Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Summary

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Abstract

O sistema cardiovascular é um ator-chave na fisiologia humana, proporcionando nutrição à maioria dos tecidos do corpo; os vasos estão presentes em diferentes tamanhos, estruturas, fenótipos e desempenho, dependendo de cada tecido perfumado específico. O campo da engenharia de tecidos, que visa reparar ou substituir tecidos corporais danificados ou ausentes, conta com angiogênese controlada para criar uma vascularização adequada dentro dos tecidos projetados. Sem um sistema vascular, construções grossas projetadas não podem ser suficientemente nutridas, o que pode resultar em morte celular, má engrafia e, finalmente, falha. Assim, compreender e controlar o comportamento dos vasos sanguíneos projetados é um desafio marcante no campo. Este trabalho apresenta um sistema de alta produtividade que permite a criação de redes de embarcações organizadas e repetíveis para estudar o comportamento dos navios em um ambiente de andaime 3D. Este protocolo de semeadura em duas etapas mostra que os vasos dentro do sistema reagem à topografia do andaime, apresentando comportamentos distintos de brotação dependendo da geometria do compartimento em que os vasos residem. Os resultados obtidos e a compreensão deste sistema de alto rendimento podem ser aplicados a fim de informar melhores projetos de construção de andaimes bioimpressos 3D, onde a fabricação de várias geometrias 3D não pode ser rapidamente avaliada ao usar a impressão 3D como base para ambientes biológicos celularizados. Além disso, o entendimento deste sistema de alto rendimento pode ser utilizado para a melhoria do rastreamento rápido de medicamentos, o rápido desenvolvimento de modelos de co-culturas e a investigação de estímulos mecânicos na formação de vasos sanguíneos para aprofundar o conhecimento do sistema vascular.

Introduction

O campo da engenharia de tecidos está progredindo rapidamente para a fabricação de construtos projetados para substituir órgãos e tecidos perdidos ou danificados¹. No entanto, construções totalmente funcionais ainda não foram alcançadas, em parte, uma vez que a geração de redes vasculares operacionais para nutrição tecidual continua sendo um desafio notável. Sem a vascularização adequada, os tecidos projetados limitam-se a um transporte passivo de difusão de oxigênio e nutrientes, restringindo a espessura máxima do tecido viável ao limite de difusão, aproximadamente 200 μm². Tais espessuras não são adequadas para reparar grandes defe....

Protocol

1. Fabricação de andaimes tesvendados

NOTA: A fotolitografia é uma técnica difundida que requer equipamentos especializados tipicamente alojados dentro de uma instalação/laboratório de nanofabização. O método estabelecido neste protocolo foi generalizado o máximo possível para o público; no entanto, pequenas alterações nos procedimentos podem ser necessárias dependendo do equipamento disponível ao leitor. Recomendamos a realização desses procedimentos em uma sala limpa em uma instalação de nanofabização para garantir a mais alta qualidade do processo. Antes de começar, obtenha acesso a um alinhador de máscaras (ou alguma configuração de expos....

Results

O protocolo apresentado, utilizando técnicas de estereotipografia, permite a fabricação de andaimes tesvendados feitos de fotoresist SU-8. Andaimes com geometrias de compartimento distintas (quadrados, hexágonos e círculos) e características altamente precisas e repetíveis foram obtidas(Figura 1).

Discussion

A necessidade de uma vasculatura rica dentro de tecidos projetados é fundamental para a sobrevivência da construção e função adequada¹. Embora a engenharia do sistema vascular tenha sido o foco de uma vasta quantidade de pesquisas, muito resta investigar e entender²⁴. Em particular, ao recriar um tecido específico, a microvasculatura deve se comportar e organizar-se nesse ponto¹². A abordagem mais comum para a geração de microvessels é a co-semeadura.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotool freeware	NIH-CCR		Download grátis em https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home Soro
albumina bovina Probumin	Millipore	82-045-1
Células-tronco da polpa dentária	Lonza	PT-5025
ECM media + kit de bala	Sciencell	# 1001
Etanol 96%	Gadot-Group	64-17-5
Selante de fibrina Evicel	Johnson& Johnson	EVB05IL	Fornece soluções de trombina e fibrinogênio (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
Anticorpo anti-camundongo Cy3 de cabra	Jackson	115-166-072
Cabra anti-coelho Alexa-Fluor 488	Thermo- Fisher Scientific	A11034
Células microvasculares adiposas humanas	Sciencell	#7200
Humano fibronectina	Sigma	F0895-5MG	Concentração de estoque: 1 mg/mL
ImageJ	NIH		Download grátis em https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Álcool isopropílico	Gadot-Group	67-63-0
Reagente de decolagem	Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	Nome comercial Omnicoat
Low-glucose DMEM	Biological Industries	01-050-1A
Camundongo anti-SMA anticorpo	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
Solução de paraformaldeído 4% em PBS	ChemCruz	SC-281692
Solução de penicilina-estreptomicina-nistatina	Indústrias biológicas	03-032-1B
Solução salina tamponada com fospato (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
Bolacha de silício anticorpo anti-vWF de coelho	Abcam	ab9378
Silicon	Valley Microelectronics (SVM)		Wafers 4", tipo N-1-10, 500-550 mícrons de espessura
SU-8 2050 fotorresistente	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 desenvolvedor	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	Rolamento 57836