É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

2.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 de fevereiro de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Resumo

Nossa sociedade cada vez mais envelhecida leva a uma incidência crescente de doenças neurodegenerativas. Até o momento, os mecanismos patológicos são inadequadamente compreendidos, impedindo assim o estabelecimento de tratamentos definidos. Terapias genéticas aditivas baseadas em células para o aumento da expressão de um fator protetor são consideradas uma opção promissora para medicar doenças neurodegenerativas, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Desenvolvemos um método para a expressão estável do gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), que é caracterizado como uma proteína neuroprotetora e antiangiogênica no sistema nervoso, no genoma das células epiteliais primárias do pigmento humano (PE) usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB). As células primárias de EP foram isoladas dos olhos do doador humano e mantidas em cultura. Após atingir a confluência, 1 x 104 células foram suspensas em 11 μL de tampão de ressuspensão e combinadas com 2 μL de uma solução purificada contendo 30 ng de plasmídeo de transposase SB hiperativo (SB100X) e 470 ng de plasmídeo transposon PEDF . A modificação genética foi realizada com um sistema de eletroporação capilar utilizando os seguintes parâmetros: dois pulsos com tensão de 1.100 V e largura de 20 ms. As células transfectadas foram transferidas para placas de cultura contendo meio suplementado com soro fetal bovino; antibióticos e antimicóticos foram adicionados com a primeira troca média. A transfecção bem-sucedida foi demonstrada em experimentos realizados de forma independente. A reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) mostrou o aumento da expressão do transgene PEDF . A secreção de PEDF foi significativamente elevada e permaneceu estável, avaliada por imunoblotting, e quantificada por ensaio imunoenzimático (ELISA). A transferência mediada por SB100X permitiu uma integração estável do gene PEDF no genoma das células PE e garantiu a secreção contínua de PEDF, o que é crítico para o desenvolvimento de uma terapia de adição genética baseada em células para tratar a DMRI ou outras doenças degenerativas da retina. Além disso, a análise do perfil de integração do transposon do PEDF em células de EP humanas indicou uma distribuição genômica quase aleatória.

Introdução

A idade avançada é descrita como o principal risco para doenças neurodegenerativas. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença poligênica que leva à perda de visão grave em pacientes com mais de 60 anos de idade, pertence às quatro causas mais comuns de cegueira e deficiência visual1 e espera-se que aumente para 288 milhões de pessoas em 20402. Disfunções do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma única camada de células bem compactadas localizadas entre o coriocapilar e os fotorreceptores da retina, contribuem para a patogênese da DMRI. O PSE cumpre múltiplas tarefas que são essenciais para uma função retiniana normal3 e secreta uma variedade de fatores de crescimento e fatores essenciais para manter a integridade estrutural da retina e do coriocapilar, apoiando assim a sobrevivência dos fotorreceptores e fornecendo uma base para a circulação e o fornecimento de nutrientes.

Em olhos saudáveis, o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) é responsável por equilibrar os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e protege os neurônios contra a apoptose, previne a proliferação de células endoteliais e estabiliza o endotélio capilar. Uma relação VEGF-para-PEDF deslocada está relacionada à neovascularização ocular, o que foi observado em modelos animais4,5, bem como em amostras de pacientes com neovascularização da coroide (NVC) por DMRI e retinopatia diabética proliferativa 6,7,8,9,10 . A concentração aumentada de VEGF é o alvo para o tratamento padrão atual. Os fármacos anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, mais recentemente, brolucizumab melhoram a acuidade visual em cerca de um terço dos pacientes com NVC, ou melhor, estabilizam a visão em 90% dos casos11,12,13. No entanto, as injeções intravítreas frequentes, muitas vezes mensais, acarretam o risco de eventos adversos14, prejudicam a adesão do paciente e representam um ônus econômico significativo para os sistemas de saúde15. Além disso, certa porcentagem de pacientes (2%-20%) não responde ou apenas reage mal à terapia anti-VEGF16,17,18,19. Esses concomitantes negativos requerem o desenvolvimento de tratamentos alternativos, por exemplo, implantes intraoculares, abordagens terapêuticas celulares e/ou genéticas.

A terapia gênica tem evoluído como tratamento promissor para doenças hereditárias e não hereditárias e pretende restaurar sequências gênicas não funcionais ou suprimir as de mau funcionamento. Para doenças poligênicas, onde a identificação e a substituição dos fatores causadores dificilmente são possíveis, as estratégias visam a entrega contínua de um fator protetor. No caso da DMRI, várias terapias aditivas têm sido desenvolvidas, como a expressão estável de endostatina e angiostatina20, o antagonista do VEGF solúvel fms-like tirosina quinase-1 (sFLT-1)21,22, o cluster de proteínas reguladoras do complemento de diferenciação 59 (CD59)23 ou o PEDF 24,25 . O olho, e especialmente a retina, é um excelente alvo para uma medicação baseada em genes devido à estrutura fechada, boa acessibilidade, tamanho pequeno e privilégio imunológico, permitindo assim uma entrega localizada de baixas doses terapêuticas e tornando os transplantes menos suscetíveis à rejeição. Além disso, o olho permite o monitoramento não invasivo, e a retina pode ser examinada por diferentes técnicas de imagem.

Os vetores virais são, devido à sua alta eficiência de transdução, o principal veículo para entregar genes terapêuticos nas células-alvo. Entretanto, dependendo do vetor viral utilizado, diferentes reações adversas têm sido descritas, como respostas imunes e inflamatórias26, efeitos mutagênicos e oncogênicos 27,28 ou disseminação em outros tecidos29. As limitações práticas incluem um tamanho de embalagem restrito30, bem como dificuldades e custos associados à produção de lotes de grau clínico31,32. Essas desvantagens promoveram o desenvolvimento de vetores não virais, baseados em plasmídeos, que são transferidos via lipo / poliplexos, ultrassom ou eletroporação. No entanto, a integração genômica do transgene no genoma do hospedeiro geralmente não é promovida com vetores plasmídicos, resultando em uma expressão transitória.

Transposons são fragmentos de DNA de ocorrência natural que mudam sua posição dentro do genoma, uma característica que foi adotada para a terapia gênica. Devido a um mecanismo de integração ativa, os sistemas vetoriais baseados em transposon permitem uma expressão contínua e constante do transgene inserido. O transposon da Bela Adormecida (SB), reconstituído a partir de um antigo transposon do tipo Tc1/marinheiro encontrado em peixes33 e melhorado pela evolução molecular resultando na variante hiperativa SB100X34, possibilitou uma transposição eficiente em várias células primárias e foi utilizado para a correção fenotípica em diferentes modelos de doenças35. Atualmente, 13 ensaios clínicos foram iniciados usando o sistema de transposição SB . O sistema de transposon SB100X consiste em dois componentes: o transposon, que compreende o gene de interesse ladeado por repetições invertidas terminais (TIRs), e a transposase, que mobiliza o transposon. Após a entrega do DNA plasmídico às células, a transposase se liga aos TIRs e catalisa a excisão e a integração do transposon no genoma da célula.

Desenvolvemos uma terapia aditiva não viral baseada em células para o tratamento da DMRI neovascular. A abordagem compreende a inserção baseada em eletroporação do gene PEDF em células epiteliais pigmentares primárias (PE) por meio do sistema de transposon SB100X 36,37,38. A informação genética da transposase e do PEDF é fornecida em plasmídeos separados, permitindo assim o ajuste da razão de transposição ideal SB100X-para-PEDF. A eletroporação é realizada usando um sistema de transfecção capilar baseado em pipeta que é caracterizado por um tamanho de folga maximizado entre os eletrodos, minimizando sua área de superfície. O dispositivo demonstrou atingir excelentes taxas de transfecção em uma ampla gama de células de mamíferos 39,40,41. A pequena área de superfície do eletrodo proporciona um campo elétrico uniforme e reduz os vários efeitos colaterais da eletrólise42.

A funcionalidade antiangiogênica do PEDF secretado por células epiteliais pigmentares transfectadas foi demonstrada em vários experimentos in vitro analisando a brotação, migração e apoptose de células endoteliais da veia umbilical humana43. Além disso, o transplante de células transfectadas por PEDF em um modelo de neovascularização corneana de coelho44 e em um modelo de rato de CNV43,45,46 mostrou declínio da neovascularização.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a inserção estável do gene PEDF em células primárias de EPR humanas através do sistema de transposon SB100X usando um sistema de transfecção capilar. As células transfectadas foram mantidas em cultura por 21 dias e, posteriormente, analisadas em termos de expressão gênica de PEDF por reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) e em termos de secreção de proteína PEDF por imunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA, Figura 1).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os olhos dos doadores humanos foram obtidos do Aachen Cornea Bank do Departamento de Oftalmologia (Hospital Universitário RWTH Aachen) após a obtenção do consentimento informado de acordo com os protocolos da Declaração de Helsinque. Os procedimentos para a coleta e uso de amostras humanas foram aprovados pelo comitê de ética institucional.

1. Isolamento das células primárias de EPR humanas

  1. Coloque roupas de proteção estéreis e luvas. Coloque uma cortina estéril sob um fluxo laminar.
  2. Coloque instrumentos de preparação estéreis e outros equipamentos estéreis necessários sob o fluxo laminar.
  3. Registre o recebimento dos globos oculares, o início da preparação, bem como possíveis anormalidades. Registre a idade do doador, sexo, causa da morte e o período entre o momento da morte e a remoção dos olhos.
  4. Coloque o globo ocular em uma compressa de gaze estéril e segure-o com uma mão.
  5. Separe o segmento anterior do segmento posterior por um corte circunferencial aproximadamente 3,5 mm posterior ao limbo usando um bisturi e uma tesoura ocular extra fina e pontiaguda.
  6. Depois de inclinar o segmento posterior para baixo, remova cuidadosamente o vítreo e a retina usando pinça colibri.
  7. Reorganize discretamente o complexo RPE/coroidea colapsado usando pinças retas da íris e, posteriormente, mantenha-o na posição com pinças curvas da íris.
  8. Encher o copo ocular posterior com 1 mL de Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina e 80 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep) e 2,5 μg/mL de anfotericina B (AmphoB).
    NOTA: Ao contrário do isolamento das células primárias de EPR de olhos de suínos ou bovinos36,37, o copo ocular posterior não precisa ser preenchido e incubado com tripsina.
  9. Colha as células RPE escovando suavemente o epitélio pigmentar da retina do nervo óptico em direção ao limbo com uma pipeta Pasteur de vidro curvo polido pelo fogo, enquanto fixa o complexo RPE/coroidea no limbo usando pinça colibri. Transfira a suspensão celular para uma placa de Petri.
  10. Repita os passos 1.8 e 1.9 e recolha todas as células da placa de Petri. Ressuspenda a suspensão da célula cuidadosamente pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de canal único (100-1.000 μL).
  11. Sesite a suspensão celular RPE de cada globo ocular em três poços de uma placa de cultura celular de 24 poços e preencha-os até 1 mL com DMEM/F12 suplementado com FBS, Pen/Strep e AmphoB.
  12. Manter as culturas de células RPE a 37 °C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2 até se atingir a confluência. Trocar o meio de cultura celular duas vezes por semana.

2. Eletroporação de células primárias de PSE humano

  1. Preparação da mistura de plasmídeo transposase SB100X /PEDF transposon plasmide
    1. Purificar a transposase SB100X e o DNA plasmidial transposon PEDF usando kits de purificação plasmídicos habituais, que são identificados como adequados para o uso em aplicações como transfecção, de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Quantificar o conteúdo de DNA plasmídico usando um espectrofotômetro de microvolume e ajustá-los a uma concentração de 250 ng/μL com Tris-HCl de 10 mM (pH 8,5).
    3. Misture uma porção de DNA plasmidial da transposase de 250 ng/ μL SB100X (por exemplo, 2,5 μL) com 16 porções de DNA plasmidial transposto PEDF 250 ng/μL (por exemplo, 40 μL). A mistura plasmídica residual pode ser armazenada a -20 °C.
      NOTA: Múltiplos ciclos repetidos de congelamento e descongelamento da mistura plasmídica devem ser evitados.
    4. Colocar 2 μL da mistura de plasmídeo transposase SB100X/PEDF transposon, contendo 29,4 ng de plasmídeo de transposase SB100X e 470,6 ng de plasmídeo transposon PEDF, num tubo de microcentrífuga de bloqueio seguro estéril de 1,5 ml. Manter no gelo até misturar com as células.
  2. Configuração do sistema de transfecção capilar
    NOTA: A eletroporação de células primárias de PSE humana foi realizada através de um sistema de transfecção capilar usando o kit de 10 μL de acordo com o protocolo do fabricante. O sistema compreende o dispositivo de transfecção, a pipeta de transfecção e a estação de pipeta. O kit contém pontas de transfecção de 10 μL, tubos tampão, tampão eletrolítico E (tampão E) e tampão de ressuspensão R (tampão R).
    1. Conecte a estação de pipeta ao dispositivo de transfecção.
    2. Encha um tubo tampão com 3 mL de tampão E e insira-o na estação de pipeta até que um som de clique seja ouvido.
      NOTA: Certifique-se de que o eléctrodo lateral do tubo tampão está ligado ao êmbolo de esferas laterais da estação de pipeta.
    3. Para a eletroporação de células RPE humanas primárias, defina as seguintes condições de pulso no dispositivo de transfecção: 1.100 V (tensão de pulso), 20 ms (largura de pulso), dois pulsos (número de pulso).
  3. Preparação das células primárias de EPR humanas cultivadas
    1. Documente a forma e a morfologia das culturas celulares primárias de PSE por microscopia de contraste de fase. Faça micrografias de baixa ampliação para demonstrar o crescimento das células RPE para uma monocamada confluente e integrada, bem como micrografias de maior ampliação para apontar a morfologia típica de paralelepípedos das células RPE.
    2. Aspirar o meio de cultura celular e lavar as células duas vezes com 1 mL de solução salina de fosfato tamponada (PBS, pH 7,4).
    3. Tripsinize células primárias de PSE humana com 0,5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 por 7-15 min (máximo). Verifique o descolamento celular microscopicamente.
    4. Pare a tripsinização com 1 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS. Tome uma alíquota de 20 μL para contagem de células usando um hemocitômetro. Centrifugar a suspensão da célula RPE a 106 x g durante 10 minutos.
    5. Misturar a alíquota de 20 μL com a solução azul de tripano de 20 μL. Pipetar 10 μL em cada metade do hemocitômetro e contar as células sob um microscópio de contraste de fase.
    6. Após centrifugação, ressuspender o pellet de células RPE em 1 mL de PBS.
    7. Pegue 10.000-100.000 células RPE por reação de transfecção e centrifuja-as a 106 x g por 10 min.
      NOTA: Além das reações de transfecção com aplicação de campo elétrico e adição de DNA plasmídico, cada abordagem também inclui duas culturas de controle diferentes: (1) sem aplicação de campo elétrico e sem DNA plasmídico; (2) com aplicação de campo elétrico, mas sem DNA plasmídico.
    8. Ressuspender o pellet celular em 11 μL de tampão R e combiná-lo com 2 μL da mistura plasmídica transposase/transposon PEDF SB100X (ver etapa 2.1.4).
      NOTA: Após a ressuspensão no tampão R, as células devem ser processadas dentro de 15 minutos para evitar uma redução na viabilidade celular e na eficiência da transfecção.
    9. Insira a cabeça da pipeta de transfecção na ponta de transfecção de 10 μL até que a braçadeira pegue totalmente a haste de montagem do pistão. Desenhe a solução celular/plasmídeo na ponta de transfecção.
      NOTA: Evite a geração de bolhas de ar e sua aspiração na ponta de transfecção.
    10. Fornecer 1 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS, mas sem Pen/Strep e sem AmphoB, no número necessário de poços de uma placa de cultura celular de 24 poços.
  4. Processo de eletroporação
    1. Insira a pipeta de transfecção no tubo tampão colocado na estação de pipeta (ver passo 2.2.2) até que um som de clique seja ouvido.
      NOTA: Certifique-se de que a cabeça metálica da pipeta de transfecção está conectada ao êmbolo de esferas dentro da estação de pipeta e ao tubo tampão.
    2. Pressione Start (Iniciar ) na tela sensível ao toque do dispositivo de transfecção. Antes da aplicação do pulso elétrico, o dispositivo verifica automaticamente se o tubo tampão e a pipeta de transfecção estão inseridos corretamente. Após a entrega dos pulsos elétricos, o Complete é exibido na tela sensível ao toque.
    3. Retirar cuidadosamente a pipeta de transfecção da estação de pipeta e libertar imediatamente as células eletroporosas da ponta de transfecção de 10 μL, pipetando a solução celular/plasmide para os poços preparados da placa de cultura celular (ver passo 2.3.10).
    4. Manter culturas de células de PSE transfectadas a 37 °C em atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2. Adicione Pen/Strep e AmphoB com a primeira troca média 3 dias após a eletroporação.

3. Análises de células primárias de EPR humanas transfectadas

  1. Preparação da amostra
    1. Após um tempo de cultivo de 3 semanas, por fim, incubar as culturas de células de PSE em um volume definido de 1,0 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS, Pen/Strep e AmphoB por um tempo definido de 24 h.
    2. Pegue os sobrenadantes da cultura celular e armazene-os a -20 °C até processamento próximo do tempo ou a -80 °C para amostras termicamente instáveis e armazenamento a longo prazo.
    3. Tripsinize culturas de células RPE transfectadas com 0,5 mL de tripsina-EDTA a 37 °C a 37 °C em atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 por 10 min.
    4. Pare a tripsinização com 1 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS. Tome pequenas alíquotas para a contagem de células usando um hemocitômetro (ver etapa 2.3.5). Centrifugar as suspensões de células RPE a 106 x g durante 10 minutos.
    5. Conservar os pellets de células RPE a -80 °C até processamento posterior.
  2. Avaliação da secreção de PEDF por western blotting
    NOTA: Para uma avaliação qualitativa, os sobrenadantes da cultura celular (ver passo 3.1.2) são analisados através de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e subsequente western blotting. Dependendo do PEDF transposon plasmide DNA usado, os sobrenadantes têm que ser processados de forma diferente.
    1. Purificação de proteínas de fusão PEDF marcadas com His a partir de sobrenadantes de cultura celular
      1. Colher 30 μL de pasta de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) por amostra, utilizando uma ponta cortada em chanfro, e repeltar a resina Ni-NTA por centrifugação (2.660 x g durante 30 s).
      2. Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com 200 μL de tampão de incubação 1x (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) e pellet-la por centrifugação (2.660 x g por 30 s).
      3. Repita a etapa anterior.
      4. Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com tampão de incubação 40 μL 4x (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) por amostra.
      5. Misturar 900 μL de sobrenadante de cultura celular com 260 μL de tampão de incubação 4x e 55 μL de pasta de Ni-NTA pré-tratada (ver passo 3.2.1.4).
      6. Incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 60 min.
      7. Pellet a resina Ni-NTA por centrifugação (2660 x g por 60 s).
      8. Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com 175 μL de tampão de incubação 1x e resina pellet por centrifugação (2.660 x g por 60 s).
      9. Repita a etapa anterior.
      10. Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com 30 μL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) e incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 20 minutos.
      11. Pellet a resina Ni-NTA por centrifugação (2.660 x g por 30 s).
      12. Pegue cuidadosamente o sobrenadante e misture-o com 2x buffer de amostra SDS47.
      13. Aqueça a mistura a 95 °C durante 5 min e separe as proteínas purificadas por Ni-NTA num gel de poliacrilamida SDS a 10%.
      14. Realizar western blotting utilizando anticorpos anti-Penta-His (monoclonal de camundongo, 1:500) e anticorpos anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (policlonal de coelho, 1:1.000) conforme descrito anteriormente36,37.
    2. Análise direta de proteínas PEDF não marcadas
      1. Pegue 15 μL de sobrenadante de cultura celular e misture-o com 2x buffer de amostra SDS47.
      2. Aquecer a mistura a 95 °C durante 5 min e separar as proteínas num gel de poliacrilamida SDS a 10%.
      3. Realizar western blotting usando anticorpos anti-PEDF humanos (policlonal de coelho, 1:4.000) e anticorpos anti-coelho conjugados com HRP (policlonal de cabra, 1:2.000), conforme descrito anteriormente38.
    3. Quantificação da secreção de PEDF por ELISA
      1. Analise os sobrenadantes da cultura celular (ver etapa 3.1.2) usando um kit PEDF ELISA humano de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Relacionar a quantidade de PEDF secretado com o tempo e o número de células determinado para cada reação de transfecção (ver etapa 3.1.4).
    4. Análise da expressão gênica do PEDF em células RPE transfectadas
      1. Isolar o ARN total dos pellets de células RPE (ver passo 3.1.5) utilizando um kit comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Quantifique o conteúdo de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
      3. Realizar a transcrição reversa em 0,1 μg de RNA usando um sistema de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
      4. Execute qPCR em tempo real, conforme descrito anteriormente38.
    5. Análise dos sítios de inserção transgênica em células RPE transfectadas
      1. Isolar o ADN genómico dos pellets de células RPE (ver passo 3.1.5) utilizando um kit comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Quantifique o conteúdo de DNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
      3. Gerar bibliotecas de sites de inserção usando um esquema de PCR hemi-específico assistido por computação, conforme descrito anteriormente38.
      4. Realizar análise computacional conforme descrito anteriormente38.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Cultivo e eletroporação de células primárias de EPR humanas
Mostramos que a semeadura de um número suficiente de células primárias de EPR de origem animal permite o cultivo e o crescimento para uma monocamada integrada de células pigmentadas de forma hexagonal36,37,48. Sua capacidade de formar junções apertadas, exibir atividade fagocítica e expressar genes marcadores específi...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Em nosso projeto, visamos a produção não viral de células primárias geneticamente modificadas de PSE humanas que continuamente superexpressam e secretam um fator eficaz, a fim de usar as células transfectadas como terapêuticas de longo prazo para o estabelecimento e manutenção de um ambiente protetor. Estabelecemos a introdução do gene que codifica o PEDF, uma proteína multifuncional onipresente e expressa com funções antiangiogênicas e neuroprotetoras. O protocolo descrito aqui pode ser usado para transfectar de forma e...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Zoltán Ivics e Zsuzsanna Izsvák são inventores de várias patentes sobre a tecnologia de transposição SB

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Sétimo Programa-Quadro de Investigação, Desenvolvimento Tecnológico e Demonstração da União Europeia, convenção de subvenção n.º 305134. Zsuzsanna Izsvák foi financiada pelo Conselho Europeu de Investigação, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Os autores gostariam de agradecer a Anna Dobias e Antje Schiefer (Departamento de Oftalmologia, Hospital Universitário RWTH Aachen) pelo excelente suporte técnico, e ao Aachen Cornea Bank (Departamento de Oftalmologia, Hospital Universitário RWTH Aachen) por fornecer os olhos do doador humano.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Isolamento de células primárias de RPE humanas
24-Well Placa de cultura de células de 24 poçosEppendorf, Hamburgo, Alemanha0030722019
anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlemanhaA2942
Pinça ColibriGeuder, Heidelberg, AlemanhaG-18950
Pinça de Íris Curvada Geuder, Heidelberg, AlemanhaG-18856
Bisturi Descartável (Nº 11)Pena, Osaka, Japão
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemanhaP04-41150
Tesoura de Olho Extra Fino e Pontiagudo Geuder, Heidelberg, AlemanhaG-19405
Soro Fetal Bovino [0.2 µ m Filtrado Estéril] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemanhaP40-37500
Glass Pasteur PipetasMarca, Wertheim, Alemanha747715
Penicilina [10.000 unidades/mL] e Estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, AlemanhaP0781
Pontas de Pipeta (1000 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Campo estérilLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Alemanha
Compressa de Gaze Estéril Fink-Walter, Merchweiler, Alemanha321063
Luvas EstéreisSempermed, Wien, Áustria
Placa de Petri Estéril (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Cirúrgica EstérilHalyard Health, Alpharetta, GA
Pinça de Íris Reta Geuder, Heidelberg, AlemanhaG-18855
Eletroporação de células RPE humanas primárias
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
Placa de cultura de células de 12 poçosThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
Placa de cultura de células de 24 poçosEppendorf, Hamburgo, Alemanha
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlemanhaA2942
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemanhaP04-41150
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock (1.5 mL)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Soro Fetal Bovino [0.2 µ m Filtrado Estéril] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemanhaP40-37500
Microscópio InvertidoLeica Mikrosysteme, Wetzlar, AlemanhaLeica DMi8
(Espectrofotômetro NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema de Transfecção Capilar (Sistema de Transfecção de Néon)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema de Transfecção Neon 10 µ L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocitômetro (Câmara Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha0640110
PBS Dulbecco sem Ca2+ sem Mg2+Biochrom, Berlim, AlemanhaL182-50
Penicilina [10.000 unidades/mL] e Estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, AlemanhaP0781
Pontas de Pipeta (10 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de Pipeta (1000 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de pipeta (200 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Kit Maxi de PlasmídeoQiagen, Hilden, Alemanha12163
Pipeta de Canal Único (0.1-10 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (10-200 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Solução Azul de TripanoMerck, Darmstadt, AlemanhaT8154
Tripsina-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Análises de células RPE humanas primárias transfectadas
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Tampão de incubação (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0)
2x Tampão
4x Tampão de incubação (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8.0)
Amersham Protran Suportado 0.2 µ m  Membrana de NitroceluloseCytiva, Marlborough, MA10600015
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlemanhaA2942
Anticorpos Anti-PEDF (Policlonal de Coelho)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Anticorpos Anti-Penta-His (Monoclonal de Camundongo)Qiagen, Hilden, Alemanha34660
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemanhaP04-41150
Tampão de Eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) 
Soro fetal bovino [0,2 µ m Filtrado Estéril] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemanhaP40-37500
Hemocitômetro (Câmara de Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha0640110
Anticorpos anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano (policlonal de coelho)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Anticorpos anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (policlonal de cabra)Abcam, Cambridge, Reino Unidoab6721
Kit ELISA PEDF Humano BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Imaging SystemFujifilm, Minato, Japão
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Penzberg, Alemanha
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Alemanha12239264001
LightCycler  Capilares (20 μ l)Roche Life Science, Penzberg, Alemanha4929292001
Espectrofotômetro de Microvolume (Espectrofotômetro NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Módulo de Fundição de Tetra CélulasBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha1658015
Mini-PROTEAN  Célula de eletroforese vertical Tetra para mini géis pré-moldados, 4 géisBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Alemanha30410
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penicilina [10.000 unidades/mL] e estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, AlemanhaP0781
Ponteiras de pipeta (10 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de Pipeta (1000 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Ponteiras de pipeta (200 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemanha
Fonte de Alimentação Básica PowerPacBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Alemanha51304
Sistema de Transcrição ReversaPromega, Madison, WIA3500
Conjunto DNase livre de RNaseQiagen, Hilden, Alemanha79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Alemanha74104
Rocking ShakerCole-Parmer, Staffordshire, Reino UnidoSSM3
Safe-Lock (1.5 mL)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock (2.0 mL)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de Canal Único (0.1-10 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Pipeta de canal único (10-200 µ L)Eppendorf, Hamburgo, Alemanha
Sistema de Transferência Turbo Trans-BlotBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha1704150
Solução Azul de TripanoMerck, Darmstadt, AlemanhaT8154
Tripsina-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Bata 0030722019 Espectrofotômetro de Microvolume MPK5000de amostra SDS Tubos de Microcentrífuga

Referências

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850(2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049(2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845(2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Expressão Gênica de PEDFEletroporação CapilarPreparação de DNA PlasmidialAnálise por Western BlotQuantificação por ELISAPurificação por NTA de NíquelIntegração Estável de Transgene
Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.