Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Resumo

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Resumo

Nossa sociedade cada vez mais envelhecida leva a uma incidência crescente de doenças neurodegenerativas. Até o momento, os mecanismos patológicos são inadequadamente compreendidos, impedindo assim o estabelecimento de tratamentos definidos. Terapias genéticas aditivas baseadas em células para o aumento da expressão de um fator protetor são consideradas uma opção promissora para medicar doenças neurodegenerativas, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Desenvolvemos um método para a expressão estável do gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), que é caracterizado como uma proteína neuroprotetora e antiangiogênica no sistema nervoso, no genoma das células epiteliais primárias do pigmento humano (PE) usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB). As células primárias de EP foram isoladas dos olhos do doador humano e mantidas em cultura. Após atingir a confluência, 1 x 10⁴ células foram suspensas em 11 μL de tampão de ressuspensão e combinadas com 2 μL de uma solução purificada contendo 30 ng de plasmídeo de transposase SB hiperativo (SB100X) e 470 ng de plasmídeo transposon PEDF . A modificação genética foi realizada com um sistema de eletroporação capilar utilizando os seguintes parâmetros: dois pulsos com tensão de 1.100 V e largura de 20 ms. As células transfectadas foram transferidas para placas de cultura contendo meio suplementado com soro fetal bovino; antibióticos e antimicóticos foram adicionados com a primeira troca média. A transfecção bem-sucedida foi demonstrada em experimentos realizados de forma independente. A reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) mostrou o aumento da expressão do transgene PEDF . A secreção de PEDF foi significativamente elevada e permaneceu estável, avaliada por imunoblotting, e quantificada por ensaio imunoenzimático (ELISA). A transferência mediada por SB100X permitiu uma integração estável do gene PEDF no genoma das células PE e garantiu a secreção contínua de PEDF, o que é crítico para o desenvolvimento de uma terapia de adição genética baseada em células para tratar a DMRI ou outras doenças degenerativas da retina. Além disso, a análise do perfil de integração do transposon do PEDF em células de EP humanas indicou uma distribuição genômica quase aleatória.

Introdução

A idade avançada é descrita como o principal risco para doenças neurodegenerativas. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença poligênica que leva à perda de visão grave em pacientes com mais de 60 anos de idade, pertence às quatro causas mais comuns de cegueira e deficiência visual¹ e espera-se que aumente para 288 milhões de pessoas em 2040². Disfunções do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma única camada de células bem compactadas localizadas entre o coriocapilar e os fotorreceptores da retina, contribuem para a patogênese da DMRI. O PSE cumpre múltiplas tarefas que são essenciais para uma função ....

Protocolo

Os olhos dos doadores humanos foram obtidos do Aachen Cornea Bank do Departamento de Oftalmologia (Hospital Universitário RWTH Aachen) após a obtenção do consentimento informado de acordo com os protocolos da Declaração de Helsinque. Os procedimentos para a coleta e uso de amostras humanas foram aprovados pelo comitê de ética institucional.

1. Isolamento das células primárias de EPR humanas

1. Coloque roupas de proteção estéreis e luvas. Coloque uma cortina estéril sob um fluxo laminar.
2. Coloque instrumentos de preparação estéreis e outros equipamentos estéreis necessários sob o fluxo laminar.
3. Registre o recebiment....

Resultados

Cultivo e eletroporação de células primárias de EPR humanas
Mostramos que a semeadura de um número suficiente de células primárias de EPR de origem animal permite o cultivo e o crescimento para uma monocamada integrada de células pigmentadas de forma hexagonal^36,37,48. Sua capacidade de formar junções apertadas, exibir atividade fagocítica e expressar genes marcadores específi.......

Discussão

Em nosso projeto, visamos a produção não viral de células primárias geneticamente modificadas de PSE humanas que continuamente superexpressam e secretam um fator eficaz, a fim de usar as células transfectadas como terapêuticas de longo prazo para o estabelecimento e manutenção de um ambiente protetor. Estabelecemos a introdução do gene que codifica o PEDF, uma proteína multifuncional onipresente e expressa com funções antiangiogênicas e neuroprotetoras. O protocolo descrito aqui pode ser usado para transfectar de forma e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isolamento de células primárias de RPE humanas
24-Well Placa de cultura de células de 24 poços	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	0030722019
anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Alemanha	A2942
Pinça Colibri	Geuder, Heidelberg, Alemanha	G-18950
Pinça de Íris Curvada	Geuder, Heidelberg, Alemanha	G-18856
Bisturi Descartável (Nº 11)	Pena, Osaka, Japão
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha	P04-41150
Tesoura de Olho Extra Fino e Pontiagudo	Geuder, Heidelberg, Alemanha	G-19405
Soro Fetal Bovino [0.2 µ m Filtrado Estéril] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha	P40-37500
Glass Pasteur Pipetas	Marca, Wertheim, Alemanha	747715
Penicilina [10.000 unidades/mL] e Estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Alemanha	P0781
Pontas de Pipeta (1000 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (100-1000 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Campo estéril	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Alemanha
Compressa de Gaze Estéril	Fink-Walter, Merchweiler, Alemanha	321063
Luvas Estéreis	Sempermed, Wien, Áustria
Placa de Petri Estéril (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Cirúrgica Estéril	Halyard Health, Alpharetta, GA
Pinça de Íris Reta	Geuder, Heidelberg, Alemanha	G-18855
Eletroporação de células RPE humanas primárias
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
Placa de cultura de células de 12 poços	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
Placa de cultura de células de 24 poços	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Alemanha	A2942
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha	P04-41150
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Soro Fetal Bovino [0.2 µ m Filtrado Estéril] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha	P40-37500
Microscópio Invertido	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Alemanha	Leica DMi8
(Espectrofotômetro NanoDrop)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema de Transfecção Capilar (Sistema de Transfecção de Néon)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema de Transfecção Neon 10 µ L Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocitômetro (Câmara Neubauer)	Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha	0640110
PBS Dulbecco sem Ca2+ sem Mg2+	Biochrom, Berlim, Alemanha	L182-50
Penicilina [10.000 unidades/mL] e Estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Alemanha	P0781
Pontas de Pipeta (10 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de Pipeta (1000 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de pipeta (200 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Kit Maxi de Plasmídeo	Qiagen, Hilden, Alemanha	12163
Pipeta de Canal Único (0.1-10 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (100-1000 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (10-200 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Solução Azul de Tripano	Merck, Darmstadt, Alemanha	T8154
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Análises de células RPE humanas primárias transfectadas
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Tampão de incubação (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0)
2x Tampão
4x Tampão de incubação (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8.0)
Amersham Protran Suportado 0.2 µ m  Membrana de Nitrocelulose	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Alemanha	A2942
Anticorpos Anti-PEDF (Policlonal de Coelho)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anticorpos Anti-Penta-His (Monoclonal de Camundongo)	Qiagen, Hilden, Alemanha	34660
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha	P04-41150
Tampão de Eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0)
Soro fetal bovino [0,2 µ m Filtrado Estéril] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha	P40-37500
Hemocitômetro (Câmara de Neubauer)	Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha	0640110
Anticorpos anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano (policlonal de coelho)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Anticorpos anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (policlonal de cabra)	Abcam, Cambridge, Reino Unido	ab6721
Kit ELISA PEDF Humano	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japão
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Alemanha
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Alemanha	12239264001
LightCycler  Capilares (20 μ l)	Roche Life Science, Penzberg, Alemanha	4929292001
Espectrofotômetro de Microvolume (Espectrofotômetro NanoDrop)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Módulo de Fundição de Tetra Células	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha	1658015
Mini-PROTEAN  Célula de eletroforese vertical Tetra para mini géis pré-moldados, 4 géis	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Alemanha	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicilina [10.000 unidades/mL] e estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Alemanha	P0781
Ponteiras de pipeta (10 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de Pipeta (1000 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de pipeta (200 µ L)	Starlab, Hamburgo, Alemanha
Fonte de Alimentação Básica PowerPac	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Alemanha	51304
Sistema de Transcrição Reversa	Promega, Madison, WI	A3500
Conjunto DNase livre de RNase	Qiagen, Hilden, Alemanha	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Alemanha	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, Reino Unido	SSM3
Safe-Lock (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de Canal Único (0.1-10 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (100-1000 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (10-200 µ L)	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Sistema de Transferência Turbo Trans-Blot	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha	1704150
Solução Azul de Tripano	Merck, Darmstadt, Alemanha	T8154
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054