Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

Thais Bascuas; Martina Kropp; Nina Harmening; Mohammed Asrih; Zsuzsanna Izsvák; Gabriele Thumann

doi:10.3791/61957

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Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

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DOI:

10.3791/61957

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11 de dezembro de 2020

Thais Bascuas¹^,² , Martina Kropp¹^,² , Nina Harmening¹^,² , Mohammed Asrih¹ , Zsuzsanna Izsvák³ , Gabriele Thumann¹^,²

¹Experimental Ophthalmology, University of Geneva, ²Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, ³Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H₂O₂, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.

Resumo

O estresse oxidativo desempenha um papel crítico em várias doenças degenerativas, incluindo a degeneração macular relacionada à idade (AMD), uma patologia que afeta ~30 milhões de pacientes em todo o mundo. Leva a uma diminuição no epitélio do pigmento da retina (RPE)-fatores neuroprotetores sintetizados, por exemplo, fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e fator estimulante da colônia granutócito-macrófago (GM-CSF), seguido pela perda de células RPE, e eventualmente fotorreceptor e morte de células gânglios de retina (RGC). Temos a hipótese de que a reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE transfecidas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular. Usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB100X)as células RPE humanas foram transfectadas com os genes PEDF e GM-CSF e mostraram integração genética estável, expressão genética de longo prazo e secreção de proteínas usando qPCR, mancha ocidental, ELISA e imunofluorescência. Para confirmar a funcionalidade e a potência do PEDF e gm-CSF secretados pelas células RPE transfeinadas, desenvolvemos um ensaio in vitro para quantificar a redução do estresse oxidativo induzido por H₂O₂em células RPE na cultura. A proteção celular foi avaliada pela análise da morfologia celular, densidade, nível intracelular de glutationa, expressão genética UCP2 e viabilidade celular. Ambas as células RPE transfectadas que expressam o FPE e/ou GM-CSF e as células não transfetizadas, mas pré-tratadas com PEDF e/ou GM-CSF (comercialmente disponíveis ou purificadas de células transfetizadas) apresentaram proteção celular antioxidante significativa em comparação com controles não tratados. O atual modelo H₂O₂é uma abordagem simples e eficaz para avaliar o efeito antioxidante de fatores que podem ser eficazes para tratar a AMD ou doenças neurodegenerativas similares.

Introdução

O modelo descrito aqui, oferece uma abordagem útil para avaliar a eficiência dos agentes biofarmacêuticos para reduzir o estresse oxidativo nas células. Utilizamos o modelo para investigar os efeitos protetores do PEDF e do GM-CSF no estresse oxidativo mediado H₂O₂nas células epiteliais do pigmento retinal, que estão expostas a altos níveis de O₂, luz visível, e a fagocitose das membranas do segmento externo fotoreceptor, gerando níveis significativos de espécies reativas de oxigênio (ROS)¹^, ². São considerados um dos principais contribuintes para a patogênese da degeneração m....