Aqui, apresentamos o protocolo para a cultura tecidual 3D do eixo corporal posterior do zebrafish, possibilitando o estudo ao vivo da segmentação de vertebrados. Este modelo de explant fornece controle sobre o alongamento do eixo, alteração de fontes de morfógeno e imagem viva de nível de tecido de resolução subcelular.
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Artigo de método
Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embriões vertebrados padronizam seu eixo corporal principal como somites repetitivos, os precursores de vértebras, músculos e pele. As somitas se segmentam progressivamente do mesoderme presomótico (PSM) à medida que a extremidade traseira do embrião alonga posteriormente. As somitas formam-se com periodicidade regular e escala em tamanho. O zebrafish é um organismo modelo popular, pois é geneticamente tratável e possui embriões transparentes que permitem imagens vivas. No entanto, durante a somitogênese, os embriões de peixe são enrolados em torno de uma grande gema arredondada. Esta geometria limita a imagem viva do tecido PSM em embriões de zebrafish, particularmente em resoluções mais altas que requerem uma distância de trabalho objetiva próxima. Aqui, apresentamos um método de cultura de tecido 3D achatado para imagens vivas de explants de cauda de zebrafish. Explantas de cauda imitam embriões intactos exibindo uma desaceleração proporcional do alongamento do eixo e encurtamento dos comprimentos de somite rostrocaudal. Ainda podemos parar a velocidade de alongamento do eixo através da cultura explant. Isso, pela primeira vez, nos permite desembaraçar a entrada química de gradientes de sinalização da entrada mecanicista do alongamento axial. Em estudos futuros, este método pode ser combinado com uma configuração microfluida para permitir perturbações farmacêuticas controladas pelo tempo ou triagem da segmentação de vertebrados sem qualquer preocupação com a penetração de medicamentos.
Introdução
A segmentação metamérica de organismos é amplamente utilizada na natureza. Estruturas repetidas são essenciais para a funcionalidade de órgãos laterais como vértebras, músculos, nervos, vasos, membros ou folhas em um plano corporal1. Como resultado de tais restrições fisiológicas e geométricas da simetria axial, a maioria da phyla de Bilateria- como annelids, artrópodes e cordatas-exposição segmentação de seus tecidos embrionários (por exemplo, ectoderme, mesoderme) antero-posteriormente.
Embriões vertebrados segmentam sequencialmente seu mesoderme paraxial ao longo do eixo principal do corpo em somitas com intervalo....
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Protocolo
Este protocolo envolve o uso de embriões vertebrados vivos com menos de 1 dia de fertilização. Todos os experimentos em animais foram realizados sob as diretrizes éticas do Centro Médico hospitalar infantil de Cincinnati; os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo nº 2017-0048).
1. Coleção de embriões
- Coloque pares de zebrafish em tanques de travessia na noite anterior ao dia da coleta de embriões. Para um controle preciso do desenvolvimento de embriões, use barreiras entre pares de acasalamento.
- Levante barreiras antes do tempo de desova preferido ....
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Resultados
Este protocolo permite a colheita geométrica plana de explantes de cauda de zebrafish vivos. A cultura tecidual apresenta três grandes vantagens sobre embriões inteiros: 1) controle da velocidade de alongamento do eixo, 2) controle sobre várias fontes de sinalização (morfógeno) por dissecção simples, e 3) quase objetivo, alta ampliação e alta imagem viva na NA.
Câmaras de slides quimicamente não tratadas permitem que a explanta da cauda alongue seu eixo principal (Figura 2.......
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Discussão
Este artigo apresenta um protocolo detalhado de uma técnica de explant de cultura de tecido que desenvolvemos e usamos recentemente5 para embriões de zebrafish. Nossa técnica baseia-se nos métodos anteriores de explantagem emfilhotes 8 e zebrafish9,10,11 organismos modelo. Explantas de cauda preparadas com este protocolo podem sobreviver desde >12 h em uma simples câmara de slides,.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar e não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao AECOM Zebrafish Core Facility e ao Serviço Veterinário Infantil de Cincinnati pela manutenção de peixes, ao Núcleo de Imagem Infantil de Cincinnati por assistência técnica, Didar Saparov pela assistência com a produção de vídeo e Hannah Seawall para a edição do manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R35GM140805 a E.M.Ö. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa Sub-Q de 1 mL com Agulha PrecisionGlide Becton | , Dickinson and Co. | REF 309597 | para embriões descorionantes e manipulações |
| 200 Prova de Etanol, Anidro | Decon Labs | 2701 | para imunocoloração |
| Solução Antibiótica Antibiótica (100 vezes;) | Sigma-Aldrich | A5955 | para meios de dissecação de tecidos |
| Cloreto de cálcio anidro, pó | Sigma-Aldrich | 499609 | para meios de dissecação |
| de tecidos Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich | D5879 | para imunocoloração | |
| Bisturi descartável, # 10 Aço inoxidável | Integra-Miltex | MIL4-411 | para preparação de poços de lâminas de fita |
| Etil 3-aminobenzoato sal de metanossulfonato (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (opcional) para anestesia de tecidos com mais de 20 anos estágio de somitos |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | adicional para meios de cultura de tecidos |
| Cabra anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat # A-21145; RRID: AB_2535781 | anticorpo secundário para imunocoloração |
| meio L-15 com L-glutamina sem vermelho de fenol | GIBCO | 21083-027 | para meios de dissecção de tecidos |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 179337 | para imunocoloração |
| Faca microcirúrgica da córnea Ponta angular de 2,85 mm Lâminas de bisel duplo | Especialidades cirúrgicas | 72-2863 | para dissecção de tecidos |
| Monoclonal de rato anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID: AB_477245 | para imunocoloração ppERK |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (opcional) para coloração viva de núcleos celulares |
| Paraformaldeído em pó, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | para fixação de amostras para imunocoloração |
| Solução de revestimento de colágeno de cauda de rato | Sigma-Aldrich | 122-20 | (opcional) para ativação química de câmaras de lâminas |
| Incubadora de palco | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (opcional) para controle de temperatura durante imagens ao vivo |
| Fita transparente 3/4'' | Scotch | S-9782 | para preparação de poços de lâmina de fita |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | para imunocoloração |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | para imunocoloração |
| Peixe-zebra: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | peixe transgênico com EGFP localizado nuclear |
| Peixe-zebra: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | peixe transgênico com EGFP localizado por membrana celular |
Referências
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M.
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Reimpressões e permissões
