Summary
Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.
Abstract
Le indagini sia sulla fisiopatologia che sugli obiettivi terapeutici nelle distrofie muscolari sono state ostacolate dalla limitata capacità proliferativa dei mioblasti umani. Sono stati creati diversi modelli di topi, ma non rappresentano veramente la fisiopatologia umana della malattia o non sono rappresentativi dell'ampio spettro di mutazioni presenti nell'uomo. L'immortalizzazione dei mioblasti primari umani è un'alternativa a questa limitazione; tuttavia, dipende ancora dalle biopsie muscolari, che sono invasive e non facilmente disponibili. Al contrario, le biopsie cutanee sono più facili da ottenere e meno invasive per i pazienti. I fibroblasti derivati dalle biopsie cutanee possono essere immortalati e transdifferenziati in mioblasti, fornendo una fonte di cellule con un eccellente potenziale miogenico. Qui descriviamo un metodo di riprogrammazione rapido e diretto del fibroblasto in un lignaggio miogenico. I fibroblasti vengono trasdotti con due lentivirus: hTERT per immortalare la coltura primaria e un MYODtet-inducibile , che con l'aggiunta di doxiciclina, induce la conversione dei fibroblasti in mioblasti e poi miotubi maturi, che esprimono marcatori di differenziazione tardiva. Questo protocollo di transdifferenziazione rapida rappresenta un potente strumento per indagare i meccanismi patologici e studiare bioterapie innovative a base genica o farmacologica per disturbi neuromuscolari.
Introduction
I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D'altra parte, la coltura e il mantenimento dei mioblasti primari sono impegnativi, a causa del loro limitato tasso di proliferazione e della senescenza replicativa in vitro1. Un'alternativa a queste limitazioni è immortalare i mioblasti conl'inserimentodella telomerasi umana (hTERT) e/o della chinasi ciclina-dipendente 4 (CDK4)geni 2,3 , con conservazione delle caratteristiche muscolari scheletriche4. Tuttavia, l'obtenzione dei mioblasti primari dipende ancora dalla biopsia muscolare, una procedura chirurgica con svantaggi per i pazienti, che, in molti casi, hanno i loro muscoli nella degenerazione avanzata. Pertanto, il muscolo di questi pazienti è composto da una proporzione significativa di tessuto fibrotico e / o adiposo e produce meno cellule muscolari, richiedendo la purificazione delle cellule in precedenza per l'immortalizzazione.
A differenza delle biopsie muscolari, le biopsie cutanee sono più accessibili e sono meno dannose per i pazienti. I fibroblasti primari possono essere derivati da frammenti cutanei in vitro. Sebbene i fibroblasti non siano principalmente influenzati da mutazioni che causano disturbi neuromuscolari, possono essere trasifferenti in mioblasti. Questo può essere ottenuto con l'inserimento del gene Myod, un fattore di trascrizione regolatore miogenico5. In questo manoscritto descriviamo il protocollo per ottenere mioblasti transdifferenziati, dalla creazione di colture di fibroblasti all'obtenzione di miotubi differenziati (un riassunto rappresentativo del metodo è raffigurato nella figura 1).
Il test preclinale delle strategie terapeutiche dipende da modelli cellulari e animali che portano mutazioni simili alle mutazioni riscontrate nei pazienti umani. Sebbene lo sviluppo di modelli animali sia diventato più fattibile con il progresso di tecnologie di editing genico come CRISPR/Cas96, è ancora impegnativo e costoso. Pertanto, le linee cellulari derivate dal paziente sono un'opzione accessibile per avere modelli, coprendo l'ampio spettro di mutazioni di malattie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). L'obtenzione e la creazione di modelli cellulari sono cruciali per lo sviluppo di terapie personalizzate per tali patologie.
Tra le terapie personalizzate che sono state studiate, le strategie di salto dell'esone è una delle promettenti per diverse distrofiemuscolari 7,8. Questa strategia consiste nel produrre una proteina più corta ma funzionale. Questo viene eseguito nascondendo la definizione di esone allo spliceosoma, escludendo quindi l'esone mutato dal messaggero finale. Questa è una tecnologia molto promettente che è stata approvata dalla FDA per dmd. Pertanto, descriviamo anche in questo protocollo, metodi per trasfetto i mioblasti con due diverse tecnologie correlate che saltano l'esone: oligonucleotidi antisense (AON) e virus associato all'U7snRNA-adeno (AAV). La trasfezione AON è un buon strumento per lo screening iniziale di diverse sequenze progettate per promuovere l'esonesaltando 9. Tuttavia, l'attività degli AON è transitoria. Per ottenere un'espressione sostenuta delle sequenze di antisense, abbiamo anche esplorato piccoli RNA nucleari (snRNA) combinati con AAV, consentendo la localizzazione nucleare e l'inclusione nei macchinari di giunzione10. U7 è uno snRNA coinvolto nell'elaborazione dell'mRNA istono che può essere progettato per legare le proteine che lo reindirizzeranno allo spliceosoma e forniranno sequenze di antisense11. L'uso di U7 snRNA modificati in combinazione con vettori AAV supera i limiti delle AON con conseguente continua espressione delle AON e migliore trasduzione dei tessuti di interesse12. Usiamo cellule derivate da pazienti affetti da DMD per questo protocollo per illustrare la strategia di esone-salto.
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Protocol
Tutti gli esperimenti e le biopsie sono stati effettuati seguendo le regole etiche delle istituzioni coinvolte sotto l'approvazione del Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.
1. Inizio della coltura di fibroblasti dermici
- Istituzione della cultura dei fibroblasti
- Aliquota 10 mL di mezzo fibroblasto(tabella 1)in tubi conici da 15 ml. La biopsia cutanea deve essere posizionata e trasportata in questo mezzo. La biopsia può essere conservata a 4 °C fino a quando non viene lavorata, preferenzialmente lo stesso giorno.
NOTA: Utilizzare la biopsia cutanea entro 24-36 ore per evitare una potenziale crescita della contaminazione. - Aspirare il supporto dal tubo e risciacquare la biopsia con 10 mL 1X PBS (temperatura ambiente) tre volte. Dopo il terzo lavaggio, lasciare il PBS nel tubo.
- Versare il PBS e la pelle su un piatto da 10 cm2.
- Usando bisturi sterili, tagliare la biopsia nel più piccolo possibile frammenti.
- Utilizzando una pipetta, trasferire un singolo frammento di pelle e lasciarlo cadere in un piatto pulito da 10 cm2. Posizionare da 10 a 12 frammenti per piatto.
- Aspirare l'eccesso di PBS da ogni frammento. Fare attenzione a non aspirare il frammento.
- Coprire parzialmente i piatti con il coperchio e lasciare asciugare i frammenti di pelle per 5-20 minuti. Non lasciare asciugare eccessivamente i frammenti.
- Una volta che i frammenti sono asciutti, inclinare il piatto a 45 gradi e aggiungere lentamente 12 mL di mezzo fibroblasto all'angolo. Abbassare il piatto, distribuendo attentamente il supporto in modo che i frammenti non si sollevino dal supporto.
- Mettere i piatti nell'incubatrice (37 °C, 5% CO2). Sostituire il supporto in 5-7 giorni e una volta alla settimana dopo.
- Osservare i fibroblasti che emergono dal frammento (Figura 2) e, una volta confluenti, passare le cellule in mastri da 75 cm2. Rimuovere il mezzo, sciacquare le celle con PBS e aggiungere 1 mL 0,25 % di tripina. Incubare a 37 °C per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule non vengono sollevate. Aggiungere un mezzo di crescita dei fibroblasti da 10 ml per inibire la tripparina e trasferire le cellule in un nuovo pallone.
NOTA: Per la nomenclatura del numero di passaggio, P1 viene stabilito quando i primi fibroblasti emersi dalla biopsia cutanea vengono trasferiti in un nuovo pallone per la proliferazione.
- Aliquota 10 mL di mezzo fibroblasto(tabella 1)in tubi conici da 15 ml. La biopsia cutanea deve essere posizionata e trasportata in questo mezzo. La biopsia può essere conservata a 4 °C fino a quando non viene lavorata, preferenzialmente lo stesso giorno.
- Crioconservazione delle linee primarie di fibroblasti
- Una volta che il pallone da 75 cm2 è confluente, sciacquarlo con 10 mL 1X PBS e aspirare PBS.
- Aggiungere 3 mL dello 0,25 % di tripina alla superficie cellulare. Posizionare il pallone nell'incubatrice per 5 minuti. Controllare i contenitori al microscopio per vedere se le cellule sono sollevate. In caso meno, riposizionare il pallone nell'incubatrice per altri 5 minuti.
- Una volta staccate le cellule, aggiungere 7 ml di mezzi fibroblasti al pallone e pipetta su e giù per rimostrare le cellule. Raccogliere le celle in un tubo conico da 50 ml.
- Preparare 100 μL aliquota di trypan blu, e rimuovere 100 μL dal campione che viene crioconservato, mescolare con il tripano blu. Caricare il mix sull'emocitometro per contare. Contare le cellule in quattro diversi campi dell'emocitometro al microscopio. Per calcolare il numero totale di celle, utilizzare la formula: (celle contate/100) * volume di impostazioni cultura.
- Ruotare i tubi conici a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente o 4 °C.
- Aspirare il mezzo e rimospendare le cellule nel volume adeguato del mezzo di congelamento: 1 mL per ogni 1 milione di cellule/flaconcino. Pipetta su e giù per omogeneizzare e distribuire 1 mL ad ogni criooviale etichettato.
- Posizionare i flaconcini nella scatola di congelamento e lasciare congelare le fiale ad una velocità di 1 °C/min a -80 °C congelatore durante la notte.
- Il giorno seguente trasferire le fiale in un serbatoio di azoto liquido o in un congelatore a -150 °C.
2. Istituzione della linea cellulare fibromioblasti (FM)
- Seme fibroblasti primari a circa il 30% di confluenza in due pozzi di una piastra da 12 porci (2 x 104 cellule/pozzo) al fine di avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo.
- Per la trasduzione lentivirale, aggiungere da 2 a 5 x 109 vg (particelle del genoma virale) di hTERT-puromicina lentivirus in 400 μL di mezzo fibroblasto. Al secondo pozzo, aggiungere solo 400 μL di mezzo fibroblasto. Aggiungere 1 mL di supporti il giorno seguente.
NOTA: I plasmidi per la produzione di lentivirus sono stati ottenuti dal gruppo che ha pubblicato il documento Chaouch et al, 2009. Sono anche descritti individualmente in Aure et al, 200713 per hTERT plasmide e Barde et al, 200614 per il sistema Tet-on utilizzato per la progettazione del plasmide MyoD. Sono stati ottenuti grazie ad un accordo di trasferimento materiale con Genethon, Francia (si prega di contattare il Dr. Vincent Mouly per ottenere questi plasmidi - vincent.mouly@upmc.fr). In breve, l'hTERT è costituito dalla variante 1 hTERT guidata da un promotore CMV mentre la puromicina è guidata da un promotore PGK. Il plasmide MyoD contiene una variante MyoD 1 guidata da un promotore CMV sotto il controllo del repressore rtTA2. Questo plasmide contiene anche la selezione di igromicina espressa grazie al promotore SV40.
I lentivirus sono stati prodotti utilizzando una produzione lentivirale regolare (vedi protocollo Wang e McManus JoVe15). In breve, l'aiutante MDL, Rev-Helper, SVS-G-helper sono stati trasfetati attraverso la precipitazione del cloruro di calcio anche di plasmidi hTERT o MyoD. Dopo 48 ore, il supernatante è stato raccolto, e poi per altri tre giorni. Tutti i supernatanti sono stati poi concentrati per ultracentrifugazione. Il pellet è stato quindi rimescolato nel tampone Tris-HCL+NaCl+EDTA. La stima del titer è stata valutata mediante test qPCR del lentivirus standard. - Uno o due giorni dopo, trasferire le cellule in una piastra da 6 po 'e farle crescere fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.
- Integrare il mezzo fibroblasto con 1 μg/mL di puromicina e aggiungere 2 mL ad ogni pozzo.
- Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle del pozzo di controllo sono morte (fino a 12 giorni), cambiando i supporti ogni 2-3 giorni. Passare le cellule dal piatto da 6 pozzi in due piatti da 10 cm2 per un'ulteriore proliferazione.
- Congelare fiale di fibroblasti dopo la selezione. Etichetta come F(hTer).
- Semi di fibroblasti che esprimono hTERT (F(hTer)) a circa il 30% di confluenza nel mezzo fibroblasto, in due pozzi di una piastra da 12 pozza, per avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo.
- Per la trasduzione del lentivirus, mescolare da 2 a 5 x10 9 vg di MyoD-hygromicinaB lentivirus in 400 μl di mezzo fibroblasto e aggiungere ai rispettivi pozzi; al terzo bene aggiungere 400 μl mezzo fibroblasto. Aggiungere 1 mL di mezzo il giorno successivo.
- Uno o due giorni dopo trasferiscono le cellule in una piastra a 6 po 'e crescono fino al 60-70% di confluenza.
- Integrare il mezzo di crescita dei fibroblasti con igromicina B (400 μg/mL) e aggiungere 2 mL ad ogni pozzo.
- Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle del pozzo di controllo sono morte (fino a 12 giorni), cambiando i supporti ogni 2-3 giorni.
- Congelare fiale di fibroblasti dopo la selezione. Etichetta come FM seguita dal numero/nome di identificazione della cella.
3. Protocollo di transdifferenziazione
- Seme trasdotto FM su 10 cm2 piatti con confluenza 30-40%. In una piastra di 12 po ', seme 6 x 104 cellule (questo dipende dalla singola linea cellulare).
NOTA: Per l'immunosocienza, le cellule di semi su coprispasmi di vetro o scivoli da camera rivestiti con Matrigel. Diluire Matrigel a 1:10 nel mezzo DMEM, aggiungere un volume sufficiente a coprire la superficie e lasciare che le diapositive si siedano a temperatura ambiente per un'ora. Aspirare subito prima di seminare le cellule. - Per l'induzione dei mioblasti, quando i fibroblasti hanno raggiunto il 70% di confluenza(figura 3A),sciacquare la superficie cellulare con PBS e aggiungere mezzi di mioblasto fresco integrati con dossiciclina fresca da 8 μg/mL.
NOTA: Il successo della differenziazione è compromesso oltre l'80% di confluenza. - Dopo due o tre giorni dopo, le cellule sono confluenti al 90-95% e la loro morfologia sarà cambiata (Figura 3B). Risciacquare la superficie cellulare con PBS e aggiungere nuovi mezzi di differenziazione integrati con dossiciclina fresca da 8 μg/mL.
- Continuare a cambiare i supporti ogni 2-3 giorni senza passare fino a quando non vengono stabiliti miotubi (confermare tramite morfologia) (Figura 3C).
- Da sette a dieci giorni dopo aver iniziato la differenziazione del miotubo, le cellule dovrebbero essere completamente differenziate e possono iniziare a staccarsi o morire. Prima che ciò accada, raccogli i miotubi per ulteriori analisi.
NOTA: Il decorso del tempo della formazione del miotubo dipende dalla linea cellulare. Mutazioni nelle proteine correlate ai muscoli possono interferire nel potenziale miogenico. Quando i miotubi iniziano ad apparire luminosi e sembrano bianchi ai bordi, è un segnale che stanno iniziando a staccarsi (Figura 4). - Per raccogliere i miotubi, raccogliere i supporti e trasferirli su un tubo conico da 50 ml. Il mezzo può contenere miotubi che si sono staccati.
- Risciacquare i miotubi con PBS da 5 ml e trasferire PBS nel tubo da 50 ml.
- Aggiungere 3 mL dello 0,25 % di tripina alla superficie cellulare. Mettere il piatto nell'incubatrice per 5 minuti. Controllare il piatto al microscopio per vedere se le cellule sono sollevate. In caso meno, riposizionare nell'incubatrice per altri 5 minuti.
- Una volta staccate le cellule, aggiungere 7 mL di mezzi fibroblasti al piatto e pipettare su e giù per risospendare le cellule. Raccogliere le celle nel tubo conico da 50 ml.
- Centrifuga a 1.200 x g per 7 min a 4 °C.
- Aspirare con cura il liquido, senza disturbare il pellet. Conservare i pellet a -80 °C fino a un'ulteriore lavorazione.
4. Immunostaining di miotubi differenziati
NOTA: Per l'immunosocienza, far crescere le cellule in coverlips di vetro o vetrine da camera come notato sopra.
- Una volta che i miotubi sono completamente differenziati, aspirare i supporti e risciacquare accuratamente le diapositive con PBS. Aspirare pbs off.
- Aggiungere pfa fresco al 4% (500 μL per pozzo di una piastra da 12 pozzetti) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aspirare pfa off.
- Risciacquare con 1 mL PBS.
- Incubare con glicina 0,2 M a temperatura ambiente, per 10 minuti. Aspirare la glicina.
- Permeabilize con PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/pozzo di una piastra da 12 pozzetti), per 10 min con agitazione delicata.
- Blocco con 300 μL/pozzo di soluzione di blocco, per 10 min con agitazione delicata.
- Incubare con anticorpo primario diluito 1:50 in 300 μL di soluzione di blocco, per 2 ore a temperatura ambiente, con tremori delicati.
- Risciacquare tre volte con 1 mL/pozzetti di PBS per 5 minuti, con delicati scuotimenti.
- Incubare con anticorpo secondario diluito 1:500 in 300 μL di soluzione di blocco, per 1 ora, a temperatura ambiente, con delicata agitazione. Coprire la piastra con un foglio di alluminio.
- Risciacquare tre volte con 1 mL/pozzetti di PBS per 5 minuti, con delicati scuotimenti.
- Incubare con DAPI diluito in PBS per 10 minuti. Risciacquare tre volte con 1 mL/pozzo di PBS.
- Aggiungere una goccia di supporto di montaggio a uno scivolo di vetro. Rimuovere il coverslip con le forcep e posizionarlo a faccia in giù sulla goccia del mezzo di montaggio.
- Invertire lo scorrimento su un tovagliolo di carta e premere delicatamente per rimuovere bolle ed eccesso di mezzo di montaggio.
- Sigillare gli scivoli con smalto e conservare a 4 °C fino all'imaging.
5. Trasfezione oligonucleotide antisenso
NOTA: Il protocollo sottostante è per la trasfezione di una piastra a 6 po'. Regolare i volumi di conseguenza per piastre più piccole o più grandi. La trasfezione viene eseguita in mioblasti confluenti al 100% quando le cellule sono pronte per la fase di differenziazione.
- Aspirare il supporto di crescita del mioblasto e sciacquare le cellule con 1 mL PBS.
- Aggiungere 500 μL/porsi di mezzi OptiMEM e incubare a 37 °C per 1 ora.
- Diluire l'oligonucleotide antisense (AON) in 100 μL di OptiMEM alla concentrazione finale desiderata (cioè 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per AON da 2'ometil-fosforotioato. - Mescolare la lipofectamina con OptiMEM (volume finale di 100 μL) per dare un rapporto finale di 1:1 (μg DNA: μL lipofectamina). Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Unire la lipofectamina diluita con l'AON diluito. Mescolare delicatamente con pipettazione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire una formazione complessa. Evitare bolle d'aria.
- Aggiungere 200 μL di lipofectamina e miscela AON ai rispettivi pozzi. Incubare le cellule durante la notte a 37 °C, 5% CO2.
- Il giorno seguente rimuovere la miscela di trasfezione e aggiungere 2 mL di mezzi di differenziazione calda integrati con doxiciclina.
- Raccogliere le cellule almeno tre giorni dopo per l'estrazione dell'RNA o da sette a 21 giorni in caso di analisi proteica.
NOTA: I giorni di differenziazione necessari per rilevare l'RNA e/o l'espressione proteica possono variare di conseguenza al gene di interesse o alla linea cellulare. Nel caso di DMD, è possibile rilevare il suo mRNA entro tre giorni. Il rilevamento delle proteine della distrofica richiede almeno sette giorni. Questo varia a seconda della linea cellulare. Alte concentrazioni di AON e reagente di trasfezione possono influire sulla transdifferenziazione.
6. Trasduzione AAV1-U7
NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per piastre a 6 pozzi. Regolare i volumi proporzionalmente all'area della superficie di coltura. La trasduzione viene eseguita in mioblasti confluenti al 100% quando le cellule sono pronte per la fase di differenziazione. AAV1 è il sierotipo AAV con la migliore capacità di trasduzione dei mioblasti coltivati.
- Aspirare il mezzo di crescita del mioblasto e sciacquare le cellule con 1 mL PBS.
- Diluire 0,5-1 x 1011 particelle virali di AAV1-U7 in 700 μL di mezzi di differenziazione calda integrati con doxiciclina.
NOTA: Usiamo qPCR per determinare la concentrazione virale. La quantità di virus da utilizzare può variare a seconda del metodo di quantificazione e deve essere determinata in precedenza utilizzando un saggio reporter. - Aggiungere il mix virale al pozzo facendolo cadere in modo omogeneo.
- Il giorno seguente, aggiungere 1,3 mL di mezzi di differenziazione calda integrati con doxiciclina.
- Raccogliere le cellule almeno tre giorni dopo per l'estrazione dell'RNA o da sette a 21 giorni in caso di analisi proteica.
7. Estrazione dell'RNA
NOTA: Tutto il materiale utilizzato durante questo passaggio deve essere privo di RNasi.
- Aggiungere più volte 500 μL di TRIzol per pellet e pipettare su e giù per assicurarsi che le cellule siano lysed omogeneamente.
- Trasferire il lisato cellulare in un tubo da 1,5 ml e incubarlo per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 μL di cloroformio e agitare manualmente per 15 s. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 4 °C. Raccogliere la fase acquosa (superiore) e trasferirla in un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Per 1 volume della fase acquosa, aggiungere 1 volume di etanolo al 100% e mescolare mediante pipettazione.
NOTA: Si consiglia la purificazione e la concentrazione delle colonne. - Trasferire il campione in una colonna IC Zymo-Spin in un tubo di raccolta e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
- Per la digestione DNasi I in colonna, pre-lavare la colonna con tampone di lavaggio RNA da 400 μL. Centrifuga a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
- Preparare 40 μL di miscela di reazione di DNasi per campione. Mescolare 5 μL di DNA I con tampone di digestione del DNA da 35 μL.
- Aggiungere la combinazione direttamente alla matrice di colonne. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere 400 μL RNA Prep Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
- Aggiungere 700 μL RNA Wash Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
- Aggiungere 400 μL RNA Wash Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 2 min per garantire la completa rimozione del tampone di lavaggio. Trasferire la colonna con attenzione in un tubo RNasi-free da 1,5 ml.
- Aggiungere 15 μL di acqua priva di nucleasi direttamente alla matrice della colonna. Incubare per 5 minuti e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto.
NOTA: Raccogliere l'RNA eluitato e applicarlo di nuovo alla colonna per aumentare la resa. Centrifuga a 12.000 x g per 1 minuto. - Posizionare i campioni sul ghiaccio e quantificare i campioni in una Nanodrop.
- Conservare i campioni a -80 °C.
8. Analisi RT-PCR
NOTA: In questo passaggio, presentiamo un suggerimento di reagenti per rilevare l'espressione dell'mRNA di distroficina, ma può essere facilmente adattato ad altri reagenti di scelta.
- Trascrizione inversa
- Scongelare tutti i reagenti e tenerli sul ghiaccio.
- Preparare un mix con 4 μL di 5x Reaction Buffer, 2 μL di dNTP Mix (10 mM), 1 μL di RiboLock RNasi Inhibitor e 1 μL di RevertAid RT.
- Mescolare delicatamente il tubo e centrifugare brevemente.
- Nei tubi PCR da 0,2 ml, aggiungere il volume adeguato di RNA per avere 1 μg per reazione. Aggiungere acqua priva di nucleasi q.s.p 12 μL. Includere un tubo senza la transcriptasi inversa come controllo negativo e un tubo con acqua priva di nucleasi al posto dell'RNA.
- Distribuire 8 μL di miscela di reazione per tubo. Il volume totale è di 20 μL.
- Posizionare i tubi in un termociclo e incubare per 5 minuti a 25 °C, seguiti da 60 min a 42 °C. Interrompere la reazione riscaldando a 70 °C per 5 minuti.
- Posizionare i tubi sul ghiaccio o a -20 °C per una conservazione più lunga.
- PCR
NOTA: Progettare i primer alle giunzioni di esonero preferibilmente.- Reagenti vortice e spin down prima dell'uso.
- Preparare una miscela master utilizzando primer in avanti da 0,5 μL (25 μM), primer inverso da 0,5 μL (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix e 8,5 μL di acqua priva di nucleasi per campione.
- Aliquota 22 μL di master mix in un tubo per ogni campione.
- Aggiungere 3 μL di cDNA (150 ng) al rispettivo tubo PCR. Aggiungere 3 μL di acqua priva di nucleasi al tubo di controllo negativo PCR.
- Vortice e spin giù per i tubi PCR.
- Incubare i tubi in un termociclo a 95 °C per 3 min, 95 °C per 30 s, (Tm-5) °C per 30 s, 72 °C per (1 min/kb) 34 volte, 72 °C per 5 min.
NOTA: La temperatura di ricottura ottimale può essere determinata empiricamente. Per la miscela master suggerita, sottrarre 5 °C dalla temperatura di fusione del primer. - Caricare 12 μL della reazione PCR su un gel di agarosio e congelare i campioni a -20 °C.
9. Rilevamento dell'espressione di distrofina da parte di Western Blotting
NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per la distrofica, una grande proteina di membrana. Possono essere necessarie condizioni specifiche per diverse proteine.
- Estrazione di proteine
- Dopo 7-21 giorni di differenziazione, raccogliere cellule con 5 mL di PBS con 100 μL 0,5 M EDTA e 50 μL inibitori della proteasi. Incubare a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano. Centrifuga a 1.200 x g per 5 min a 4 °C. Schioccare congelare il pellet immergere il tubo in azoto liquido. Conservare il pellet a -80 °C o procedere alla fase dilisi.
- Preparare il tampone di lysis aggiungendo 1% di digitonina, 1% inibitore della proteasi, 10% inibitore della fosfatasi e buffer di base al volume totale (60 μL per pellet cellulare).
- Aggiungere 60 μL di tampone dilisi al pellet cellulare, sul ghiaccio. Sonicare per 5 s. Siediti sul ghiaccio per 8 s. Ripetere due volte i passaggi di sonicazione e riposo.
- Incubare campioni sul ghiaccio per 30 minuti.
- Centrifuga a 14.000 x g per 20 min a 4 °C.
- Trasferire il supernatante in tubi puliti.
- Quantificare i campioni mediante saggio di acido bicinchoninico (BCA), seguendo le istruzioni del produttore.
- Mescolare la soluzione proteica con il volume appropriato del tampone Diemmli. Fare aliquote di 100 μg. Se necessario, regolare il volume a 25 μl con tampone dilisi di base. Conservare i campioni a -80 °C.
- Gonfiore occidentale
- Scongelare i campioni sul ghiaccio.
- Denaturare i campioni a 100 °C per 5 minuti, quindi raffreddarli nel ghiaccio, girare verso il basso.
- Diluire il tampone di funzionamento 20X Tris-acetato SDS in 200 mL dH2O e aggiungere 500 μL antiossidante.
- Preparare il gel di poliacrilammide tris-acetato al 3-8% rimuovendo il pettine e risciacquando con dH2O. Assemblare il gel nell'apparato di elettroforesi. Riempire la camera interna con il buffer di corsa.
- Caricare 5 μL di scala proteica e 25 μL di campione nel gel. Riempire la camera esterna con il buffer di corsa.
- Correre a 80 V per 1 h a 4 °C. Quindi, a 120 V per 2 h a 4 °C.
- Preparare 3 L di tampone di trasferimento 1X con 150 mL di metanolo 20X, 150 mL di tampone di trasferimento 20X e 2.700 mL di dH2O. Raffreddarlo fino a 4 °C.
- Tagliare 4 pezzi di carta da filtro e un pezzo di membrana nitrocellulosa. Immergere il filtro della carta e la membrana in un vassoio con tampone di trasferimento.
- Rimuovere delicatamente il gel dalla custodia e assemblarlo nell'apparato di trasferimento con carta da filtro, membrana e spugne. Il gel è posto sul lato negativo e la membrana sul lato positivo.
- Eseguire il trasferimento a 300 mA, mescolando, a 4 °C, durante la notte.
- Bloccare la membrana in 10 mL di tampone di blocco per 1 h con agitazione delicata, a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di anticorpi primari con 10 mL di tampone di blocco e 50 μL di anticorpo di distrofica (1:200).
- Scartare il tampone di blocco e aggiungere la soluzione anticorpale primaria. Incubare con agitazione delicata per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
- Risciacquare la membrana tre volte con lo 0,1% di Tween PBS, per 5 minuti con agitazione delicata.
- Preparare la soluzione anticorpale secondaria utilizzando 10 mL di soluzione di blocco, 2 μL di anticorpo anti-coniglio (1:5000) e 20 μL di 0,2% Tween.
- Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria alla membrana. Incubare per 1 h con delicata agitazione, rivestita con foglio di alluminio per proteggere dalla luce.
- Scartare la soluzione anticorpale e sciacquare la membrana 3 volte con lo 0,1% di Tween PBS, per 5 minuti con agitazione delicata, protetta dalla luce.
- Esposizione e immagine della membrana su un dispositivo di imaging.
- Macchiare la membrana per proteine totali con la macchia proteica totale Revert 700, seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Il rilevamento della distrofica mediante gonfiore occidentale dipende dall'età / mutazione del paziente e dalla capacità della cellula di fondersi e rimanere attaccata abbastanza tempo per accumulare abbastanza distrofina.
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Representative Results
Questo protocollo mostra come stabilire colture di fibroblasti derivati dalla pelle umana e convertirle in mioblasti e quindi in miotubi differenziati. Questo tipo di linea cellulare è estremamente utile per lo studio dei disturbi neuromuscolari e il test in vitro di potenziali terapie.
Una rappresentazione schematica della conversione dei fibroblasti è illustrata nella figura 1. La figura 2A mostra un frammento di pelle e i fibroblasti che ne emergono. I fibroblasti devono essere passati ad un nuovo piatto quando si raggiunge la confluenza (Figura 2B). La figura 3A mostra la confluenza ideale dei fibroblasti prima di passare al mezzo di crescita del mioblasto integrato con doxiciclina. Le cellule dovrebbero essere circa il 70% confluenti perché proliferano ancora durante il processo di conversione. Se le cellule sono superiori all'80% confluenti, la differenziazione può essere compromessa. La conversione in mioblasti richiede da due a quattro giorni, ed è confermata dall'osservazione della morfologia. Le celle diventano allungate e orientate parallelamente, come illustrato nella figura 3B. Dopo l'aggiunta del mezzo di differenziazione, i mioblasti smettono di dividersi e iniziano a fondersi per formare miotubi multinucleati (Figura 3C). Quando i bordi dei miotubi sembrano bianchi e luminosi, stanno per staccarsi (Figura 4). A questo punto, raccogliere o correggere le celle.
Il successo della differenziazione varierà tra diverse linee cellulari/mutazioni. L'immunocolorazione delle proteine muscolari espressa dai miotubi maturi conferma il potenziale miogenico dei fibroblasti convertiti (Figura 5). L'analisi RNA-Seq che confronta i miotubi FM e il muscolo scheletrico ha mostrato un'espressione di alto livello delle trascrizioni dai geni della catena di miosina embrionale (MYH3) e neonatale (MYH8) e una buona correlazione complessiva trascrittame-wide con il muscolo(Figura 6). Le trascrizioni per le proteine sarcomeriche giganti titina (TTN), nebulina (NEB) e oscurante (OBSCN) sono espresse anche dai miotubi FM, indicando l'upregolazione di queste grandi trascrizioni coinvolte nella miofibrillogenesi. Pertanto, le cellule FM hanno un profilo di espressione specifico del muscolo, dimostrando che sono un surrogato utile e affidabile per le linee cellulari derivate dai muscoli.
Per illustrare il salto dell'esone, abbiamo usato questo protocollo in una delle duplicazioni di esoni più frequenti nel gene DMD. La duplicazione dell'esone 2 porta all'interruzione della cornice di lettura DMD, quindi il ripristino del fotogramma di lettura dopo il salto dell'esone dovrebbe portare all'espressione della distrofina a figuraintera. Tuttavia, è anche possibile che saltare l'esone 2 sia molto efficiente con conseguente trascrizione fuori dal frame. Tuttavia, in questo caso, saltare entrambe le copie dell'esone 2 induce l'utilizzo di un sito di ingresso ribosoma interno alternativo (IRES) presente nell'esone 5, producendo così distrofia funzionale n-troncata che è stata identificata in pazienti ancora ambulante nei loro anni '7012. La figura 7A mostra i risultati rappresentativi dell'RT-PCR delle cellule FM con duplicazione dell'esone 2. Le cellule FM sono state trattate con AON o AAV1-U7 portando una sequenza antisense per saltare l'esone 2. Nella figura 7B, un'immunoblot mostra il rilevamento della distrofia troncata da N nelle cellule FM trattate con AAV1-U7. Il trattamento in vitro delle cellule FM serve come prova del concetto per le strategie di salto con l'esone.
Figura 1: Rappresentazione schematica della conversione dei fibroblasti in cellule miogeniche. Una biopsia cutanea è ottenuta da soggetti umani. Frammenti di pelle sono posti su piatti di cultura. Entro una settimana, i fibroblasti iniziano ad emergere. I fibroblasti vengono prima trasdotti con il gene hTERT, e poi con il gene Myod, usando vettori lentivirali. Dopo la selezione antibiotica delle cellule infette, la conversione in mioblasti è indotta dall'aggiunta di doxiciclina al mezzo di crescita del mioblasto. Entro due o quattro giorni, le cellule diventano allungate e orientate parallelamente. Dopo il passaggio al mezzo di differenziazione, il mioblasto si fonde tra loro e forma miotubi multinucleati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Frammenti di biopsia cutanea in coltura. (A) Primi fibroblasti che emergono da frammenti cutanei. (B) Fibroblasti confluenti sono emersi dal frammento di pelle. Barra di scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Trasifferazione dei fibroblasti. (A) Immagine rappresentativa dei fibroblasti confluenti al 70%. (B) I mioblasti convertiti hanno una morfologia allungata e sono organizzati parallelamente. (C) I miotubi sono stati differenziati per 7 giorni. Barra di scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine rappresentativa del distacco dei miotubi. Le frecce indicano i bordi bianchi e luminosi dei miotubi che iniziano a staccarsi. Barra di scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immunofluorescenza dei miotubi differenziati. Immunosocienza della catena pesante della miosina nei miotubi derivati da un individuo sano (A) e pazienti con disturbi neuromuscolari (B e C). In B sono mostrate cellule di distrofia miotonica di tipo 1 (DM1) che trasportano 230 ripetizioni CTG, e in C sono cellule DM1 con 900 ripetizioni CTG. Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Schema del trascritoma dei miotubi FM rispetto al muscolo scheletrico. Schema di trascrittame dei miotubi FM rispetto al muscolo scheletrico. I conteggi di lettura per milione di letture mappate per 12.134 trascrizioni sono mostrati per le librerie Illumina RNA-Seq preparate da miotubi FM e una biopsia muscolare scheletrica umana. I livelli di trascrizione tra le due librerie avevano una correlazione di Pearson di 0,71 e una correlazione di rango spearman di 0,73. Le trascrizioni per le catene pesanti della miosina dello sviluppo e le grandi proteine sarcomeriche sono evidenziate in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Rt-PCR rappresentativo e western blot che mostra l'esone DMD che salta nelle celle FM. (A) Espressione DMD di RT-PCR. I fibroblasti di un paziente che ospitava una duplicazione dell'esone 2 dmd sono stati convertiti in cellule FM. L'RNA estratto dalla biopsia muscolare è stato utilizzato come controllo, dimostrando che le cellule non trattate FM esprimono la stessa trascrizione duplicata. Le cellule FM trattate con AON hanno un parziale salto della duplicazione dell'esone 2, mentre le cellule trattate con AAV1-U7 hanno mostrato una predominanza di trascrizioni con duplicazione dell'esone 2 saltata. (B) Immunoblot rappresentativo delle cellule FM trattate con AAV1-U7. La distrofina più piccola troncata a N è stata rilevata 14 giorni dopo il trattamento (indicata dalla freccia). Dati precedentemente pubblicati in Wein et al. La traduzione da un esone DMD 5 IRES si traduce in un isoforma di distrofica funzionale che attenua la distrofinopatia negli esseri umani e nei topi. Medicina della Natura. 2014. Springer Nature Limited 2020. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mezzo di crescita dei fibroblasti | DMEM con FBS 20%, 1% antibiotico-antimicotico |
| Mezzo di congelamento | 10% DMSO, 90% mezzo fibroblasto |
| Soluzione di stock di doxiciclina 1000X | 8 mg di doxiciclina in 1 mL di acqua ultra pura. Filtrare in filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota in tubi PCR. Conservare a -20 °C, protetto dalla luce. |
| Mezzo mioblasto | Mezzo di crescita delle cellule muscolari scheletriche (vedi elenco sopra) con integratori, 8 μg / mL doxiciclina. Ad esempio: 100 μL di soluzione stock 1000X in 100 mL. |
| Mezzo di differenziazione | Mezzo di differenziazione cellulare scheletrica con integratori (vedi elenco sopra), 8 μg /mL doxiciclina. Ad esempio: 100 μL di soluzione stock 1000X in 100 mL. |
| Soluzione di blocco per la colorazione IF | Siero di capra al 10% (o siero di animale in cui è stato allevato anticorpi secondari) in 1X PBS |
| Tampone di base per l'estrazione di proteine | NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,05 % NP-40. Regolare il pH a 7,4. Conservare a 4 °C. |
Tabella 1: Ricette medie
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Discussion
Per ottenere linee cellulari FM di buona qualità, alcuni passaggi sono fondamentali. Prima viene elaborata la biopsia cutanea, maggiori sono le probabilità di ottenere fibroblasti sani. Anche il numero di passaggi delle colture di fibroblasti è importante. Le cellule primarie hanno una capacità proliferativa limitata e dopo molti passaggi, entrano in senescenza replicativa. Pertanto, è meglio avere uno stock di fibroblasti a un basso numero di passaggi e trasformare le cellule al primo passaggio possibile.
Un altro passo importante è anche quello di avere una produzione virale che abbia la massima purezza e quantificazione accurata. Ad esempio, la quantificazione del genoma virale utilizzando qPCR fornisce misurazioni ragionevoli, ma la quantificazione da parte di ddPCR (DIGITAL Droplet PCR) è più accurata.
Inoltre, è fondamentale l'adeguata confluenza di fibroblasti per la conversione del mioblasto. Se le cellule sono inferiori al 70% o superiori all'80% confluenti, la differenziazione miogenica può essere compromessa. Se le cellule sono troppo confluenti, ci sarà la sovrapposizione di strati di miotubi, che interferiscono con la colorazione e l'imaging. La concentrazione di doxiciclina è fondamentale per la corretta attivazione e l'espressione sostenuta del gene Myod. È molto importante aggiungere sempre la doxiciclina al mezzo giusto prima di fare cambiamenti multimediali, in quanto si degrada rapidamente dopo essere diluita nel mezzo e conservata a 4 °C. Il materiale deve essere conservato a -20 °C ad una concentrazione di 1000X e protetto dalla luce. Non congelare di nuovo le aliquote scongelate. È molto importante seguire questi dettagli per garantire esperimenti riproducibili e discriminare una differenziazione compromessa a causa di una mutazione genetica da problemi tecnici. Tuttavia, a seconda della mutazione o del tipo di malattia, una buona differenziazione potrebbe non essere possibile. Per garantire risultati affidabili, è molto importante replicare gli esperimenti a numeri di passaggio simili.
Nella nostra esperienza, la capacità di differenziazione persiste almeno fino al passaggio 25-27, specialmente nei controlli di tipo selvaggio. Lo stesso può essere valido per alcune linee cellulari maso, ma dipende dalla linea cellulare. Alcune linee cellulari DMD mantengono ancora il potenziale miogenico superiore a P20. In opposizione, una linea cellulare di distrofia miotonica di tipo 1 (DM1) presentava una ridotta miogenicità dopo P8. Tuttavia, nel caso del DM1, ciò non sorprende in quanto è stato dimostrato che le mutazioni in DM1 svolgono indirettamente un ruolo nella differenziazione muscolare16. La ritenzione della capacità di differenziazione miogenica dovrebbe essere affrontata individualmente, ma in generale, la maggior parte delle linee cellulari la trattiene fino a P20-25.
In sintesi, la conversione dei fibroblasti in mioblasti è un potente strumento per studiare e testare strategie terapeutiche per i disturbi neuromuscolari. Facilita l'accesso ai modelli cellulari umani evitando la complicata obtenzione delle biopsie muscolari e riduce l'inconveniente di una biopsia muscolare per i pazienti.
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Disclosures
Nationwide Children's Hospital ha concesso in licenza il programma di salto exon 2 descritto nel presente documento ad Audentes Therapeutics. K.M.F. e N.W. hanno ricevuto pagamenti di royalty a seguito di questa licenza.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Vincent Mouly per aver condiviso le sue conoscenze in passato riguardo al modello. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., e R.B.W.)), il National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., e N.W.). N.W. ha ricevuto il sostegno di borse di studio dall'Ohio State University / Nationwide Children's Hospital Muscle Group e dalla Philippe Foundation. Questo lavoro è stato sostenuto anche da fondi discrezionali interni e parte del lavoro di salto di exon 2 è stato sostenuto anche da CureDuchenne (K.M.F.) e Association Francaise Contre Les Myopathies. Numero IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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