas de filtro contendo potenciais falsos positivos e contaminantes, bem como apenas modificadas por peptídeos do local com as 'linhas de filtro baseadas em coluna categórica'.
4. Transforme os valores dos dados na escala log_2.
5. Crie grupos de conjuntos de dados fornecendo anotações categóricas às linhas.
6. Filtrar o conjunto de dados por valores válidos para definir um corte para detecção de proteínas.
   NOTA: Para uma análise rigorosa e robusta é sugerida uma taxa de identificação de >50%. Por exemplo, se quatro réplicas fossem processadas, um número mínimo de três valores válidos seria selecionado.
7. Se preferir, imputar dados substituindo valores ausentes da distribuição normal.
   NOTA: Os valores imputados são otimizados com base na distribuição normal e fornecem uma intensidade lfq aleatória para substituir os espaços reservados 'NaN' para simular medições típicas de abundância. Essa imputação fornece uma plataforma para análise estatística a jusante que requer dados quantificáveis.
8. Adicione anotações às linhas proteicas (por exemplo, nomes de proteínas, termos de Gene Ontology).
   NOTA: Este fluxo de trabalho gerado pela Perseus é agora uma estrutura robusta para mais processamento bioinforático, análise estatística e visualização de dados, consulte ferramentas on-line públicas da Perseus para tutoriais detalhados (ver Tabela de Materiais).

Results

O protocolo descrito acima permite a identificação e quantificação de proteínas derivadas tanto do patógeno fúngico, C. neoformans, quanto do hospedeiro, células macrófagos, em um único experimento. Seguindo a cocultura, as células são coletadas e processadas juntas e bioinformáticas separadas com base em perfis de peptídeos específicos para cada espécie. Esta é uma abordagem poderosa para definir a interação da relação hospedeiro-patógeno durante a infecção. O número de proteínas identificadas a partir do exper...

Discussion

As etapas críticas do protocolo incluem a preparação de células macrófagos e a coleta de amostras de co-cultura para processamento de proteínas com interrupção mínima das células. É importante realizar etapas de lavagem, inoculação e remoção de células macrófagos aderentes suavemente e cuidadosamente para evitar a lise desnecessária das células antes da coleta. Estabelecer o MOI correto para o experimento também é fundamental, pois a inoculação com um MOI excessivamente alto pode causar morte rápida de células macrófagos...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	Mantém a 4° C
60 x 15 mm Prato, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
de cultura de células de 6 poços	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrila, grau MS	Pierce	TS-51101
Ácido acético	Sigma Aldrich	1099510001
Acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Amônio bicarbonato (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Prepare uma solução ABC de 50 mM, estável à temperatura ambiente por até um mês.
Bel-Art™ Sistema de Coleta de Aspirador a Vácuo HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	Não é essencial, pipetas sorológicas podem ser usadas para remover o meio.
Resina C18	3M Empore	3M2215
Raspadores de células	VWR	10062-906	Não é essencial, outros métodos para liberar células de macrófagos podem ser usados.
Concentrador centrífugo de vácuo	Eppendorf	07-748-15
Unidade de filtração completa	VWR	10040-436
Tubos cónicos de falcão (15 ml)	Fisher Scientific	05-539-12
Contador de células automatizado Countess II	ThermoFisher	Scientific AMQAX1000	Não é essencial, o hemocitómetro pode ser utilizado como alternativa.
CytoTox 96 Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativa	Promega	G1780
Ditiotreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare uma solução de estoque a granel de 1 M DTT, congelada rapidamente e armazenada a -20 ° C até o uso. Descarte após cada uso (não congele e descongele repetidamente).
DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inativar o calor incubando a 60° C por 30 minutos. Preparar alíquotas de 50 ml e congelar rapidamente. Descongelar antes da preparação do meio
Hemocitômetro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparar HEPES/8 M Ureia 40 mM em solução estoque a granel, congelada rapidamente, armazenar a -20° C até o uso. Descarte após cada uso (não congele e descongele repetidamente).
Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência	ThermoFisher Scientific	LC140	O comprimento do gradiente é baseado na complexidade da amostra, gradiente recomendado de 120 min para amostras infectômicas.
Espectrômetro de massa de alta resolução	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamida (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Prepare uma solução de estoque a granel de 0,55 M, congelada rapidamente, armazene a -20° C até o uso. Descarte após cada uso (não congele e descongele repetidamente).
L-glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081	Pode ser alíquota e congelada para armazenamento. Descongele antes da preparação da mídia.
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant é uma plataforma pública que oferece tutoriais, como a MaxQuant Summer School, descrevendo as etapas de análise computacional de grandes conjuntos de dados MS
Microcentrífuga	Eppendorf	13864457
Penicilina: Estreptomicina 10k/10k	VWR	CA12001-692	Pode ser alíquota e congelado para armazenamento. Descongele antes da preparação da mídia.
Colunas de separação de peptídeos	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
solução salina tamponada com fosfato	VWR	CA12001-676	Compra não necessária. O PBS também pode ser preparado, mas a filtragem estéril deve ser realizada antes do uso.
Ensaio de Proteína BCA Pierce	ThermoFisher Scientific	23225
Pipeta, Sorológica Descartável (10 mL)	Pipeta Fisher Scientific	13-678-11E
, Sorológica Descartável (25 mL) Sonda de	14955235		Fisher Scientific
Sonciator	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Comprimido de coquetel inibidor de protease	Roche	4693159001
Dodecil sulfato de sódio	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
Espectrofotômetro (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE Centrífuga basculante	Sonação	STC-V2
Agitador térmico	VWR	NO89232-908
Ácido trifluoroacético	ThermoFisher Scientific	85183
Mistura de protease tripsina/Lys-C, A categoria Pierce		A40007	mantém em -20 °C.
Banho ultrassônico	Bransonic	A89375-450	Armazenado em câmara fria (4C)
Ureia	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Prepare 40 mM HEPES/8 M Ureia em solução de estoque a granel, congelado rapidamente, armazene a -20 ° C até o uso. Descarte após cada uso (não congele e descongele repetidamente).
Caldo de peptona dextrose de extrato de levedura	BD Difco	BM20