Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Resumo

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Resumo

O sistema cardiovascular é um ator-chave na fisiologia humana, proporcionando nutrição à maioria dos tecidos do corpo; os vasos estão presentes em diferentes tamanhos, estruturas, fenótipos e desempenho, dependendo de cada tecido perfumado específico. O campo da engenharia de tecidos, que visa reparar ou substituir tecidos corporais danificados ou ausentes, conta com angiogênese controlada para criar uma vascularização adequada dentro dos tecidos projetados. Sem um sistema vascular, construções grossas projetadas não podem ser suficientemente nutridas, o que pode resultar em morte celular, má engrafia e, finalmente, falha. Assim, compreender e controlar o comportamento dos vasos sanguíneos projetados é um desafio marcante no campo. Este trabalho apresenta um sistema de alta produtividade que permite a criação de redes de embarcações organizadas e repetíveis para estudar o comportamento dos navios em um ambiente de andaime 3D. Este protocolo de semeadura em duas etapas mostra que os vasos dentro do sistema reagem à topografia do andaime, apresentando comportamentos distintos de brotação dependendo da geometria do compartimento em que os vasos residem. Os resultados obtidos e a compreensão deste sistema de alto rendimento podem ser aplicados a fim de informar melhores projetos de construção de andaimes bioimpressos 3D, onde a fabricação de várias geometrias 3D não pode ser rapidamente avaliada ao usar a impressão 3D como base para ambientes biológicos celularizados. Além disso, o entendimento deste sistema de alto rendimento pode ser utilizado para a melhoria do rastreamento rápido de medicamentos, o rápido desenvolvimento de modelos de co-culturas e a investigação de estímulos mecânicos na formação de vasos sanguíneos para aprofundar o conhecimento do sistema vascular.

Introdução

O campo da engenharia de tecidos está progredindo rapidamente para a fabricação de construtos projetados para substituir órgãos e tecidos perdidos ou danificados¹. No entanto, construções totalmente funcionais ainda não foram alcançadas, em parte, uma vez que a geração de redes vasculares operacionais para nutrição tecidual continua sendo um desafio notável. Sem a vascularização adequada, os tecidos projetados limitam-se a um transporte passivo de difusão de oxigênio e nutrientes, restringindo a espessura máxima do tecido viável ao limite de difusão, aproximadamente 200 μm². Tais espessuras não são adequadas para reparar grandes defeitos teciduais ou para a fabricação completa de órgãos, o que torna a presença da rede vascular funcional uma característica obrigatória para tecidos funcionais e implantáveis³.

O sistema vascular é composto por uma grande variedade de vasos sanguíneos, com diferentes tamanhos, fenótipos e organização, fortemente relacionados ao tecido hospedeiro. Compreender o comportamento, a resposta e as decisões migratórias tomadas pelos vasos em desenvolvimento e brotação pode instruir sua integração nos tecidos projetados⁴. Atualmente, a abordagem mais comum para a criação de redes vasculares in vitro é combinar células endoteliais (CE) com células de suporte (SCs, com a capacidade de diferenciar-se em células murais), semeadas dentro de um microambique tridimensional. Este ambiente fornece pistas químicas e físicas para permitir que as células se conectem, proliferem e se auto-reúnam nas redes de vasos^2,5,6,7,8. Quando co-cultivados, os SCs secretam proteínas de matriz extracelular (ECM) ao mesmo tempo em que fornecem suporte mecânico às CES, que formam as estruturas tubulares. Além disso, uma interação cruzada entre ambos os tipos de células promove a tubulogênese, o broto de vasos e a migração, além da maturação e diferenciação dos SCs em células murais de α-suave actin-expressing (αSMA)⁴. O desenvolvimento da rede de navios é mais comumente estudado em ambientes 3D criados com hidrogel, andaimes poliméricos porosos ou uma combinação disso. Esta última opção também fornece um ambiente amigável às células e o suporte mecânico necessário tanto para as células quanto para o ECM⁹.

Uma grande quantidade de trabalho tem sido realizada para estudar o desenvolvimento vascular, incluindo co-cultivo das células em hidrogéis^10,combinações de hidrogels-andaimes^11,12,plataformas 2D e dispositivos microfluidos¹³. No entanto, os hidrogéis podem ser facilmente deformados pelas forças^14,enquanto os sistemas 2D e microfluidos não conseguem recriar um ambiente mais próximo da natureza para obter uma resposta mais extrapolada^15,16. Entender como os navios formadores reagem ao seu ambiente circundante pode fornecer uma visão crítica que pode permitir a fabricação de ambientes projetados com a capacidade de orientar o desenvolvimento da embarcação de forma previsível. Compreender fenômenos de formação vascular é especialmente fundamental para acompanhar o rápido surgimento de técnicas de fabricação em escala submicron-micron, como estereografografia, litografia de projeção digital, produção contínua de interface líquida, jetwriting 3D, escrita de jato eletro 3D baseada em solução e técnicas emergentes de bioimpressão^{17,18,19,20,21}. Alinhar o controle dessas técnicas de micromanufatura com uma compreensão aprofundada da biologia vascular é fundamental para a criação de uma vasculatura projetada adequada para um tecido alvo.

Aqui, apresentamos um sistema 3D para estudar a resposta de novos vasos formadores e brotantes à geometria do andaime circundante, observando sua origem do broto e migração subsequente²². Utilizando andaimes 3D com geometrias de compartimento tesvendadas, e uma técnica de semeadura em duas etapas, conseguimos criar redes vasculares altamente organizadas de forma clara e fácil de analisar. As geometrias tessellated fornecem um sistema de alta produção com unidades individuais contendo embarcações que respondem ao seu ambiente local. Utilizando ECs multicoloridos, rastreamos origens de formação de brotos e padrões de migração subsequentes, correlacionados à geometria do compartimento e à localização²²dos SCs .

Embora o protocolo proposto tenha sido preparado para analisar os efeitos das pistas geométricas sobre o comportamento vascularização, essa abordagem pode ser expandida e aplicada a uma variedade de novas aplicações. O andaime tessellado e as redes facilmente inflamáveis permitem a análise direta de diferentes CEs e interação de SCs, a adição de células específicas de órgãos e sua interação com as redes vasculares, efeito medicamentoso nas redes vasculares e muito mais. Nosso sistema sugerido resulta muito versátil e de simples fabricação e processamento.

Protocolo

1. Fabricação de andaimes tesvendados

NOTA: A fotolitografia é uma técnica difundida que requer equipamentos especializados tipicamente alojados dentro de uma instalação/laboratório de nanofabização. O método estabelecido neste protocolo foi generalizado o máximo possível para o público; no entanto, pequenas alterações nos procedimentos podem ser necessárias dependendo do equipamento disponível ao leitor. Recomendamos a realização desses procedimentos em uma sala limpa em uma instalação de nanofabização para garantir a mais alta qualidade do processo. Antes de começar, obtenha acesso a um alinhador de máscaras (ou alguma configuração de exposição uv), um revestr de spin, placas quentes, uma estação de lavagem solvente, uma máscara e um limpador de plasma. Os solventes e produtos químicos usados no procedimento são perigosos, por isso, por favor, tome os cuidados mais altos para evitar qualquer exposição química. Ao projetar a máscara, identifique quais wafers de silício e máscaras são compatíveis com o spin-coater e o alinhador de máscaras. Além disso, o fotoresist localizado em direção às bordas do wafer de silício é tipicamente deformado do manuseio; portanto, faça os desenhos em direção à área central do wafer.

1. Prepare andaimes utilizando uma técnica de fotolitografia com a geometria selecionada de interesse.
   1. Antes de girar o revestimento, limpe o wafer de silício. Isso pode ser feito com limpeza de plasma ou uma técnica baseada em solvente. Se a limpeza do plasma, siga o procedimento operacional padrão do instrumento para obter detalhes operacionais. Borrife com gás nitrogênio comprimido e inspecione o wafer para garantir que ele esteja livre de detritos antes do spin-coating. Este wafer servirá como o substrato sobre o qual os andaimes são criados.
      NOTA: Para melhores resultados comece com um novo wafer. Os wafers podem ser reutilizado, mas devem estar livres de fotoresist, defeitos de superfície e detritos antigos. É útil usar pinças de wafer para manuseio.
   2. Centralizar uma bolacha de silicone no mandril do spin-coater usando um guia. Gire brevemente o wafer para garantir que ele tenha sido devidamente centrado no mandril, ajuste conforme necessário até que esteja devidamente centrado. Isso deve ser feito toda vez que um wafer é colocado no spin-coater. Dispense 1-4 mL do reagente de decolagem no wafer (isso dependerá do tamanho do wafer). Aproximadamente 2 mL de reagente de decolagem funciona bem para um wafer de 4 polegadas.
      1. Defina a velocidade de propagação do spin-coater a 500 rpm por 5 segundos, e a velocidade de giro a 1000 rpm por 30 segundos, em seguida, gire o reagente de decolagem. Inspecione o wafer para garantir que ele tenha um revestimento uniforme através do wafer. Qualquer detrito deixado no wafer será muito óbvio neste momento. Qualquer andaime em uma área com detritos provavelmente será inutilizável. Após o revestimento de giro, transfira para um prato quente e asse por 1 minuto a 200 °C.
   3. Repita a etapa anterior mais duas vezes para um total de três revestimentos.
   4. Gire o wafer de silicone revestido de reagente de decolagem com fotoresist SU-8 2050 até obter uma espessura de aproximadamente 100 μm.
      1. Dispense 1 mL de resistência para cada 25 mm de diâmetro do substrato.
         NOTA: Tenha cuidado para evitar bolhas enquanto derrama a resistência. Para o SU-8 2050, derramar aproximadamente um círculo de 2 polegadas de diâmetro, quando se usa um wafer de silício de 4 polegadas funciona bem.
      2. Reveste o SU-8 2050. Espalhe a uma velocidade de 500 rpm por 5 segundos, seguido por uma velocidade de giro entre 1700 e 1800 rpm para atingir aproximadamente 100 μm de espessura.
      3. Opcional: Depois de girar, deixe os wafers revestidos de spin para desausar durante a noite em uma superfície de nível protegida da luz antes do pré-cozimento. Isso pode ajudar a livrar a resistência de quaisquer bolhas e permitir que defeitos se nivelem.
         NOTA: A espessura real da resistência e os andaimes resultantes podem variar de acordo com os parâmetros de erro do usuário e do equipamento. Portanto, a espessura dos andaimes deve ser verificada posteriormente, na etapa 1.6. Modifique os procedimentos de revestimento de giro de acordo para alcançar a espessura desejada.
   5. Antes da exposição, pré-asse os wafers a 65 °C por 10 min e depois 95 °C por 40-50 min. Antes da exposição, teste a superfície da resistência pressionando a borda com um par de pinças para garantir que ela não seja mais brega/viscosa. É útil tirar o wafer da placa quente e deixá-lo esfriar por 0,5-1 min antes de avaliar a aderência.
      NOTA: Tempos lentos de rampa de temperatura (aquecimento e resfriamento) podem ajudar a evitar a deformação dos andaimes.
2. Exponha o fotoresistista à luz UV (350-400 nm) através de uma máscara fotográfica com uma energia de exposição de 215-240 mJ/cm² para uma espessura de resistência de 85 - 110 μm. Consulte as diretrizes do fabricante fotoresistista para correlações recomendadas de espessura de energia de exposição.
   1. Certifique-se de que a exposição está devidamente calibrada para que a energia seja verificada. Ajuste o tempo de exposição conforme necessário para alcançar a energia de exposição desejada. Além disso, os alinhadores de máscaras podem permitir diferentes modos de exposição: contato com vácuo, contato rígido, contato suave e contato de proximidade (termos específicos podem variar). Geralmente, estes impactarão a resolução e o alinhamento de recursos. Os autores normalmente usavam um modo de "contato difícil".
   2. Para pequenos recursos ou várias camadas, onde o alinhamento importará, considere os modos de exposição e os procedimentos de alinhamento da máscara com mais cuidado. Certifique-se de considerar a altura da resistência ao ajustar o valor da espessura. Consulte os procedimentos operacionais padrão do seu alinhador de máscaras para obter detalhes de operação.
      NOTA: O desenho da máscara de fotomasca determinará o tamanho dos andaimes, a geometria do compartimento e o número de andaimes obtidos por lote. O uso de um frasco de vidro duro ou quartzo renderá a maior resolução; no entanto, um frasco de filme transparente de polímero macio geralmente pode ser usado para esses grandes tamanhos de recurso (>10 μm). O uso de uma fotomask de filme pode levar a características topográficas ao longo do eixo z dos poros de andaimes como resultado de uma resolução de recurso mais pobre. Isso pode ter uma influência no comportamento celular. Verifique a resolução desejada consultar com quem estiver produzindo a máscara fotográfica para garantir que a resolução desejada seja alcançada.
3. Asse o wafer imediatamente após a exposição uv a 65 °C por 2-5 minutos e depois a 95 °C por 8-10 minutos.
4. Desenvolva os andaimes para remover a resistência não desenvolvida.
   1. Mergulhe os andaimes usando um baixo volume de solução de desenvolvedor SU-8 por 7-10 minutos para dissolver qualquer resistência não desenvolvida.
   2. Enxágüe com álcool isopropílico (IPA).
   3. Wafer seco com nitrogênio comprimido.
      NOTA: Tenha cuidado durante a etapa 1.4 para não causar a liberação prematura dos andaimes. Baixos volumes de desenvolvedor e manuseio suave são necessários para conseguir isso.
5. Após o desenvolvimento, asse as bolachas a 150 °C por 15 min.
   NOTA: Depois de assar duro, desligar a placa quente para permitir que os wafers esfriem muito lentamente pode ser vantajoso para evitar deformação/enrolamento dos andaimes finais.
6. Opcional: Após o cozimento duro e antes da decolagem, avalie a espessura do andaime, uma vez que os andaimes ainda devem ser suavemente aderidos à superfície do wafer. Para este procedimento, o contato com a profilometria funciona bem; no entanto, qualquer método apropriado poderia ser empregado.
7. Levante os andaimes do wafer.
   1. Submergir os andaimes no desenvolvedor SU-8 para fazê-los decolar imediatamente do wafer. Se os andaimes não decolarem, empurre suavemente os andaimes com um par de pinças de wafer.
   2. Remova o excesso de desenvolvedor.
   3. Transfira os andaimes para um novo recipiente e submerse em álcool isopropílico. Enxágüe no IPA por um mínimo de 6 vezes para garantir que todo o desenvolvedor tenha sido removido.
8. A seco os andaimes por pelo menos uma semana antes do uso.

2. Revestimento de fibronectina de andaimes

1. Para desinfecção, submerse os andaimes em 70% de etanol (v/v) por um mínimo de 15 minutos, e lave 2 vezes em salina tamponada de fosfato (PBS) antes de usar.
   ATENÇÃO: Os andaimes SU-8 são frágeis e podem quebrar facilmente. O manuseio é recomendado usando fórceps de pontas cegas e curvas, e devem ser tratados com o maior cuidado. Uma manipulação mais fácil pode ser obtida submergindo os andaimes em líquido, para evitar interações eletrostáticas entre os andaimes e a superfície.
2. Prepare uma diluição de 50 μg/mL de fibronectina humana na PBS e cubra os andaimes por adsorção de proteínas.
   1. Misture 1,5 μL de solução de estoque de fibronectina (1 mg/mL) com 28,5 μL de PBS por cada andaime a ser semeado. De preferência, prepare apenas uma diluição de fibronectina a ser usada para todos os andaimes para evitar erros de pipetação.
      1. Para 10 andaimes, misture 15 μL de solução de fibronectina de estoque em 285 μL de PBS, totalizando um total de 300 μL de 50 μg/mL de diluição de fibronectina.
   2. Coloque os andaimes esparsamente em cima de uma superfície hidrofóbica (ou seja, cultura não tecidual (não-TTC) prato de 10 cm) e cubra cada andaime com 30 μL da diluição da fibronectina preparada na etapa 2.2.1.
      ATENÇÃO: Certifique-se de que nenhuma bolha está presa nos compartimentos do andaime. Se as bolhas estiverem presentes, elas podem ser removidas sacudindo suavemente o andaime dentro da gotícula ou tubulação de luz.
   3. Substitua a tampa da placa e coloque os andaimes cobertos de fibronectina em uma incubadora com 37 °C e 100% de umidade por um mínimo de uma hora.
   4. Após a incubação, enxágue levemente os andaimes em PBS para remover os remanescentes de fibronectina. Os andaimes podem ser mantidos em PBS a 4 °C por até uma semana antes do uso.

3. Semeadura de células endoteliais

1. Prepare o meio EC misturando o meio basal com seus componentes correspondentes do kit médio, incluindo uma solução antibiótica (Pen/Estreptocos), soro bovino fetal (FBS) e suplementos de crescimento de células endoteliais, conforme indicado pelo fabricante.
2. Faça uma suspensão da célula endotelial microvascular de adiposa humana (HAMEC) em meio CE com uma concentração de 4 x 10⁶ células/mL.
   NOTA: A imagem em tempo real pode ser realizada se as células endoteliais usadas forem previamente transfeinadas para expressar uma proteína fluorescente, ou pré-manchadas usando um corante de membrana citoplasmática não tóxica (ainda mais referido como CEs rotulado).
3. Usando fórceps, coloque um andaime revestido de fibronectina por poço em uma placa nãoTC 24-well bem.
4. Cubra cada andaime com gotículas de 25 μL da suspensão HAMEC. Cuidado para não deixar a suspensão fluir para longe do andaime, pois pode dificultar a adesão celular.
5. Coloque a tampa na placa e coloque-a em uma incubadora a 37 °C, 5% DE CO₂ e 100% de umidade. Deixe incubar por um mínimo de 60 minutos e um máximo de 90 minutos.
   NOTA: Durante a incubação, colocar a placa em um agitador orbital dentro da incubadora melhora o apego celular nas paredes do andaime. O agitador orbital deve ser definido em não mais do que 5 rpm.
6. Após a incubação, encha cada poço com 700 μL de meio CE usando uma pipeta.
   NOTA: Espere ver ECs na parte inferior do poço, já que algumas das células não se prendem ao andaime e caem pelos vazios do andaime.
7. Incubar os andaimes endotelializados até que a confluência ce possa ser observada usando microscopia fluorescente nas paredes do andaime (quando se usa CEs rotulados), ou por 3 dias (quando se usar CEs não rotulados), o que fornece tempo suficiente para alcançar a confluência ce. Mude o meio dia não.

4. Apoiar a semeadura e a co-cultura das células de suporte

1. Prepare a célula-tronco da polpa dentária (DPSC) média (DPSCm) misturando 500 mL do meio águia modificado de baixa glicose Dulbecco (DMEM de baixa glicose), 57,5 mL de FBS, 5,75 mL de aminoácidos não essenciais (NEAA), 5,75 mL de GlutaMAX e 5,75 mL de solução de penicilina-estreptomicina-nystatina.
2. Transfira os andaimes endotelializados em uma nova placa nãoTC de 24 poços para descartar ECs ligados ao fundo dos poços usando fórceps.
   1. Descarte todas as mídias da placa atual usando uma pipeta de 1 mL ou sucção a vácuo. Tenha cuidado para não aplicar o vácuo diretamente no andaime.
   2. Coloque um andaime por poço, de preferência no centro do poço para evitar correr líquido em direção às paredes devido aos efeitos de tensão superficial. Seque a área ao redor do andaime com vácuo leve, mas evite a secagem completa do andaime.
3. Prepare uma suspensão DPSC em solução pré-gel de fibrina.
   1. Diluir as soluções de trombina e fibrinogênio com PBS até obter uma concentração final de 5 U/mL e 15 mg/mL, respectivamente.
   2. Prepare uma suspensão de 8 x 10⁶ DPSC/mL na diluição de trombina de 5 U/mL e distribua em eppendorfs individuais 12,5 μL da referida suspensão por andaime a ser semeada.
   3. Defina uma pipeta de 5-50 μL (ou similar) a 12,5 μL e encha-a com a solução fibrinogênio de 15 mg/mL.
   4. Sem remover a ponta, coloque a pipeta em 25 μL. O material na ponta deve subir e deixar um volume vazio para a abertura da ponta.
   5. Pressione lentamente o botão do êmbolo até que o líquido atinja a abertura da ponta, mas não vaze. Segure o êmbolo nesta posição e coloque a ponta em um dos tubos de microcentrifuuge contendo as células em suspensão de trombina, certificando-se de que a ponta esteja em contato com o líquido.
      ATENÇÃO: A ligação cruzada de fibrinas começará imediatamente após a interligação e fibrinogênio entrarem em contato. O passo seguinte deve ser feito rapidamente.
   6. Solte suavemente o botão do êmbolo e puxe a suspensão da célula para a ponta. Misture bem os dois materiais, evitando a formação de bolhas.
4. Dispense rapidamente os materiais mistos em cima de um andaime endotelializado. Repita as etapas anteriores para cada andaime, certificando-se de sempre alterar dicas entre os usos para evitar a formação inesperada de gel fibrin dentro da ponta.
5. Substitua a tampa da placa e incuba os andaimes a 37 °C, 5% de CO₂ e 100% de umidade por 30 minutos.
6. Após a incubação, encha cada poço com 1 mL de 1:1 DPSC e meio CE.
   1. Cultura por 1 semana, mudando de meio a cada dois dias.
   2. Durante a cultura, remova o meio do poço e a imagem dos construtos usando um microscópio confocal em diferentes pontos de tempo para estudar o desenvolvimento vascular ou qualquer outro parâmetro de interesse.
      NOTA: Esta etapa só pode ser realizada se o experimento for realizado usando CEs rotulados. Consulte o Passo 6 - NOTA para maiores esclarecimentos.

5. Coloração imunofluorescente para marcadores vasculares característicos

NOTA: As seguintes etapas podem ser realizadas nos mesmos poços onde as construções foram cultivadas. É fundamental sempre garantir que as soluções cubram completamente os andaimes. Além disso, quando possível, recomenda-se a realização das etapas em um agitador orbital, embora não obrigatória.

1. No dia 7, descarte a mídia dos poços e enxágue os andaimes adicionando PBS aos poços e removendo-a usando vácuo.
2. Corrija os andaimes adicionando 4% de paraformaldeído por 20 minutos. Lave em PBS 3 vezes, 5 minutos por lavagem.
3. Permeabilize as células fixas utilizando 0,3% Triton-X em PBS (v/v) por 15 minutos. Lave em PBS 3 vezes, 5 minutos por lavagem.
4. Prepare uma albumina de soro bovino de 5% (BSA) na solução de bloqueio PBS (w/v) e cubra os andaimes. Deixe em temperatura ambiente por 1 hora.
   NOTA: Todos os valores necessários para a solução dependerão do número de andaimes a serem manchados. Prepare as soluções conforme necessário para manter as concentrações indicadas.
5. Prepare e aplique a solução de coloração de anticorpos primários.
   1. Diluir o fator anti-von Willebrand (vWF) anticorpo 1:150 e anticorpo anti-SMA do rato 1:50 em solução de bloqueio fresco.
      NOTA: Outros marcadores de células endoteliais, como CD31 ou VE-Cadherin podem ser usados.
   2. Cubra os andaimes com a solução de anticorpos primários e mantenha-se a 4 °C durante a noite. Lave em PBS três vezes, 5 minutos por lavagem.
6. Prepare e aplique a solução de coloração de anticorpos secundários.
   1. Anticorpo anti-rato cy3 de cabra diluído 1:150 e anti-coelho de cabra Alexa-Fluor 488 1:400 na PBS.
   2. Cubra os andaimes com a solução de anticorpos secundários e incubar por um mínimo de 3 horas em temperatura ambiente, ou a 4 °C durante a noite. Lave 3 vezes em PBS, 5 minutos por lavagem. Mantenha o andaime manchado em 0,3% pfa em PBS (v/v) por até um mês.

6. Análise de imagem confocal do andaime e desenvolvimento de vasos

NOTA: As seguintes etapas podem ser realizadas nos andaimes fixos e manchados no ponto de tempo final escolhido ou, se as células fluorescentes foram utilizadas, durante o período de cultura celular sem a necessidade de encerrar o experimento. Para este último, recomenda-se definir pontos de tempo específicos; este trabalho mostra o dia 0 (antes da semeadura dos SCs), e os dias 1, 3, 5 e 7 após a semeadura dos SCs(Figura 3A).

1. Imagem dos andaimes usando um microscópio confocal com uma lente 5X e um zoom de 0,5 e toda a gama z do andaime. Isso permitirá capturar 9 compartimentos separados para as geometrias quadradas e circulares, ou 8 compartimentos completos para a geometria hexagonal. Imagem do sinal fluorescente e da luz transmitida, para obter tanto a estrutura da rede do vaso quanto a geometria do compartimento(Figura 3A).
2. Utilizando ImageJ (ou qualquer outro software de processamento de imagem), corte cada compartimento individual; para esse processo, apenas os marcadores de redes vasculares são relevantes. Remova qualquer vaso não localizado dentro da área do compartimento. Crie uma projeção de intensidade máxima e salve cada compartimento cropped individual como uma imagem TIFF.
   1. No ImageJ, pressione o arquivo > abrir e selecione a imagem TIFF desejada contendo vários compartimentos. A imagem deve ter pelo menos dois canais, a rede de vasos fluorescentes e a imagem de luz transmitida.
   2. Na barra de ferramentas, selecione a ferramenta de seleção do Polígono. Selecione o canal de luz transmitido. Clique em um dos cantos do compartimento hexagonal, na interface entre a área do compartimento e a parede do andaime, isso iniciará a definição da máscara. Continue clicando nos cantos seguintes em uma ordem sequencial até que o canto inicial seja selecionado, fechando a máscara.
      NOTA: Esta explicação se aplica a um compartimento hexagonal. Quando o compartimento estiver ao quadrado ou circular, use as ferramentas Retângulo ou Oval, respectivamente, para criar uma máscara apropriada. Independentemente da forma, encaixe sempre a máscara para seguir a parede interna do andaime.
   3. Clique em Analisar > Ferramentas > gerenciador de ROI. No gerenciador de ROI (ROI, região de interesse), clique no botão Adicionar para salvar a máscara criada. A nova máscara aparecerá na lista do lado esquerdo. Esta etapa permite que a análise seja consistente entre diferentes imagens.
      NOTA: No gerenciador de ROI, é possível salvar um arquivo com todas as máscaras criadas clicando em Mais > Salvar. Na janela de seleção Salvar, escolha um nome e localização e salve o arquivo .roi. Para recuperar a máscara, no gerenciador de ROI, clique em Mais > Abra e escolha o arquivo .roi desejado.
   4. Selecione a imagem da rede do vaso fluorescente e clique em Editar > Limpar do lado de fora. Apenas a imagem contida na máscara permanecerá, enquanto o resto será eliminado.
   5. Com a imagem de rede liberada aberta, clique em Imagem > Duplicar. Na janela pop-up Duplicate, escreva o nome da imagem. Se o hyperstack Duplicado for selecionado, desmarque-o e clique em OK. Uma nova imagem contendo apenas as redes de vasos fluorescentes cortadas será criada.
   6. Salve a imagem cortada clicando em Arquivo > Salvar como > Tiff. Escolha o nome e o diretório e clique em OK.
3. Analise o desenvolvimento vascular nas imagens cortadas.
   1. Baixe e instale o software gratuito analítico AngioTool, que fornece ferramentas quantitativas para quantificar uma variedade de parâmetros vasculares. O software pode ser obtido a partir do seguinte endereço https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
   2. Defina o valor de escala das imagens para obter resultados em unidades milimétricas e carregue uma imagem.
      1. Clique na guia Configuração e preencha a Distância em Pixels e Distância em mm com valores representativos das imagens tiradas. Utilizando os parâmetros de imagem mencionados acima, os valores a serem preenchidos são de 400 pixels por 1 mm.
      2. Pressione o botão Abrir imagem e navegue pela imagem de interesse.
   3. Escolha os parâmetros de análise para quantificar o desenvolvimento da embarcação na guia Análise.
      1. Sob o campo de diâmetro e intensidade do vaso, desmarque qualquer marcador presente do seletor de faixa superior e ative o marcador representando o número 3.
      2. Sob o diâmetro do vaso e campo de intensidade, no seletor de faixa inferior, mova o marcador de faixa inferior para 60, e deixe o fabricante de ranger alto em 255.
      3. Ative a caixa de partículas pequenas Remover e definir o marcador para 100.
      4. No campo Salvar preferências,selecione o nome e a localização do arquivo da folha de propagação no qual os resultados serão salvos e pressione o botão de análise Executar. Se a caixa de imagem de resultado Salvar for selecionada, a Angiotool irá gerar e salvar uma nova imagem jpeg mostrando os parâmetros quantificados da rede do navio.
         NOTA: Para cada análise realizada sem alterar o nome do arquivo da folha de difusão, uma nova linha será adicionada na parte inferior do arquivo, com os resultados recém-adquiridos.
4. Organize os dados e execute uma análise estatística.
   1. Para todas as imagens processadas, escolha o parâmetro de interesse da folha de difusão (por exemplo, comprimento total do vaso e área do vaso)e insira-as em um software de análise estatística para estudar adequadamente os resultados obtidos(Figura 3C).

7. Imagem de lapso de tempo para o rastreamento de detecção e migração de origem de brotos

1. Alternativamente, para cultivar os andaimes na incubadora, conforme descrito na etapa 4.6, defina uma câmara de cultura de microscópio confocal para 37 °C, 5% de CO₂ e 100% de umidade.
   1. Coloque a placa contendo os andaimes totalmente semeados na câmara de microscópio confocal e defina os parâmetros de imagem para os valores desejados.
   2. Defina o intervalo de tomada da imagem para 30 minutos e o tempo total de imagem de 72 horas. Isso permitirá executar o lapso de tempo completamente sem a necessidade de uma alteração média.
      ATENÇÃO: No caso de uma imagem de lapso de tempo mais longa ser desejada, uma calibração cuidadosa da posição deve ser realizada para poder recuperar o local de imagem original, uma vez que as alterações médias requerem a remoção da placa da incubadora confocal e para a capa biológica estéril.
      NOTA: O desprendimento dos CES das paredes dos andaimes e da formação de estruturas tubulares começará na primeira hora após a semeadura dos SCs (etapa 4) e pode levar até 50 horas para ser concluído. Após a formação inicial do tubo, novos brotos começarão a migrar para o compartimento dos vasos circundantes. A brotação e a posterior remodelação da rede continuarão durante todo o experimento aproximadamente até o dia 10, quando as redes de embarcações se tornarem estáveis²². Use essas informações para escolher o ponto de partida do lapso de tempo e o passo de tempo em conformidade.
2. Salve o arquivo completo do filme de lapso de tempo como uma sequência TIFF.
3. Abra ImageJ e clique em Arquivo > Importar > sequência de imagem e selecione seus arquivos. Isso abrirá sua sequência de TIFF como um filme.
4. Abra o plugin de rastreamento manual clicando em Plugins > rastreamento manual. Isso abrirá a janela de rastreamento.
5. Observe o filme e selecione a nave a ser rastreada. Preste atenção à sua origem e migração.
6. Ative a caixa de parâmetros Show e insira os 30 minutos para intervalo de tempo. A calibração x/y dependerá da quantidade de pixels selecionada durante a imagem.
7. Siga manualmente os vasos brotantes do contorno do andaime.
   1. Pressione o botão Adicionar faixa. No primeiro quadro do filme, pressione a localização da nave a ser rastreada. Depois disso, o filme mudará automaticamente para o próximo quadro.
   2. Clique na imagem do segundo quadro onde a nave está localizada. Novamente, o filme mudará automaticamente para o próximo quadro.
   3. Prossiga com a mesma nave até que o rastreamento completo da migração tenha sido concluído.
   4. Na janela Rastreamento, clique na Sobreposição De Pontos & Linhas para imprimir um caminho visual da migração do navio no filme. Isso abrirá uma cópia do filme com um ponto representando a posição atual do rastreador, e uma linha mostrando o caminho anterior.
   5. Clique no botão Acompanhar a extremidade para finalizar a gravação do movimento atual da embarcação.
   6. Clique no botão Adicionar faixa novamente para começar de novo com um novo vaso. Ao fazer isso, os marcadores de linha e ponto mudarão automaticamente sua cor para o novo vaso. Repita até que todas as embarcações desejadas sejam rastreadas.
      NOTA: A localização x/y, a velocidade do vaso e a distância deslocada podem ser recuperadas a partir dos resultadosda janela pop-up . Cada nave será identificada pelo número da pista na coluna mais à esquerda. Esses dados podem ser copiados e colados em uma planilha para realizar análises mais aprofundadas.

Resultados

O protocolo apresentado, utilizando técnicas de estereotipografia, permite a fabricação de andaimes tesvendados feitos de fotoresist SU-8. Andaimes com geometrias de compartimento distintas (quadrados, hexágonos e círculos) e características altamente precisas e repetíveis foram obtidas(Figura 1).

Discussão

A necessidade de uma vasculatura rica dentro de tecidos projetados é fundamental para a sobrevivência da construção e função adequada¹. Embora a engenharia do sistema vascular tenha sido o foco de uma vasta quantidade de pesquisas, muito resta investigar e entender²⁴. Em particular, ao recriar um tecido específico, a microvasculatura deve se comportar e organizar-se nesse ponto¹². A abordagem mais comum para a geração de microvessels é a co-semeadura...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Angiotool freeware	NIH-CCR		Download grátis em https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home Soro
albumina bovina Probumin	Millipore	82-045-1
Células-tronco da polpa dentária	Lonza	PT-5025
ECM media + kit de bala	Sciencell	# 1001
Etanol 96%	Gadot-Group	64-17-5
Selante de fibrina Evicel	Johnson& Johnson	EVB05IL	Fornece soluções de trombina e fibrinogênio (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
Anticorpo anti-camundongo Cy3 de cabra	Jackson	115-166-072
Cabra anti-coelho Alexa-Fluor 488	Thermo- Fisher Scientific	A11034
Células microvasculares adiposas humanas	Sciencell	#7200
Humano fibronectina	Sigma	F0895-5MG	Concentração de estoque: 1 mg/mL
ImageJ	NIH		Download grátis em https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Álcool isopropílico	Gadot-Group	67-63-0
Reagente de decolagem	Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	Nome comercial Omnicoat
Low-glucose DMEM	Biological Industries	01-050-1A
Camundongo anti-SMA anticorpo	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
Solução de paraformaldeído 4% em PBS	ChemCruz	SC-281692
Solução de penicilina-estreptomicina-nistatina	Indústrias biológicas	03-032-1B
Solução salina tamponada com fospato (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
Bolacha de silício anticorpo anti-vWF de coelho	Abcam	ab9378
Silicon	Valley Microelectronics (SVM)		Wafers 4", tipo N-1-10, 500-550 mícrons de espessura
SU-8 2050 fotorresistente	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 desenvolvedor	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	Rolamento 57836