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睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

網膜色素上皮細胞をH2O2で処理し、細胞の形態、生存率、密度、グルタチオン、UCP-2レベルを解析することにより、酸化ストレスモデルの開発と使用に関するプロトコルを提示します。これは、トランスポゾントランスフェクション細胞によって分泌されるタンパク質の抗酸化効果を調べて神経レチンの変性を治療するのに有用なモデルです。

Abstract

酸化ストレスは、加齢黄斑変性症(AMD)を含むいくつかの変性疾患において重要な役割を果たします。網膜色素上皮(RPE)合成神経保護因子の減少、例えば、色素上皮由来因子(PEDF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、RPE細胞の喪失、そして最終的には光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死につながる。我々は、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するトランスフェクションRPE細胞の遺伝子導入による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を緩和し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性があると仮定する。眠れる森の美しさトランスポゾンシステム(SB100X)を用いて、ヒトRPE細胞はPEDFおよびGM-CSF遺伝子にトランスフェクトされ、qPCR、ウェスタンブロット、ELISA、および免疫蛍光を用いた安定した遺伝子集積、長期遺伝子発現、タンパク質分泌を示した。トランスフェクトされたRPE細胞によって分泌されるPEDFおよびGM-CSFの機能性と効力を確認するために、培養中のRPE細胞に対するH2O2誘導酸化ストレスの低減を定量化するインビトロアッセイを開発しました。細胞保護は、細胞の形態、密度、グルタチオンの細胞内レベル、UCP2遺伝子発現、および細胞生存率を分析することによって評価した。いずれも、トランスフェクトされたRPE細胞は、非トランスフェクトされたPEDFおよびGM-CSFおよび未導入の細胞および未導入の細胞(市販または遺伝子組み換え細胞から精製された)で前処理された細胞は、非治療対照と比較して有意な抗酸化細胞保護を示した。本H2O2-modelは、AMDまたは類似の神経変性疾患を治療するのに有効であり得る因子の抗酸化効果を評価するための簡便かつ有効なアプローチである。

Introduction

ここで説明するモデルは、細胞内の酸化ストレスを低減するためのバイオ医薬品の効率を評価するのに有用なアプローチを提供する。このモデルを用いて、高レベルのO2に曝露される網膜色素上皮細胞に対するH2O2-媒介酸化ストレス、可視光、光受容体外皮膜の貪食作用、活性酸素種(ROS)1に対する保護効果を調べた。 2.彼らは血管の加齢黄斑変性症(aAMD)3、4、5、6、7、8の病因に大きく貢献していると考えられている。また、RPE合成神経保護因子、特に色素上皮由来因子(PEDF)、インスリン様成長因子(IIF)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)がRPE細胞の機能不全および喪失をもたらし、続いて光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死亡が減少している。.AMDは、代謝、機能、遺伝的、および環境因子4間の相互作用から生じる複雑な疾患である。aAMDの治療の欠如は、先進国9,10の60歳以上の患者における失明の主な原因である。PEDFおよびGM-CSFを過剰発現する遺伝子組み換えRPE細胞の遺伝子組み換え後移植による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を軽減し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性を秘めている11、12、13、14、15、16.細胞に遺伝子を送達するいくつかの方法論があるにもかかわらず、我々は、その安全性プロファイル、宿主細胞のゲノムへの遺伝子の統合、および以前に示したように非転写活性部位に提供された遺伝子を統合する傾向のために、PEDFおよびGM-CSF遺伝子をRPE細胞に送達する非ウイルス性多動性睡眠美容トランスポゾンシステムを選択した。 18,19.

細胞酸化ストレスは、過酸化水素(H2O2)、4-ヒドロノネナー(HNE)、テルブチルヒドロペルオキシド(tBH)、高酸素張力、可視光(全スペクトルまたはUV照射)20、21を含む、いくつかの酸化剤によってインビトロで培養された細胞において誘導され得る。高い酸素の緊張およびライトは他のシステムへの移動性を制限する特別な装置および条件を要求する。H2O2、HNE、およびtBHなどの薬剤は、分子および細胞変化と重なり合う酸化ストレスを誘発する。我々は、RPE細胞が感光体外セグメント食細胞化22中に活性酸素中間体としてRPE細胞によって産生され、生体23の眼組織に見られるため、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化活性を試験するためにH2O2を選択した。グルタチオンの酸化は、目の中のH2O2の産生に部分的に関与する可能性があるため、我々は、H2O2誘導酸化ストレスおよび細胞21,22の再生能力に関連するGSH/グルタチオンのレベルを分析した。グルタチオンレベルの分析は、眼24における抗酸化保護機構に関与するため、特に関連性が高い。H2O2への曝露は、RPE細胞1、25、26、27、28、29、30、および加えて、酸化ストレスの「生理学的」な刺激源である、酸化ストレスの「生理学的」源であるRPE細胞の酸化ストレス感受性および抗酸化活性を調べるモデルとして頻繁に使用される。

神経保護因子の機能性と有効性を評価するために、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するように遺伝子組み換え細胞によって発現される成長因子の抗酸化効果を定量化する分析を可能にするインビトロモデルを開発した。ここでは、PEDFおよびGM-CSFの遺伝子にトランスフェクトされたRPE細胞は、細胞の形態、密度、生存率、グルタチオンの細胞内レベル、およびミトコンドリア非結合タンパク質2の発現によって証明されるように、非トランスフェクション対照細胞よりもH2O2の有害な影響に対してより耐性があることを示す(ROS1酸素種)。

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Protocol

人間の目の収集と使用のための手順は、研究のための教育倫理委員会によって承認されました (no. 2016-01726).

1. 細胞の分離と培養条件

  1. ヒトARPE-19細胞株
    1. ダルベッコの修飾ワシのミディアム/栄養素混合物F-12ハム(DMEM/ハムのF-12)に10%のウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリンを加えた培養5 x 105 ARPE-19細胞、 T75フラスコの加湿雰囲気で37°Cで80μg/mLレンサプレプトマイシン、2.5μg/mLアンホテリシンB(完全培地)を37°Cで、T75フラスコの5%CO2および95%の空気の空気(他の細胞密度については表1参照)
    2. 週に 3 回、メディアを変更します。
    3. 細胞が約90%合流(定性評価)に成長したら、培地を吸引し、滅菌1x PBSで細胞を洗浄する。
    4. 細胞を37°Cで7〜10分間の5%トリプシン-2%EDTA溶液でインキュベートする(容積については 表1参照)。デタッチメントを視覚的に監視します。
    5. 10% FBS を含む完全なメディアを追加してトリプシン化を停止します(ボリュームについては 表 1を参照)。
    6. 細胞をトランスフェクト(プロトコルのステップ2.参照)、細胞を1:10(週に1回)の割合でサブ培養するか、96ウェルプレートに播種します(プロトコルのステップ3.3と3.4を参照)。
ミディアム(mL)
エリア (cm²) ARPE-19細胞(細胞/ウェル)の播種密度 アプリケーション 細胞培養用 トリプシンを停止するには トリプシンの体積(mL)
フラスコ T75 75 5,00,000 ARPE-19細胞増殖 10 7 3
6 ウェルプレート 9.6 1,00,000 トランスフェクトARPE-19細胞の播種 3 1 0.5
24 ウェルプレート 2 50,000 トランスフェクトされたhRPE細胞の播種 1 0.8 0.2
96 ウェルプレート 0.32 トランスフェクト細胞による酸化ストレス実験用5,000個(図1) 酸化ストレス実験 0.2
非トランスフェクト細胞とタンパク質を用いた酸化ストレス実験用3,000個(図1)

表1:細胞培養量。ARPE-19およびヒト初等型RPE細胞の培養に適した細胞培養プレートおよびフラスコに推奨される培地量。

  1. ヒト初等RPE細胞
    1. Thumann et al.17で説明した一次ヒト RPE 細胞を分離し、培養細胞を 20% FBS を添加した完全培地中に含む。
    2. 週に 2 回メディアを変更します。細胞が合流に達したら(視覚的に監視)、過成長を避けるためにFBSを1%に減らします。
    3. 細胞をトランスフェクト(プロトコルのステップ2を参照)、または96ウェルプレートに播種します(プロトコルのステップ3.3と3.4を参照)。
      注:ここに提示されたデータは、4人のヒトドナーの目から得られたRPE細胞の培養物から収集された。 表2 は、ライオンズ・ギフト・オブ・サイト・アイバンク(セントポール、MN)からの寄付者の人口統計を詳述しています。ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド・コンセントが得られた後、目は12.7±5.7時間(平均±SD)死後に核化された。
いいえ 年齢 ジェンダー 死を保存する(時間) 死から孤立へ 耕作 耕作 グラフ内の記号
(日) トランスフェクション前(日) トランスフェクション後(日)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
意味する 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

表2:網膜色素上皮細胞に対するヒトドナーの人口統計

2. ARPE-19およびヒト初原生RPE細胞のエレクトロポレーション

  1. プロトコルのステップ 1.1.3-1.1.5 で説明されているように、ARPE-19 細胞またはヒトのプライマリ RPE 細胞をトリプシン化します。
  2. 市販のトランスフェクションキットでエレクトロポレーションを行います( 材料表参照)。
    1. ARPE-19細胞のトランスフェクションについては、Johnenら32と、Thumannらへの一次hRPEを参照してください。簡単に言えば、 1 x 10 5 ARPE-19細胞または5 x 104の一次hRPEセルを11 μLのRバッファーに再サスペンドし、0.03 μg pSB100Xトランスを含むプラスミド混合物を2 μL加える33および0.47 μg pT2-CMV-PEDF-彼またはpT2-CMV-GMCSF-トランスポゾン(トランスポザーゼ比:トランスポゾン1:16)。PEDFおよびGM-CSF二重トランスフェクション細胞の場合、1:16:16(0.03 μg pSB100X、0.47μg pT2-CMV-PEDF-His、および0.47 μg pT2-CMV-GMCSF-His)の比率を使用してください。ARPE-19細胞の場合は、20 ms(パルス幅)の1,350 Vの2パルスを使用します。1 次細胞の場合は 20 ミリ秒の場合、1,100 V の 2 つのパルスが使用されます。
  3. 種子1 x 105 トランスフェクションARPE-19または5 x 104 トランスフェクトされた原発hRPE細胞を6ウェルおよび24ウェルプレートで、抗生物質または抗ミコティックなしで10%FBSを添加した培地で。トランスフェクションの3日後にペニシリン(80 U/mL)、ストレプトマイシン(80μg/mL)、アンホテリシンB(2.5 μg/mL)を加えます。
  4. 細胞の顕微鏡モニタリングを週1回で行い細胞増殖を決定する。トランスフェクション効率は、RT-PCRによる遺伝子発現の解析、およびELISAおよびWBによるタンパク質分泌( 補足材料で説明した方法)によって監視される。
    注:トランスフェクション効率は、細胞が合流度に達すると初めて、すなわち、ARPE-19細胞および原発性hRPE細胞のトランスフェクション後〜7日および4週間で初めて評価することができる。
  5. 96 ウェルプレートのシードセル (プロトコルのステップ 3.5 を参照)。

酸化ストレス誘導(H2O2治療)と神経保護(PEDFおよび/またはGM-CSF治療)

  1. トランスフェクトARPE-19細胞のコンディション培地の調製
    1. PEDF、GM-CSF、またはその両方の遺伝子にトランスフェクトされたARPE-19細胞を使用してください(プロトコルのステップ2を参照)。培養細胞は、プロトコルのステップ1.1に記載されているように28日間培養する。
    2. トランスフェクション後28日で、トリプシン化細胞(プロトコルのステップ1.1.3-1.1.5を参照)、ニューバウアーチャンバー34、35、およびT75フラスコの種子5 x105細胞を完全な媒体に数えます。細胞培養が約80%コンフルエントである場合に培地を交換する(約1週間後、定性的に検証される)。24時間後に培地を収集します。
    3. 使用するまで-20°Cで保存してください。
      注: コンディショナリ培地中の組換え PEDF および GM-CSF の十分な濃度を WB で検証し、 補足材料に記載されているように ELISA で定量しました。
  2. トランスフェクトARPE-19細胞のコンディション培地からのPEDFおよびGM-CSFの精製
    1. 4°Cで15分間10,000 x g でステップ3.1.2から回収された培地を遠心分離する。
    2. 以下に説明するように、メーカーのプロトコルに従ってNi-NTAスーパーフロー( 材料表を参照)を使用して、Hisタグ付きタンパク質を精製してください。
      1. 30sの2,600 x g で1.5 mLチューブと遠心分離機にNi-NTA混合物のピペット30 μLを、フロースルーを廃棄します。ペレットを200 μLの1xインキュベーションバッファーで2回洗浄します。
      2. 30 sの2,600 x g で遠心分離機を使用し、フロースルーを廃棄します。4xインキュベーションバッファーの40 μLを追加し、再中断します。
      3. 900 μLの遠心分離調整された培地を加え、RT.遠心分離機で1分間、70rpm(軌道シェーカー)でインキュベートします。
      4. 1xインキュベーションバッファーの175 μLでペレットを2回洗浄します。30 sの2,600 x g で遠心分離機を使用し、フロースルーを廃棄します。
      5. His タグ付き PEDF および GM-CSF タンパク質を溶出するには、溶出バッファーを 20 μL 追加し、RT. 30 s の 2,600 x g で 20 分間、70 rpm (軌道シェーカー) でインキュベートします。組み換えPEDFまたはGM-CSFを含む上清を保管してください。
    3. メーカーの指示に従って、市販のBCAタンパク質アッセイキット( 材料表を参照)を使用して、全タンパク質を定量化します。
    4. 使用するまで-20°Cでタンパク質溶液を保管してください。
      注:インキュベーションバッファ(4x)は200 mM NaH2PO 4、1.2 M NaCl、および40 mMイミダゾールを含みます。溶出の緩衝は50 mM NaH2PO 4、300 mM NaCl、および250 mMイミダゾールを含んでいる。
  3. コンディションされた培地とH2O2を用いた非トランスフェクトARPE-19/プライマリhRPE細胞の治療(図1A)
    1. シード 3,000 非トランスフェクション ARPE-19 (プロトコルのステップ 1.1.6 から) またはプライマリ hRPE (プロトコルのステップ 1.2.3 から) 細胞 96 ウェルプレートおよび培養 200 μL のコンディショニングされた培地のトランスフェクション ARPE-19 細胞から。
    2. 5%CO2及び95%空気の加湿雰囲気で37°Cで10日間培養した。毎日コンディショムを入れ替えます。細胞を350μMH2O2に24時間曝します。
    3. 酸化ストレス損傷を評価し、グルタチオンレベル(プロトコルのステップ4.1を参照)、顕微鏡(プロトコルのステップ4.2を参照)、および細胞毒性アッセイ(プロトコルのステップ4.2を参照)の定量化により、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化効果を決定します。
      注: 実験の期間は 12 日間です。透明な平底マイクロウェルプレートは、細胞形態と同様に発光を評価するために使用されます。細胞毒性とグルタチオンアッセイを同時に行うには、2枚のプレートを同じ日に細胞で播種する必要があります。
  4. PEDFおよびGM-CSF増殖因子とH2O2を加えた非トランスフェクトARPE-19/一次hRPE細胞の治療(図1B)
    1. シード 3,000 非トランスフェクション ARPE-19 (プロトコルのステップ 1.1.6 から) またはプライマリ hRPE (プロトコルのステップ 1.2.3 から) ウェルあたりのセル (平坦な底を持つ 96 ウェルプレート) 500 ng/mL 組み換え PEDF および/または 50 ng/mL 組換え組換え CSF,CSF,500 ng/mL 組換え体 PEDF および/または 50 ng/mL 組換え CSF,500 ng/mL 組換え組換え CSF を含む完全な培地の 200 μL の完全な培地 トランスフェクションARPE-19細胞または市販の培地から精製。培養細胞は、5%CO2及び95%空気の加湿雰囲気下で37°Cで48時間培養した。PEDF および GM-CSF の成長要因を含む培地を毎日更新します。
      注: 新しい成長因子を培地に追加します。
    2. 増殖因子で細胞を処理した48時間後、培地を取り除き、350 μM H2O2 プラス500 ng/mL PEDFおよび/または50 ng/mL GM-CSFを含む完全な培地を加えます。
    3. 酸化ストレス損傷を評価し、グルタチオンレベル(プロトコルのステップ4.1を参照)、顕微鏡(プロトコルのステップ4.2を参照)、および細胞毒性アッセイ(プロトコルのステップ4.2を参照)の定量化により、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化効果を決定します。
      注: 実験の所要時間は 3 日間です。
  5. H2O2を用いてトランスフェクトARPE-19/プライマリhRPE細胞の治療(図1C)
    1. 補足材料に記載されているようにWBおよびELISAによるトランスフェクト細胞の十分な遺伝子発現およびタンパク質分泌を検証する。
    2. トランスフェクトされた細胞を含むウェルから培地を取り出します(プロトコルのステップ2を参照)。
    3. プロトコルのステップ 1.1.3-1.1.5 で説明されているようにセルをトリプシン化します。ノイバウアーチャンバー34、35を使用して細胞を数えます。
    4. 完全な媒体の200 μLの96-wellプレートに5,000のトランスフェクト細胞/ウェルを入れ。培養細胞は、5%CO2及び95%空気の加湿雰囲気下で37°Cで24時間培養した。24時間後、細胞を24時間350μMH2O2に曝します。
    5. 酸化ストレス損傷を評価し、グルタチオンレベル(プロトコルのステップ4.1を参照)、顕微鏡(プロトコルのステップ4.2を参照)、細胞毒性アッセイ(プロトコルのステップ4.2を参照)、 およびUCP2 遺伝子発現の測定(プロトコルのステップ4.3を参照)の定量によって、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化効果を決定する。
      注: 実験の期間は 2 日間です。

Figure 1
図1:3つの異なる実験手法におけるH2O2アッセイのタイムライン3,000個の非トランスフェクト細胞を、条件培地/組換えタンパク質または5,000個のトランスフェクト細胞で処理し、H2O2で処理するために96ウェルプレートに播種した。コンディショネ培地の効果を決定するために、細胞を100%連続培養培地で10日間培養し、毎日培地を変化させる。組換え増殖因子の効果を決定するために、細胞は3日間連続して毎日適切な量の増殖因子を加えて培養した。非トランスフェクト細胞は、トランスフェクト細胞と比較して培養期間が長い間の過剰増殖を避けるために、ウェルあたり3,000個の細胞で播種することに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 酸化ストレスレベルと抗酸化力の解析

  1. グルタチオンアッセイ
    1. メーカーの指示に従って、市販キット( 資料表を参照)を使用してグルタチオン(GSH)レベルを測定します。簡単に、調製し、適切な量の1x試薬ミックス(100 μL試薬/ウェル):ルシフェリン-NT基質とグルタチオンS-トランストランスナーゼ希釈1:100反応バッファー。
      注:96ウェルプレートは、10mLの1x試薬ミックスを必要とし、ルシフェリン-NT基質100μLと100μLのグルタチオンS-トランスパーゼを10mLの反応バッファーに加えることで調製されます。使用直前に1x試薬ミックスを準備してください。今後の使用のために準備された試薬ミックスを保管しないでください。
    2. リコンフィションバッファーのボトル 1 本を凍結乾燥したルシフェリン検出試薬に移して、ルシフェリン検出試薬を調製します。
    3. グルタチオン(GSH)標準溶液(5mM)を使用して標準曲線を調製します。希釈5 mM GSH溶液 1:100 dH2O(dH2Oの990 μLに5 mM GSH溶液の10 μLを加える)。dH2 O.各希釈規格の 10 μL を適切なウェルに転送して、dH 2 O の 500 μL で 7 シリアル 1:1 希釈を実行します。
      注意:グルタチオンの最終濃度は0.039 μMから5 μMの範囲です。
    4. ブランク(1x試薬ミックス)を準備し、適切なウェルに10 μL(重複)を移します。
    5. H2O2-処理細胞をインキュベーターから取り出す。
      注:明視野顕微鏡(40x)によってH2O2-処理細胞の形態を文書化します。
      細胞が酸化されると、彼らはより丸みを帯びた、より少ない広がりを見ます。
    6. 慎重に培養液を吸引する。調製した1x試薬ミックスを100μLずつ各ウェルに加えます。細胞を500rpmで15sの試薬と共にオービタルシェーカーで混ぜます。
    7. RTでプレートを30分間インキュベートします。100 μLの再構成されたルシフェリン検出試薬を各ウェルに加えます。
    8. 軌道シェーカーで500rpmで15 sの溶液を混ぜます。RTでプレートを15分間インキュベートします。
    9. プレインストールされたプログラムADP-Gloを使用してプレートリーダーを使用して発光を決定します。
      メモ:プレートを蓋なしでプレートリーダーの中に入れてください。
      1. レイアウトを 変更 をクリックし、 基本パラメータ: Costar 96-wellプレートで次の設定を選択します。トップオプティカル;位置決め遅延: 0.1;測定開始時間: 0.0;測定間隔時間:1.0;結果を正規化する時間: 0.0;ゲインはデバイスによって自動的に調整されます。ブランク、標準、およびサンプルを定義します。[ 計測の開始] をクリックします。
      2. データを Excel ファイルとしてエクスポートします。標準曲線の補間によって各サンプル中のGSH濃度を計算します。
  2. 細胞毒性アッセイと顕微鏡解析
    1. 細胞から培地を吸引し、各ウェルに1%FBSを含む完全な培地の100 μLを加えます。細胞をインキュベーターに戻します。
      注: 1% FBS は、FBS の高い割合が発光の測定を妨げる可能性があるため、この場合は 1% FBS が使用されます。
    2. 市販の細胞毒性アッセイキット( 材料表参照)を使用して、製造者の指示に従って細胞の生存率を測定します。簡単に言えば、試薬ミックスを調製し、凍結乾燥した基質にアッセイバッファーを加える。5 mLアッセイバッファーに33 μLジトニンを加えて、リシス試薬を調製します(96ウェルプレート1個)。均質性を確保するために上下にピペットでよく混ぜます。
      注:最適な結果を得るには、準備した新しい試薬ミックスを使用してください。RTで保存した場合は12時間以内に使用してください。 凍結と解凍は避ける必要があります。リシス試薬は、最大7日間4°Cで保存できます。
    3. 未処理の ARPE-19 セルを使用して標準曲線を作成します。
      1. プロトコルのステップ1.1.3-1.1.5に記載されているように細胞をトリプシン化し、ノイバウアーチャンバー34、35を使用して細胞を数える。RTで120gで細胞を遠心分離し、上澄み液を吸引し、1%FBSを含むDMEM/HamのF12培地中の細胞ペレットを1 x 105細胞/mLの最終濃度に再懸濁する。
      2. 1%FBSを含む200 μL培地に7個のシリアル1:1希釈液を用意します。各規格の100 μLを適切なウェル(重複)に移します。すべてのウェルに試薬ミックスの50 μLを追加します。
    4. 細胞を500rpmで15sの試薬と共にオービタルシェーカーで混ぜます。RTでプレートを15分間インキュベートし、プロトコルのステップ4.1.9に記載されているようにプレートリーダーを使用して発光を測定します。50 μLのリシス試薬を加え、15分間インキュベートします。プロトコルのステップ4.1.9に記載されているように、プレートリーダーを用いて発光を測定する。
    5. 生存細胞の割合を計算します: (100 - % 死んだ細胞) および死んだ細胞の割合 = [第1発光測定 ((標本中の死細胞))/第2の発光測定 (デジトニン処理後全細胞死) x 100.
  3. RT-qPCR によるUCP2発現解析
    1. 上記のようにトランスフェクトされた細胞をトリプシン化する(プロトコルのステップ1.1.3-1.1.5)。
    2. ノイバウアーチャンバー34、35を使用して細胞を数えます。
    3. シード 5,000 トランスフェクション ARPE-19 細胞/ウェル 96 ウェルプレート.
    4. 24時間培養した後、350μMH2O2で24時間細胞を処理します。
    5. メーカーの指示に従って、低い細胞からRNAを単離するための商業キットを使用して、トータルRNAを分離します( 材料表を参照)。
    6. 補足材料に記載されているように、リアルタイム定量 PCR (RT-qPCR) を実行します。簡単に説明すると、最適化されたM-MLV逆転写酵素を含む市販のミックスを用いて転写によってcDNAを生成する(資料表を参照)。
    7. qPCRの場合は、プライマー(補足材料の表S1を参照)およびDNAテンプレートを除くすべての成分(SYBRグリーンを含む)を含むすぐに使用できる反応カクテルを使用します。次のサーモサイクリング条件を使用してください:10分間95°Cでの最初の変性、15のsの95°Cで変性を伴う40サイクル、30のsのための60°Cでのアニール、および32のsのための72°Cで伸び。
    8. 分析36に 2^(ΔΔCT) 法を使用します。
  4. pAktのSDS-PAGEおよびWB分析のための細胞ライセートの調製(Ser473)
    1. Seed 3 x 105 GM-CSF トランスフェクト ARPE-19 細胞/ウェル 6 ウェルプレート (トランスフェクション後 ≥21 日) を使用して、AKT 生存経路15の活性化を通じて H2O2による損傷から RPE 細胞を保護するかどうかを決定する。
    2. 24時間培養細胞の後、350 μMH2O2に24時間曝露される。
    3. 1 mL の RIPA バッファーにプロテアーゼホスファターゼインヒビターカクテル 10 μL、0.5 M EDTA の 10 μL、8 M 尿素 25 μL (1 ウェルに使用されるボリューム) を混合します。
    4. 慎重に培地を吸引し、1x PBSで細胞を洗浄します。
    5. RIPA バッファー ミックスのボリューム全体をセルに追加します。
    6. ピペットの上下。
    7. 1.5 mLチューブでライセートを収集します。
    8. 4°Cで30分間20,000xgで遠心分離機。
    9. 上清を新しい1.5 mLチューブに移します。
    10. 補充材料に記載されているようにWBによって未希釈細胞のリセートの15 μLのpAktのレベルを決定する。

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Representative Results

ヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導
ARPE-19および一次hRPE細胞を24時間H2O2の様々な濃度で処理し、抗酸化グルタチオンの細胞内レベルを定量化した(図2A、B)。H2O2は50μMおよび100μMでグルタチオンの産生に影響を与えなかったのに対し、350μMではARPE-19および一次hRPE細胞においてグルタチオンが有意に減少した。細胞毒性の分析は、350μMが細胞生存率の有意な低下を引き起こすH2O2の最低濃度であることを示した(図2C)。形態学的には、H2O2で処理されたARPE-19細胞は、より広がり、より丸みを帯びて見えない、H2O2濃度の増加に伴ってより明白になる特性(図3)。この効果は、H2O2で処理されたPEDFおよびGM-CSFトランスフェクト細胞にはあまり顕著ではなかった(図3)。H2O2-媒介酸化ストレスに対する細胞数の効果を実証するために、1ウェル当たり5,000および10,000 ARPE-19細胞を白い96ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を350μMH2O2で24時間処理し、グルタチオンのレベルを決定した。図4は、5,000個の細胞を播種したウェル(n=3)でのみグルタチオンのレベルが低下したことを示す。H2O2生成ROSの抗酸化物質の効果を決定する実験のためには、細胞の数を考慮することが不可欠です。この報告書に示す特定のプロトコルについては、350μMH2O2で24時間処理された3,000-5,000細胞/ウェル(96ウェルプレート)は、酸化ストレス誘発細胞損傷に対する急性以下の応答を模倣して回復する能力を保持しながら、有意な細胞損傷を示すために適切である。

Figure 2
図2:グルタチオンレベルおよび細胞生存率として証明された酸化ストレスレベルは、H2O2で処理されたヒトRPE細胞において、H2O2の数濃度に曝露されたARPE-19細胞では、350μMでグルタチオンレベル(括弧内)が有意に低下した(0.66 μM)、500 μM(0.022 μM)、700 μM(0.002 μM)とH2O2非処理細胞(2.9 μM)(p<0.0001(350μM) 500、および700 μM H2 O2)。(B) 初等ヒト RPE細胞はグルタチオンの減少したレベルを示した。しかし、この効果はARPE-19に比べてあまり顕著ではなかったが、350、500、および700μMH2 O2の制御と比較して統計的に有意であった。350 μM は、非処理コントロール細胞と比較してグルタチオンレベルの低下によって示されるように、重要な酸化的損傷を生じた H2O2濃度の最も低い値でした (p = 0.0022)。グルタチオン濃度は、H2 O2濃度の増加に伴って減少した(500 μM:p = 0.022;700 μM:p = 0.0005)。(C)細胞毒性分析は、350μMH2O2が生存細胞の割合の有意な減少を生じた最も低い濃度であることを示した(p <350、500、および700μMの0.0001)。データは平均±SD(n = 3反復)として提示され、有意差は(*)で示されます。ANOVAの事後計算は、C-とH2O2-治療群を比較するTukeyの多重比較検定を用いて行われた。C-:H2O2非処理細胞。この図はバスクアスら37から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:非トランスフェクトおよびPEDFまたはGM-CSFトランスフェクションARPE-19細胞の形態は、H2O2で処理された。H2O2の濃度を増加させて処理した細胞は、培養井戸内の細胞が少なく、より丸みを帯びた広がりモルフォロジー、細胞ストレスの既知の徴候を示す。PEDFまたはGM-CSFトランスフェクション細胞の場合、細胞ストレスはあまり顕著ではなく、非治療コントロール細胞と同様に成長することに注意してください。C-: 非処理コントロールセル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:細胞数がH2O2誘導酸化ストレスの影響に及ぼす影響5,000および10,000 ARPE-19細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を350μMH2O2で24時間処理した。グルタチオンレベルの有意な差は、5,000個の細胞(p = 0.031、t-test)で播種されたウェルでは認められたが、10,000個の細胞を播種したウェルでは認められなかった。 C-: 非処理細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

酸化ストレス状態におけるSB100XトランスフェクトヒトRPE細胞で送達されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化作用の解析
陽性コントロールとして、ARPE-19および一次ヒトRPE細胞を、24時間H2O2処理の前および2日間の間に市販のPEDFまたはGM-CSFの5、50、または500 ng/mLで処理した。500 ng/mL PEDFまたは50 ng/mL GM-CSFで処理されたARPE-19細胞は、酸化条件下での未処理のコントロールと比較して有意に多くのグルタチオンを産生した(H2O2-処理) (図5A);トランスフェクトARPE-19細胞の培養培地から精製された同程度のPEDFおよびGM-CSFは、同様の効果を示した(図5B)。原発性hRPE細胞では、500 ng/mL PEDF、50ng/mL GM-CSF、または500 ng/mL PEDFプラス50ng/mL GM-CSFを加えて、PEDFまたはGM-CSFトランスフェクションARPE-19細胞がトランスフェクションARPE-19細胞トランスフェクションARPE-19細胞によって調整された培地から精製された場合、細胞損傷を減少させる(5CCレベルの有意な増加によって反映された)トランスフェクトARPE-19細胞から10日間のコンディション培地で処理された原発hRPE細胞も、コントロール細胞と比較して高いグルタチオンレベルを示した(図5D)。これらの結果に基づいて、PEDFの場合は500 ng/mL、GM-CSFでは50ng/mLでさらに実験が行われています。

ARPE-19および原発性hRPE細胞は、エレクトロポレーションと組み合わせた眠れる美容トランスポゾンシステムを使用して、PEDFおよび/またはGM-CSF用の遺伝子をコードする遺伝子でトランスフェクションした。RT-qPCR、WB、ELISA、免疫細胞化学による遺伝子発現のトランスフェクションと分析(補足物質、図S1、および図S2を参照)に続いて、350μM H2O2に曝露された24時間のトランスフェクトARPE-19細胞は、非トランスフェクトH2O2-処理細胞よりも有意に高いグルタチオンレベルを示した(図6A ).原発性hRPE細胞の場合、全てのドナーが分析に含まれていた場合、H2O2で処理された非トランスフェクト細胞と比較して、PEDFトランスフェクション細胞におけるグルタチオンレベルが有意に増加する。さらに、ドナー2および3は、全てのトランスフェクト群(PEDF、GM-CSF、PEDF、およびGM-CSF)に対してグルタチオンレベルの有意な増加を示す(データは示さない)。

UCP2遺伝子発現の研究は、ミトコンドリア酸化ストレスの検討による解析を完了した。350 μM H2O2で 24 時間処理されたトランスフェクション ARPE-19 細胞で概念実証シリーズを実施しました。図7に示すように、トランスフェクトARPE-19細胞では、H2O2処置後のUCP2遺伝子発現のレベルは増加するが、その増加は統計的に有意ではない。図8は、H2O2に曝露したGM-CSFトランスフェクト細胞のリセートからのリン酸化Akt(pAkt)のWBを示す。正規化されたデータは、未処理のコントロールと比較してわずかな減少しか示していない、GM-CSFが酸化ストレス損傷から細胞を保護できることを示しています。

Figure 5
図5:PEDF及びGM-CSFの抗酸化能のマーカーとしてのグルタチオンレベル(A)ARPE-19細胞の治療中に500 ng/mL PEDFまたは50 ng/mL GM-CSFを3日間、および24時間H2O2曝露の間に、0.83 μM(PEDF)および1.3μM(GM-CSF)に増加させた。 p = 0.026 と p = 0.031 それぞれ。5 ng/mLの濃度ではグルタチオンの増加は観察されなかった;50と500 ng /mLの間のグルタチオンのレベルの差は、PEDFまたはGM-CSFのいずれにも有意ではなかった。(B) トランスフェクション ARPE-19 細胞のコンディションされた培地から精製された PEDF (500 ng/mL) および GM-CSF (50 ng/mL) は、市販の PEDF または GM-CSF (p = 0.018, ANOVA) と同様の効果を示した。(C) 500 ng/mL PEDF、50ng/mL GM-CSF、または500 ng/mL PEDFプラス50 ng/mL GM-CSFの3日前および24時間HRPE細胞の培地中に50 ng/mL GM-CSFを加えて、一次hRPE細胞の培地に対する治療は、PEDF(2.6μM)で処理された細胞中のグルタチオンのレベルを有意に増加させた[2.6]商業用 2.5 μM [精製] 、GM-CSF (2.9 μM [商業]、 3.3 μM [精製]) 、および PEDF プラス GM-CSF (3.0 μM [商業], 2.9 μM [精製]) 非処理セル (p = 0.006, クルカスカルスウォリス試験).(D)グルタチオンレベルの有意な増加は、細胞がH2O2で処理される前に、PEDF-、GM-CSF-またはPEDF-GM-CSF-トランスフェクションARPE-19細胞から10日間培養されたhRPE細胞について観察された(p = 0.003、クルスカル・ワリス試験)(1つのドナーに対するデータが示された)。データはSD±平均として表現されます(n = 3反復)。有意差は(*)で示されます。分散分析のポストホック計算は、"C"とPEDF-GM-CSF処理群を比較するTukey'sまたはDunnettのマルチ比較検定を計算することによって行われた。C:H2O2のみで処理された細胞、P:PEDFで処理された細胞、G:GM-CSFで処理された細胞、P+G:PEDF+GM-CSFで処理された細胞。この図はバスクアスら37から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:PEDFおよびGM-CSFトランスフェクトヒトRPE細胞の抗酸化能のマーカーとしてのグルタチオンレベル(A)トランスフェクトされたARPE-19細胞のグルタチオンのレベルは、24時間(トランスフェクション後56日間)に曝露された350μMHH(トランスフェクション後56日間)、すなわち、PEDF-およびGM-CSFトランスフェクト細胞の3.0μMと比較して有意に高かった。 二重トランスフェクトされた細胞のための3.4 μM(p = 0.0001、ANOVA)。データは平均±SD(n = 3反復)で表されます。(B)ドットプロットは、4つの異なるドナーの平均グルタチオン値を示す(C:0.77 μM;P:1.45 μM;G:1.16 μM;P+G:1.2μM)は、非トランスフェクト細胞とPEDFトランスフェクト細胞の間で有意に異なる(p = 0.028、ANOVAのポストホック計算は、PEDF-/GM-CSF処理群と「C」を比較するTukeyのマルチ比較テストを使用して行われた)。ドナーを別々に分析すると、ドナーN°2およびN°3(グラフ中の記号については表2参照)は、H2O2で治療された非トランスフェクト対照(有意性は示されていない)と比較して、全てのトランスフェクション群に有意差を示す。C:非トランスフェクト細胞、P:PEDFトランスフェクト細胞、G:GM-CSFトランスフェクト細胞、P+G:PEDF-およびGM-CSFトランスフェクト細胞。この図はバスクアスら37から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7: H2O2で処理したトランスフェクトARPE-19細胞におけるUCP2遺伝子発現UCP2遺伝子発現はミトコンドリア酸化損傷を調べるために使用することができるので、トランスフェクトARPE-19細胞によるPEDFおよびGM-CSFの過剰発現の効果を調べた。H2O2で処理されたトランスフェクトARPE-19細胞は、統計的に有意ではないが、酸化ストレス低減を示す非トランスフェクション対照と比較してUCP2遺伝子発現の増加を示し、フォールド増加はPEDF-で1.57、GM-CSF-で1.51、およびPEDFに対して2.36であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:リン酸化Akt(Ser473)のウェスタンブロットを、GM-CSFトランスフェクトARPE-19細胞の細胞リセートから。WBは、GM-CSFが未治療およびH2O2-処理培養物の両方でAktのリン酸化を増強することを実証した(UT:3.32;H2O2: 2.69)。これらの値は、非トランスフェクト非H2O2-処理細胞(C/UT)に正規化されます。C:非トランスフェクト、G:GM-CSFトランスフェクト細胞、UT:H2O2で非処理された細胞、H2O2:H2O2で処理された細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表S1:プライマーペア配列および焼鈍時間/温度をRT-qPCRに使用する。 こちらの表をダウンロードしてください。

図S1:トランスフェクトhRPE細胞における PEDF および GM-CSF 遺伝子発現解析 RT-qPCRは、トランスフェクトされた原発hRPE細胞が、非トランスフェクト細胞と比較して PEDF(p= 0.003、クルスカル・ウォリス試験)および GM-CSF(p = 0.013、クルスカル・ウォリス試験)遺伝子発現の有意な増加を示したことを確認した。2^(-ΔΔCT) メソッドは、この場合36で使用されました。データはSD±平均として表される(n=4ドナー)。各ドットは、3 つの反復の平均を表します。この図はバスクアスら37から変更されています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

図S2:トランスフェクト原発hRPEおよびARPE-19細胞におけるタンパク質分泌 (A) ELISAによる分泌タンパク質の定量化により、トランスフェクトhRPE細胞は、非トランスフェクト細胞よりも有意に多くのPEDFおよびGM-CSF(PEDFの場合はp = 0.014、およびGM-CSF、クルスカル・ウォリス試験の場合はp = 0.006)が分泌されたことを示した。データはSD±平均として提示される(n =4ドナー)。各ドットは、3 つの反復の平均を表します。(B) PEDF-GM-CSF二重染色により、二重トランスフェクションARPE-19細胞におけるPEDFとGM-CSFの共分泌が確認された(結合図)。この図はバスクアスら37から変更されています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足材料。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここで紹介するプロトコルは、トランスフェクトされた細胞によって産生されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化および保護機能を分析するアプローチを提供し、これは任意の推定有益な遺伝子をトランスフェクトした細胞に適用することができる。遺伝子組換え細胞を移植してタンパク質を組織に送達することを目的とする遺伝子治療戦略では、タンパク質発現のレベル、発現の長さ、および発現タンパク質の有効性に関する情報を得ることが重要です。我々の研究室では、ここで提示されるプロトコルは、aAMD6,7の病因において重要な要素として仮説されている酸化ストレスに対するPEDFおよびGM-CSFの有効性を定義するのに有用であった。具体的には、このプロトコルを用い、SB100X-媒介PEDF/GM-CSFトランスフェクトされた原発hRPE細胞の抗酸化効果を定義しました。いくつかの研究者は、H2O2が酸化ストレスの重大な症状を誘発するが、24時間の350 μMがヒトARPE-19および一次RPE細胞における効果的な酸化ストレスを誘導することを示した我々の実験の結果と同様に、細胞再生28、29、38を可能にすることを示している。H2O2は、眼内の生理学的存在及び対応する防御機構、例えばグルタチオン代謝20、21のために研究のために選択された。当研究室では、酸化活性金属イオン1の存在下で脂質過酸化を開始するtBHによる細胞の処理など、酸化ストレスの他のモデルを調べました。しかし、酸化ストレスは無視できるものでした。ここで発表した実験では、2〜6時間の治療時間が短い20の治療時間が遺伝子発現20の変化を誘発するのに十分であることがわかったので、細胞は24時間H2O2で処理されたが、その後の結果、例えば、細胞増殖、細胞生存率、およびグルタチオンレベルはまだ見えないかもしれない。さもなければ、細胞毒性およびグルタチオンアッセイに必要な小さい大きさのウェルは、急速にコンフルエント文化に至る。これは、接触阻害および酸化剤の効果のマスキングにつながる可能性があります。したがって、AAMDに見られる変性は慢性酸化ストレス6、7によって引き起こされるが、H2O2との長いインキュベーションは有用ではないようだ。

ここで示した実験の制限は、播種された細胞の数がH2O2の酸化効果に影響を及ぼすこと、すなわち、同じH2O2処理に対して、5,000個の細胞が播種された場合にはH2O2-処理細胞と非処理細胞のグルタチオンレベルの有意な差が認められたことです(図4 ).我々が提示するプロトコルは、細胞が3日間培養される場合は3,000、細胞が2日間培養される場合は5,000個の細胞を播種する必要がある(図1)。もう一つの制限は、時間と共にH2O2の濃度が枯渇していることです。Kaczaraら39は、慢性酸化ストレスモデルの開発に影響を与えるARPE-19細胞培養において、数時間にわたってH2O2の枯渇を示している。これらの研究者は、持続的なH2O2処理のための代替方法を提案しており、具体的にはグルコースオキシダーゼを用いて培地中のグルコースからH2O2を継続的に生成するが、H2O2の標準化された濃度は保証できない。一方、1つのパルスで酸化剤を送達して確立したプロトコルは、H2O2処理を数日間38日間繰り返し行う必要がある慢性モデルと比較して、より速く、より簡単に実行できるという利点を有する。

細胞が酸化的損傷を打ち消す能力は、ROS産生と抗酸化物質を生成する能力とのバランスによって決定される。細胞中では、トリペプチドグルタチオン(GSH)が主要な還元剤であり、これは、グルタチオンジスルフィド(GSSG)に酸化し、NADPH40を利用したグルタチオン還元酵素によって再生することができる。健康な細胞において、総グルタチオンプールの90%以上が減少した形態で存在する。細胞が酸化ストレスの増加レベルにさらされると、GSSGが蓄積し、GSSG対GSHの比率が増加します。その結果、生体試料中のグルタチオン酸化還元状態をモニタリングすることは、酸化ストレスおよび細胞損傷の間に発生するフリーラジカルからの細胞および組織の解毒状態の評価に不可欠である。グルタチオンの定量化についてここで詳述したプロトコルは、遺伝子組み換えのRPE細胞によって発現されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化作用を検出するのに十分に敏感である。

酸化ストレスはミトコンドリア活性40に影響を及ぼすため、特にPEDFによるROSレベルの制御がミトコンドリア非結合タンパク質2(UCP2)の調節に関連しており、また、PEDFはUCP2発現11,41を増加させることで酸化ストレスの影響を減衰させることが特に興味深い。UCP2の主な機能は、ミトコンドリア由来のROSを制御し、ミトコンドリア酸化ストレス41,42のセンサーとして作用する。ここで、グルタチオンレベルに対するPEDFおよびGM-CSFの効果を調べるのに加えて、UCP2の遺伝子発現が増加する傾向がある(図7)。UCP2遺伝子発現に関するPEDFおよびGM-CSFの役割を確立するためには、追加の研究が必要である。

全体として、本H2O2-modelは、患者の細胞に抗酸化治療遺伝子を送達し、神経変性疾患をAMDとして治療することを目的としたトランスポゾンベースの遺伝子治療の有益な効果を調査するための包括的なアプローチを提供する。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

著者らは、グレッグ・シーリーとアラン・コンティに優れた技術支援と、ベルリンのマックス・デルブリュック・センターのツズザンナ・イズスヴァーク教授に感謝したいと考えています。この研究は、第7枠組みプログラムの文脈でスイス国立科学財団と欧州委員会によって支援されました。Z.Iは欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]によって資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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