Artigo de método
Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.
A invasão de células cancerígenas do tumor primário para os tecidos saudáveis adjacentes é um passo inicial na metástase. As células cancerígenas invasivas representam um grande desafio clínico porque não existem métodos eficientes para sua eliminação uma vez que sua disseminação está em andamento. Uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a invasão de células cancerosas pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes. Devido à sua semelhança fisiológica com tumores, os esferoides incorporados no colágeno tenho sido amplamente utilizado pelos pesquisadores para estudar os mecanismos que regem a invasão de células cancerígenas na matriz extracelular (ECM). No entanto, este ensaio é limitado por (1) falta de controle sobre a incorporação de esferoides no ECM; (2) alto custo de colágeno I e pratos de fundo de vidro, (3) rotulagem imunofluorescente não confiável, devido à penetração ineficiente de anticorpos e corantes fluorescentes e (4) processamento de imagem demorado e quantificação dos dados. Para enfrentar esses desafios, otimizamos o protocolo esferoide tridimensional (3D) para imagem fluorescente rotulada células cancerígenas embutidas no colágeno I, seja usando vídeos de lapso de tempo ou imagens longitudinais, e analisar a invasão de células cancerosas. Primeiro, descrevemos a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide (SID) para incorporar esferoides de forma confiável e em um volume mínimo de colágeno I, reduzindo o custo do ensaio. Em seguida, delineamos os passos para rotulagem robusta de fluorescência de esferoides vivos e fixos. Finalmente, oferecemos uma macro Fiji fácil de usar para processamento de imagens e quantificação de dados. Ao todo, essa metodologia simples fornece uma plataforma confiável e acessível para monitorar a invasão de células cancerígenas no colágeno I. Além disso, este protocolo pode ser facilmente modificado para atender às necessidades dos usuários.
Durante a progressão do câncer, as células cancerígenas podem adquirir um fenótipo motile e invasivo, permitindo-lhes escapar da massa tumoral e invadir os tecidos circundantes1. Eventualmente, essas células cancerígenas invasivas podem alcançar e crescer dentro de órgãos secundários, um processo chamado metástase do câncer1. A metástase causa mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer2. Uma das razões para isso é que, embora os tumores localizados sejam clinicamente gerenciáveis, não existem métodos eficientes para a eliminação de células cancerígenas invasivas uma vez que a propagação metastá....
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1. Fabricação de um Dispositivo de Imagem Esferoide (SID) para otimizar a incorporação de esferoides (Duração de 1 dia)
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Devido à sua biocompatibilidade, o PDMS é amplamente utilizado para microfabificação de poços, selos e moldes de confinamento, o que revolucionou os dispositivos micropatterning e microfluidos. No método descrito aqui, é usado para criar SIDs, poços personalizáveis que otimizam o procedimento de incorporação e imagem de spheroid. A Figura 1 ilustra os principais componentes utilizados na fabricação dos SIDs. Para lançar o molde PDMS, um espaçador de 1 mm de espessura é impresso em 3D
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O espaçador impresso 3D foi projetado para criar folhas de 1 mm de espessura de PDMS que podem então ser usadas para criar facilmente várias formas de PDMS, conforme exigido pelas aplicações experimentais. Devido à simplicidade de sua fabricação e à liberdade de alterar o design, este método de fundição PDMS foi escolhido para o design inicial do SID. Se for necessário um alto volume de SIDs, a produção pode ser mais eficiente criando um molde impresso em 3D, que já contém discos PDMS com três orifícios igualmente espaça.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Gostaríamos de agradecer aos membros da Temple Bioengineering por discussões valiosas. Agradecemos a David Ambrose no núcleo de citometria de fluxo (Lewis Katz School of Medicine) por sua ajuda com a triagem celular e Tony Boehm do IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) por ajuda com a impressão 3D. Agradecemos também aos nossos recursos de financiamento: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 e R01 CA230777, todos para a BG.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldeído (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| placa de 48 poços | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 faloidina | Life Technologies | A20006 | |
| Anticorpo anti-cortactina | Abcam | ab33333 | 1 a 200 diluição |
| Anti Anticorpo E-caderina | Invitrogen | 13-1900 | 1 a 100 diluições |
| Solução de atelocolágeno bovino I (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Tubos cônicos | Falcon | 352095 | |
| Lamínulas | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Recipiente descartável | Grampos | Copos plásticos | |
| Pipeta de transferência descartável | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Fita dupla face | Scotch | ||
| Etanol | Sigma | Aldrich E7023-500ML | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldeído | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Coloração nuclear de Hoescht | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| prato MatTek (prato com fundo de vidro) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Metilcelulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ água | |||
| Solução de penicilina/estreptomicina | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Pontas | de 353003 | ||
| Fisherbrand | 02-707 | ||
| Gilson | F167300 | ||
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Anticorpos primários, específico | |||
| Colágeno de cauda de rato I | Corning | 47747-218 | |
| Lâmina de barbear | Personna | 74-0001 | |
| Anticorpos secundários, específicos do | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Fita | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
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