Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Resumo

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Resumo

Moscas de areia são os vetores naturais da espécie Leishmania, parasitas protozoários produzindo um amplo espectro de sintomas que vão desde lesões cutâneas até patologia visceral. Decifrar a natureza das interações vetor/parasita é de importância primária para uma melhor compreensão da transmissão de Leishmania aos seus hospedeiros. Entre os parâmetros que controlam a competência vetorial da mosca de areia (ou seja, sua capacidade de transportar e transmitir patógenos), parâmetros intrínsecos a esses insetos mostraram-se um papel fundamental. A resposta imune a insetos, por exemplo, impacta a competência vetorial da mosca da areia para a Leishmania. O estudo desses parâmetros tem sido limitado pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses organismos não-modelo. A baixa genética por RNA de pequena interferência (siRNA) é possível, mas além de ser tecnicamente desafiador, o silenciamento leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração. Mutagênese direcionada pela tecnologia CRISPR/Cas9 foi recentemente adaptada para a mosca de areia Phlebotomus papatasi. Essa técnica leva à geração de mutações transmissíveis em um lócus especificamente escolhido, permitindo estudar os genes de interesse. O sistema CRISPR/Cas9 conta com a indução de quebras de DNA de dois fios direcionados, posteriormente reparados por NHEJ (Non-Homólogos End Joining) ou por Homology Driven Repair (HDR). O NHEJ consiste em um simples fechamento da quebra e frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. Em contraste, o HDR usa a presença de uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Aqui, apresentamos um método de microinjeção de embriões de mosca de areia para mutagênese direcionada pelo CRISPR/Cas9 usando NHEJ, que é a única técnica de modificação do genoma adaptada aos vetores de mosca de areia até o momento.

Introdução

As doenças transmitidas por vetores são uma grande ameaça à saúde pública em constante evolução. Centenas de espécies vetoriais espalhadas por famílias filogênicas muito distintas (por exemplo, mosquitos, carrapatos, pulgas) são responsáveis pela transmissão de um grande número de patógenos microbianos, resultando em mais de 700.000 mortes humanas por ano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Entre os insetos vetoriais, as moscas de areia de flebotomina (Diptera, Psychodidae) constituem um vasto grupo, com 80 espécies vetoriais comprovadas exibindo traços fenotípicos distintos e capacidades vetoriais encontradas em diferentes regiões geográficas. São vetores ....

Protocolo

O uso de camundongos como fonte de sangue para alimentação de moscas de areia foi realizado de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Os invertebrados não estão cobertos pelas diretrizes do NIH.

1. Preparação da agulha(Figura 1)

1. Puxe agulhas e bisel como descrito em Meuti e Harrell¹⁹. Brevemente, puxe agulhas em um puxador de micropipette de vidro de dois estágios, usando capilares de vidr....

Resultados

O protocolo de microinjeção CRISPR/Cas9 descrito aqui para gerar mutantes de moscas de areia foi estabelecido em uma publicação anterior⁴. Essa abordagem produziu mutagênese altamente eficiente, já que 11 dos 540 indivíduos sobreviveram ao procedimento, dos quais 9 eram mutantes. Ao projetar guias para mutação CRISPR/Cas9, um primeiro passo crítico é sequenciar a região ao redor da área a ser alvo. O modelo para sequenciamento deve ser da cepa que será usada como fonte de embriões para injeção. É .......

Discussão

Apresentamos aqui um método de microinjeção de embriões recentemente desenvolvido para mutagênese direcionada por CRISPR/Cas9 em moscas de areia Phlebotomus papatasi. A microinjeção de embriões para modificação genética de insetos foi desenvolvida em Drosophila em meados da década de 1980²¹ e agora é usada rotineiramente em uma grande variedade de insetos. Outros métodos para a entrega de materiais de modificação genética foram desenvolvidos para uso em insetos, como ReMOT

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Papel de Filtro Preto 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Corte em retângulos com aproximadamente 46 X 22mm. Estes são colocados entre a lâmina e a lamínula e atuam como uma camada de base úmida para os embriões durante a injeção.
Coverwashs	Fisher Scientific	12-543A
Microscópio de Dissecação	Qualquer marca		Para alinhar embriões
Lâminas de vidro	Fisher Scientific	12-550-A3	Camada de base da configuração de microinjeção Figura 2A
Gaiola de insetos	feita sob medida ou várias opções comerciais		gaiola de policarbonato para adultos segurando e acasalando Advogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. “ Colonização laboratorial e criação em massa de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae)." Parasita 24. Acessado em 6 de agosto de 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Comida larval	feita		uma mistura de ração de coelho e fezes de coelho Advogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. " Colonização laboratorial e criação em massa de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae)." Parasita 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Usado para enchimento de agulhas de microinjeção
Aspirador de boca	John W. Hock Company	Modelo 612	aspirador de boca com filtro HEPA
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microscópio de microinjeção
Ovipots	Nalge company		ovipots são feitos de frascos de plolipropileno de 125 ml ou 500 ml de lados retos modificados por furos de 2,5 cm no fundo e preenchidos com 1 cm de gesso de Paris. Advogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. “ Colonização laboratorial e criação em massa de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae)." Parasita 24. Acessado em 6 de agosto de 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Pincel 6-0	Qualquer Empresa de Suprimentos de Arte	n/a	Usado para alinhar embriões
Ácido propiônico	Sigma-Aldrich	402907	agente antifúngico
Capilares de vidro padrão	World Precision Instruments	1B100-3	Usado para fazer agulhas de microinjeção
Controlador Trio-MPC100 e Manipulador MP845	Sutter Instruments		e Micromanipulador

sob medida Controlador de Microinjeção