Summary
Denne artikel har til formål at demonstrere brugen af parthenogenetiske haploide embryonale stamceller som erstatning for sædceller til opførelse af halvklonede embryoner.
Abstract
I organismer med seksuel reproduktion er kimceller kilden til totipotente celler, der udvikler sig til nye individer. Hos mus skaber befrugtning af en oocyt af en spermatozoon en totipotent zygote. For nylig har flere publikationer rapporteret, at haploide embryonale stamceller (haESC'er) kan erstatte spiliske genomer og bidrage til embryoner, der udvikler sig til mus. Her præsenterer vi en protokol til anvendelse af parthenogenetiske haESC'er som erstatning for sædceller til at konstruere embryoner ved intracytoplasmisk injektion i oocytter. Denne protokol består af trin til forberedelse af haESC'er som sæderstatning, til injektion af haESC-kromosomer i oocytter og til kultur af halvklonede embryoner. Embryonerne kan give frugtbare halvklonede mus efter embryooverførsel. Brug af haESC'er som sæderstatning letter genomredigering i kimen, undersøgelser af embryonal udvikling og undersøgelse af genomisk prægning.
Introduction
Hos pattedyr er gameter de eneste celler, der overfører genetisk information til den næste generation. Fusion af en oocyt og en spermatozoon danner en diploid zygote, der udvikler sig til et voksent dyr. Mutationer i spiltiske genomer arves derved af afkommet og driver genetisk variation i art1. Indførelse af mutationer i kønsceller er blevet anvendt til at producere genetisk modificerede dyr til forskellige biologiske undersøgelser, herunder karakterisering af genfunktion og sygdomsmodellering. Både oocytter og spermatozoer er uhelbredeligt differentierede og højt specialiserede celler, der er ophørt med spredning. Derfor er direkte ændring af gameter teknisk vanskelig, og der er udviklet specialiserede tilgange. Genetiske modifikationer kan indføres i musekimlinjen ved injektion af genetisk modificerede ESC'er i blastocyster, hvor de integreres i det udviklende embryo og koloniserer kimen. Derudover er genetisk modifikation af zygoter ved hjælp af genomredigeringsmetoder, herunder CRISPR/Cas9-systemet, blevet bredt vedtaget2.
For nylig er der rapporteret om en fremragende tilgang, der anvender haESC'er som erstatning for et gametisk genom3,4,5,6,7,8. HaESC'er er stamcellelinjer , der er afledt af den indre cellemasse af parthenogenetiske eller androgenetiske haploid blastocysts og har et enkelt sæt kromosomer4,7,9,10. Det er blevet påvist, at både partenogenetiske og androgenetiske haESC'er kan bidrage til genomet af halvklonede mus efter intracytoplasmisk injektion i oocytter. I modsætning til andre tilgange kan hæmicernes genomer ændres direkte i kulturen på grund af deres selvfornyelseskapacitet. Indførelse af genetiske modifikationer i kimen ved at erstatte sædceller med haESC'er er en vigtig metode til biologiske undersøgelser. Det giver mulighed for separat at dyrke og manipulere moder- eller fadergenomet, som er afledt af henholdsvis partenogenetiske eller androgenetiske haESC'er. HaESC'er kan derefter bruges som spilisk genomerstatning, hvilket er særligt fordelagtigt for undersøgelser af genomisk prægning, allelspecifikt udtryk og forældrespecifikke processer.
Hos mus kræves både moderlig og faderlig genomisk information til normal embryoudvikling11. Derfor kunne der ikke opnås heltidsunger, når delhenogenetiske haESC'er af vild type (phaESCs) blev injiceret for at erstatte sædgenomet5,8. For at overvinde udviklingsblokken skal genomisk prægning af det ensogentiske haESC's modergenom korrigeres til en faderlig konfiguration. Dette kan opnås ved manipulation af de differentierede methylerede regioner (DMR). Til dato er målrettede sletninger af H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR og Rasgrf1-DMR blevet undersøgt for at undertrykke maternally udtrykte gener i phaESCs3,5,8,12. Disse undersøgelser viste, at sletninger af både H19-DMR og IG-DMRer tilstrækkelige til at omdanne en moderlig til en faderlig aftryk konfiguration, der kan erstatte sædkromosomer. Intracytoplasmisk injektion af faSC'er, der transporterer de to DMR-sletninger i oocytter, gav halvklonede hvalpe med en frekvens på mellem 5,1% og 15,5% af overførte 2-cellede embryoner.
Denne protokol er baseret på anvendelsen af phaESCs med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR, som vi betegner dobbelt-knockout phaESCs (DKO-phaESCs). Vi giver detaljerede instruktioner til ændring af genomisk prægning i phaESC'er for at etablere DKO-phaESC-linjer, for injektion af DKO-phaESCs i oocytter som erstatning for et sædgenom, for kultur af halvklonede embryoner til blastocyster og for at opnå halvklonede mus. Denne protokol er en reference for forskere, der kræver præcis og direkte manipulation af det faderlige genom og generering af halvklonede embryoner og mus.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført under licensen ZH152/17 i overensstemmelse med standarder og forskrifter fra Cantonal Ethics Commission Zürich og EPIC-dyrefaciliteten ved Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zürich.
BEMÆRK: Denne protokol starter med sletning af H19- og IG-DMR'er i phaESCs. Yderligere oplysninger om, hvordan du opretter phaESC-linjer, finder du i de offentliggjorte rapporter10,13. Figur 1A inser en oversigt over og tidsramme for denne protokol (trin 1-14). medier, løsninger og buffere er angivet i tabel 1. Proceduren for etablering af DKO-phaESC-linjer (trin 1-6) er vist i figur 1B, og strategien for konstruktion af halvklonede embryoner (trin 7-14) er beskrevet i figur 1C.
1. Transfekt af plasmider til sletning af H19-DMR og IG-DMR i phaESCs
- Forbered CRISPR/Cas9 plasmider til co-expression af Cas9-kerner, og guide RNA'er til at målrette sletninger af H19-DMR og IG-DMR. Ligate fire par guide RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R anført i tabel 2) i pX330 plasmider.
BEMÆRK: Se den offentliggjorte protokol om den detaljerede procedure for udarbejdelse af disse 4 CRISPR/Cas9 plasmids14. Alternativt er plasmider, der er tilgængelige for generelle musestammer, også tilgængelige via et lager (Tabel over materialer). - Overfladen af en brønd af en 6-brønds plade belægges med 1 ml gelatineopløsning på 0,2% ved inkubation ved 37 °C i 10 min.
- Plade 2 × 105 wildtype phaESCs på gelatine-belagt godt i haESC medium uden antibiotika, og inkubere pladen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære i 1 dag.
BEMÆRK: Antibiotika udelades fra mediet for at øge effektiviteten af den efterfølgende lipofection. Vi brugte wildtype phaESCs ved passage 10. Vi anbefaler at bruge tidlige passage phaESCs, men en række passage nummer er blevet anvendt med succes8. Sammenhængen mellem passage nummer og effektiviteten af at opnå semi-klonede embryoner og mus er i øjeblikket ikke kendt. - Transfektfasede phaESC'er i brønden på en 6-brønds plade (fra trin 1.3) med 6 plasmider samtidig ved hjælp af lipofection reagens: 50 ng piggyBac plasmid med cag-egfp transgene, 50 ng piggyBac transponerer plasmid og 600 ng af hver af de 4 CRISPR/Cas9 plasmider (fra trin 1.1). Der henvises til fabrikantens protokol om den detaljerede procedure for oversættelsen.
BEMÆRK: To piggyBac plasmider bruges til at integrere en transposon for allestedsnærværende udtryk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) i genomet af phaESCs. Hvis GFP-mærkning af cellerne ikke er påkrævet, kan disse to plasmider erstattes af en CRISPR/Cas9 plasmid for forbigående ekspression af fluorescensproteiner (f.eks. pX458 plasmid) i stedet for en af pX330 plasmiderne. Forbigående EGFP-udtryk kan derefter bruges til sortering af transfekterede celler. - To dage efter transfekten aspireres mediet og tilsættes 800 μL trypsin.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 5 min. Derefter tilsættes 2 mL vaskebuffer for at slukke trypsin og pipette flere gange for at opnå en enkelt celleaffjedring.
- Overfør celleaffjedringen til et 15 mL rør.
- Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min, og fjern supernatanten.
- Cellepellet blev genbrugt i 400 μL haESC-vedligeholdelsesbuffer suppleret med 15 μg/mL Hoechst 33342.
BEMÆRK: For at reducere den potentielle toksicitet af Hoechst 33342 er der anvendt 1 μg/mL Hoechst 33342 og 50 μM verapamil i stedet for 15 μg/mL Hoechst 3334215. - Celleaffjedringen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 15 min. Efter inkubationen overføres celleaffjedringen til et 5 mL rør gennem en cellestængelhætte, og røret holdes ved 4 °C, indtil det er klar til brug i næste trin (afsnit 2).
2. Enkeltcellebelægning af transfected phaESCs ved hjælp af et flowcytometer
- En dag før sortering af de transfected phaESCs, plade bestrålet mus embryonale fibroblaster (MEF) på gelatine-belagt 96-godt plader med en densitet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF medium. Typisk er 6 plader parate til at etablere en phaESC-linje med målrettede sletninger. Pladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
BEMÆRK: Bestrålede MEF'er er kommercielt tilgængelige. Vi bruger MEF'er afledt af E12.5 embryoner af DR4 mus. Selvom haESC'er kan vokse på gelatinebelagte plader uden MEF'er, anbefaler vi MEF'er for at øge levedygtigheden af sorterede enkelt haESC'er. - På sorteringsdagen aspireres MEF-mediet fra 96-brøndspladerne, og der tilsættes 120 μL frisk haESC-medium pr. brønd. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Opret en cellesortering med en dyse på 100 μm i overensstemmelse med producentens anvisninger. En 355 nm UV-laser og en 488 nm blå laser anvendes til excitation af henholdsvis Hoechst 33342 og EGFP fluorescens.
BEMÆRK: Alternativt kan Hoechst 33342 detekteres ved excitation med 405 nm. - Sorter de transfected phaESCs i 5 mL-røret (fra trin 1.10) ved hjælp af en port til indsamling af haploide celler i G1/S-fasen, der viser EGFP-udtryk. Sæt en enkelt celle i hver brønd af 96-brøndspladerne fra trin 2.2.
BEMÆRK: Påvisning af Hoechst 33342-farvning skelner generelt mellem 3 toppe af celler med et 1n-, 2n- og 4n DNA-indhold, som svarer til haploide celler i G1-fase, en blanding af haploide celler i G2/M-fase og diploide celler i G1-fase og diploideceller i henholdsvis G2/M-fasen. Haploide celler i G1/S-fasen identificeres som toppen med lavere intensitet af Hoechst 33342 fluorescens. Et repræsentativt resultat og en sorteringsport er vist i figur 2A. - Efter plating inkuberes 96-brøndspladerne ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
3. Subkloning af transfected phaESCs
- Tre dage efter enkeltcellebelægning kan kolonier observeres i flere brønde af 96-brøndspladerne under et mikroskop. Marker brøndene, hvor kun enkelte kolonier vokser.
BEMÆRK: Det er vores erfaring, enkelt kolonier blev observeret i 20%-40% af brøndene i 96-brønd plader. - På dag 4 efter enkeltcellebelægning skal halvdelen af mediet erstattes med nyt haESC-medium i brøndene med enkelte kolonier.
- En dag før passaging (på dag 4 eller 5 efter enkelt cellebelægning), bestrålede plade MEF'er på gelatinebelagte 96-brøndsplader med en densitet på 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Efter 5 eller 6 dages enkeltcellebelægning skal du vælge brønde af de 96-brøndsplader, der indeholder enkelte kolonier med en diameter på over 150 μm.
BEMÆRK: Der vælges fortrinsvis ca. 100 brønde til at etablere en phaESC-linje med de målrettede DMR-sletninger. - Aspirere mediet i de valgte brønde og tilsæt 30 μL trypsin. 96-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 5 min. Derefter tilsættes 30 μL vaskebuffer til hver brønd for at slukke trypsinen.
- Tilsæt 140 μL haESC medium i hver brønd, og pipette flere gange for at opnå enkelte celler.
- Indsug MEF-mediet fra brøndene på de 96-brøndsplader, der er forberedt i trin 3.3.
- Overfør phaESC'erne fra hver brønd fra trin 3.6 til en frisk brønd af den nye 96-brønds plade fra trin 3.7.
- 96-brøndspladerne, der indeholder phaESC-underkluder ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære, inkuberes.
- Den næste dag aspireres hele mediet fra hver brønd, og der tilsættes 120 μL nyt haESC-medium. Pladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
- En dag før cellerne bliver sammenflydende for passaging, plade bestrålede MEF'er på gelatine-belagt 24-brønd plader med en densitet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF medium. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Når phaESC'er er blevet sammenflydende til passaging, aspirere mediet og tilsæt 30 μL trypsin. 96-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C i 5 min.
- Tilsæt 90 μL vaskebuffer i hver brønd for at slukke trypsinen. Pipette flere gange for at få enkelte celler.
- Aspirat MEF-mediet fra brøndene på 24-brøndspladerne fra trin 3.11, og tilsæt 600 μL frisk haESC-medium.
- 60 μL af suspensionen af phaESC-delkloner overføres fra hver brønd i trin 3.13 til en ny brønd af 24-brøndspladerne fra trin 3.14. Hold den resterende suspension af hver phaESC-underkling til DNA-ekstraktion og genotyping i trin 4.
- 24-brøndspladerne inkuberes med phaESC-underkluderne ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
- En dag før cellekulturerne når tætheden for passaging, plade bestrålede MEF'er på gelatine-belagt 6-brønd plader med en densitet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF medium. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Når phaESCs bliver sammenflydende nok til passaging, aspirere mediet og tilsæt 250 μL trypsin. 24-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C i 5 min.
BEMÆRK: Efter genotyping i trin 4.9 skal kun phaESC-linjer med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR passeres. - Der tilsættes 750 μL vaskebuffer i hver brønd for at slukke trypsinen. Pipette flere gange for at opnå en enkelt celle suspension. Overfør celleaffjedringen til et 15 mL rør.
- Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min, fjern supernatanten, og genbrug cellepillen i 2 mL haESC-medium.
- Indsug MEF-mediet fra brøndene på 6-brøndspladerne fra trin 3.17. Overfør phaESC-affjedringen fra hvert rør fra trin 3.20 til en ny brønd. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Udvid celleklonene ved at gentage trin 3.17 til 3.21 og øge pladestørrelsen og mængderne af trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Forbered en T25 kolbe for hver subklonet phaESC-linje af MEF'er til trin 5.
BEMÆRK: Vi anbefaler, at der fryses en aliquot af hver subklonet phaESC-linje i 300 μL frysemedium, og at der opbevares kryostock i flydende nitrogenopbevaring, før du fortsætter til trin 5.
4. Første genotyping af subklonede phaESC-linjer med MEF'er
- For at udtrække genomisk DNA fra den resterende celleaffjedring fra trin 3.15 tilsættes 200 μL lysis buffer til hver brønd af 96-brøndspladerne. Overfør celleaffjedringen til et 1,5 mL rør. Skyl hver brønd med yderligere 200 μL lysis buffer for at genvinde alle resterende celler og opsamles i samme 1,5 mL rør.
- 1,5 mL røret inkuberes ved 55 °C i 3 timer med blanding.
- Efter inkubation tilsættes 460 μL isopropanol til hvert 1,5 mL rør og blandes forsigtigt, indtil et DNA-bundfald bliver synligt.
- Centrifuge rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Dna-pillerne vaskes med 200 μL 70% ethanol.
- Centrifuge rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Rørene tørres i luften i 10 minutter og genbruges derefter DNA'et i 20 μL vand.
- Udfør polymerase kædereaktion (PCR) ved hjælp af termotabel DNA polymerase efter producentens protokol.
BEMÆRK: Primerparrene til PCR er anført i tabel 2 og bruges som følger: H19-DMR-P1 og P3 (407 basispoint for slettet H19-DMR); H19-DMR-P2 og P3 (623 basispoint for vildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 og P3 (319 basispoint for slettet IG-DMR); IG-DMR-P2 og P3 (492 bp for wildtype IG-DMR). Temperaturprofilen for PCR for alle primerpar er som følger: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min. 72 °C. Længden af forstærkede DNA-fragmenter for H19- DMR-og IG-DMR-sletningerneviser en vis variation på grund af ikke-homolog endeslutning forbundet med CRISPR/Cas9-medieret redigering. PhaESCs blev dyrket med MEF'er, som indeholder wildtype H19-DMR og IG-DMR DNA. Derfor er primerpar af H19-DMR-P2/P3 og IG-DMR-P2/P3, som forstærker dna-fragmenter af vild naturtype, ikke informative. Disse primerpar er dog inkluderet som kontroller og bør give et bånd i alle reaktioner. - Analyser PCR-fragmenterne ved agarosegelelektroforese. Der henvises til den offentliggjorte protokol om den detaljerede procedure for elektroforese16.
- Identificer cellelinjer med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR. Et repræsentativt billede af elektroforese er vist i figur 2B.
BEMÆRK: I vores tilfælde blev otte cellelinjer med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR identificeret blandt 135 subklonede phaESC-linjer.
5. Haploidcellerensning af subklonede phaESC-linjer
- Når de subklonede phaESC-kulturer i T25-kolberne fra trin 3.22 bliver tætte nok til passaging, aspireres mediet og tilsættes 1,5 mL trypsin. Kolben inkuberes ved 37 °C i 5 min. Derefter tilsættes 4,5 mL vaskebuffer og pipette flere gange for at opnå en enkeltcellet suspension.
- Hver celleaffjedring overføres til et 15 mL rør, og røret centrifuges ved 160 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellepillerne genbruges i 400 μL haESC vedligeholdelsesbuffer suppleret med 15 μg/mL Hoechst 33342.
- Celleaffjedringerne inkuberes ved 37 °C i 15 min. Efter inkubationen overføres celleaffjedringerne til et 5 mL rør gennem en celle sihætte. Cellens sihætte skylles med yderligere 400 μL haESC-vedligeholdelsesbuffer, og de resterende celler opsamles i samme 5 mL rør. Røret holdes ved 4 °C, indtil det er klar til sortering.
- Opsæt et flowcytometer med en 100 μm dyse i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: Hoechst 33342 kan påvises ved excitation ved 405 nm. Her bruges en 355 nm UV-laser til påvisning af Hoechst 33342. - Opsæt celleaffjedringen (fra trin 5.3) og et nyt 15 mL rør, der indeholder 2 mL haESC-vedligeholdelsesbuffer til opsamling af sorterede celler i flowcytometeret.
- Start analysen, og opsæt sorteringsporten til indsamling af haploide celler i G1/S-fasen. Se histogrammet i figur 2A for at få oplysninger om G1/S-fasens fase ESC-population.
BEMÆRK: Nogle subklonede phaESC-linjer må ikke indeholde haploide celler på grund af fuldstændig diploidisering eller fejlagtig belægning af diploidceller i trin 2. Hvis der ikke observeres haploide celler i G1/S-fasen, skal du gå videre til en anden prøve uden sortering. I vores tilfælde indeholdt 5 cellelinjer haploide celler, og 3 cellelinjer indeholdt kun diploidceller ud af 8 subklonede phaESC-linjer. - Efter cellesortering tilsættes 5 mL vaskebuffer langs væggen på 15 mL opsamlingsrøret. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min. Fjern supernatanten.
- Vælg en plade af passende størrelse til dyrkning afhængigt af antallet af sorterede celler. Brug en enkelt brønd med en 96-brønds plade, en 24-brønds plade og en 12-brønds plade til at kultur 1.000-40.000 celler, henholdsvis 40.000-200.000 celler og 200.000-400.000 celler. Cellepellet blev genbrugt i henholdsvis 120 μL, 600 μL og 1,2 mL haESC-medium.
BEMÆRK: Plade cellerne ved høj densitet, fordi lav sammenløb kan forårsage celledød af cellerne efter sortering. Fra dette tidspunkt dyrkes phaESC'er på gelatinebelagte brønde uden MEF'er for at lette genotyping i trin 6 og den efterfølgende ansøgning om intracytoplasmisk injektion fra trin 9. - Efter at celleaffjedringen er blevet overført til en gelatinebelagt brønd af passende størrelse, inkuberes pladen ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
- Fortsæt med at udvide phaESC-kulturerne ved at gentage trin 3.18 til 3.21 med stigende pladestørrelser og stigende mængder trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Cellerne er dyrket på gelatine-belagt brønde uden MEFs.
- For hver subklonet phaESC-linje skal du forberede en kultur i en brønd af en 24-brønds plade og en brønd af en 6-brønds plade til henholdsvis trin 6 og 9.
BEMÆRK: Nogle celler i hver subklonet phaESC-linje bør fryses i 300 μL frysemedium som kryostock i en flydende nitrogentank, inden de går videre til trin 9.
6. Anden genotyping af subklonede phaESC-linjer uden MEF'er
BEMÆRK: Der udføres en anden runde genotyping for at bekræfte, at de subklonede phaESC-linjer har sletninger af både H19- og IG-DMR'er, og at vilde alleler er fraværende efter fjernelsen af MEF'er.
- Bekræft under mikroskopet, at kulturerne i brønde af 24-brøndspladerne fra trin 5.11 er fri for MEF'er.
BEMÆRK: Hvis MEF'er observeres, er det nødvendigt at fortsætte med at passere kulturerne, indtil MEF'er er forsvundet for at undgå at forurene PCR med wildtype DNA fra MEF'er. - Aspirere mediet fra sammenflydende kulturer og tilsæt 400 μL lysis buffer per brønd af 24-brønds plade. Efter pipettering flere gange overføres celleaffjedringen til et 1,5 mL rør.
- 1,5 mL røret inkuberes ved 55 °C i 3 timer med blanding.
- Efter inkubation tilsættes 400 μL isopropanol til 1,5 mL-røret og blandes forsigtigt, indtil et DNA-bundfald bliver synligt.
- Centrifuge røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Dna-pillerne vaskes med 200 μL 70% ethanol.
- Centrifuge røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Røret tørres i luften i 10 minutter og genbruges derefter DNA'et i 50 μL vand.
- Udfør genotyping PCR efter trin 4.7 og gel elektroforese i trin 4.8 for at identificere cellelinjer, som besidder sletninger af både H19- og IG-DMR'er og er fri for vilde alleler.
BEMÆRK: Et billede af en typisk anden genotypinganalyse er vist i figur 2B som reference. I vores tilfælde var alle 5 cellelinjer, der blev valgt efter haploid cellerensning (trin 5), fri for wildtype-alleler og havde kun sletnings allelerne i H19- og IG-DMR' er. - Brug de subklonede phaESC-linjer, der er valgt efter denne anden genotyping, som DKO-phaESC-linjer.
7. Superovulation af mus
- Til produktion af MII oocytter skal superovulation startes ved intraperitoneal injektion af 5 IE af gravid mare serum gonadotropin (PMSG) opløsning i hver B6D2F1 hunmus (4-5 uger gammel) 63-65 timer før oocytsamling.
BEMÆRK: B6D2F1-musestammen anbefales til denne protokol, fordi B6D2F1 oocytter tåler intracytoplasmisk injektion godt og udviser et højt udviklingspotentiale efter proceduren17. - 48 timer efter PMSG-injektion injicerer intraperitoneally 5 IE human chorionic gonadotropinopløsning i hver mus.
8. Oocyte kollektion
- Der fremstilles en 4-brønds plade indeholdende 700 μL hyaluronidase medium i en brønd og 700 μL M2 medium i de resterende 3 brønde. Derudover tilberedes en 6 cm skål med 7 mL M2 medium og en center-well skål med 900 μL M16 medium. Forvarm tallerkenen og retterne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- På dagen for den intracytoplasmiske injektion aflives de superovulated hunner (fra trin 7.2) ved enten cervikal dislokation eller CO2 indånding omkring kl. 8 om morgenen. Dissekere ovidukterne ved hjælp af pincet og saks. Placer ovidukterne i 6 cm skålen med M2 medium.
- Slip cumulus-oocytkomplekser (COCs) ved at rive ampulla af oviducts med en 30 G nål. Overfør COC'er til forvarmet hyaluronidase-medium og hold ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
- Efter 2-3 min, indsamle cumulus-fri oocytter med en mund pipette og vask oocytter 3 gange ved at overføre dem til frisk M2 medium i de andre 3 brønde af 4-brønds plade.
- Metafase II (MII) oocytter, som har de første polære kroppe, opsamles i en skål med M16-medium og holder pladen ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære, indtil den anvendes til intracytoplasmisk injektion i trin 12.
9. Behandling og indsamling af DKO-phaESC'er
- Forbered en DKO-phaESC kultur i en brønd af en 6-brønds plade uden MEF'er ved 60-80% sammenløb en dag før den intracytoplasmiske injektion (fra trin 5.11).
- For at fremkalde cellecyklusstop i M-fase aspireres mediet fuldstændigt, og der tilsættes 2 ml haESC-medium indeholdende 0,05 mg/mL demecolcine.
- Efter 8 timers demecolcine behandling, aspirere mediet og tilsæt 800 μL trypsin.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 5 min., tilsæt derefter 2 mL vaskebuffer for at slukke trypsinen og pipette flere gange for at opnå en enkeltcellet suspension.
- Overfør celleaffjedringen til et 15 mL rør. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Cellepellet blev genbrugt i 400 μL haESC-vedligeholdelsesbuffer indeholdende 15 μg/mL Hoechst 33342.
- Celleaffjedringen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 15 min. Efter inkubationen overføres celleaffjedringen til et 5 mL rør gennem en cellesienhætte, og røret holdes ved 4 °C, indtil cellen sorteres i trin 10.
10. Rensning af M-fase-anholdte DKO-phaESCs
- Opsæt et flowcytometer med en 100 μm dyse i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: Hoechst 33342 kan påvises ved excitation ved 405 nm. Her bruges en 355 nm UV-laser til påvisning af Hoechst 33342. - Opret M-fase-anholdt DKO-phaESCs fra trin 9.7 og starte analysen. Vælg en passende sorteringsport til opsamling af haploide M-faseceller (2n) fra prøven behandlet med demecolcine.
BEMÆRK: Efter demecolcine-behandlingen forventes der 2 cellepopulationer svarende til haploide og diploide M-fase-anholdte celler som vist i figur 3B. Cellecyklusarreationen efter demecolcine-behandlingen er afsluttet, og der observeres således ingen haploid 1n DNA-top. Dette er vigtigt, da haploid M-fase celler og diploid G1 celler har samme DNA-indhold (2n) og ville producere overlappende toppe. - Opsæt et 15 mL rør, der indeholder 2 mL haESC vedligeholdelsesbuffer til opsamling af de sorterede celler i flowcytometeret. Start cellesortering.
- Efter cellesortering tilsættes 5 mL vaskebuffer langs væggen i opsamlingsrøret. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellerne i en passende mængde haESC vedligeholdelse buffer for at opnå en endelig koncentration på 5 x 105 celler / mL.
- Overfør celleaffjedringen til et 1,5 mL rør. Hold røret på is, indtil det er klar til intracytoplasmisk injektion i trin 12.
11. Forberedelse af holde- og mikroinjektionspipetter
BEMÆRK: Til udførelse af den intracytoplasmiske injektion (trin 12) kræves der flere holde- og mikroinjektionspipetter (figur 4A). Disse pipetter kan købes efter skræddersyet efterspørgsel fra en kommerciel leverandør eller fremstillet af egnede glaskapillærer ved hjælp af en micropipette-aftrækker og en mikroforge.
- Træk borosilikat glas kapillærer på en micropipette puller. For at trække borosilikatglaskapillærer uden glødetråd (0,78 x 1,00 x 80 mm) angives følgende parametre for en flammende vandret aftrækker (Tabel over materialer) som reference men vil variere for andre instrumenter og glas kapillær typer: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 og Pressure 200 for at holde pipetter; Heat 510 (Rampetest 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 og Pressure 200 for microinjection pipetter.
BEMÆRK: De optimale parametre skal defineres individuelt, fordi flere faktorer, herunder fugtighed, modellen af en micropipette-aftrækker og partiet af glaskapillærerne kan påvirke sprøjtens form. En langstrakt form med en gradvis tilspidsning bør være rettet mod. - Forberedelse af holdepipetter
- Sæt en trukket kapillær tilberedt i trin 11.1 til en mikroforge. Placer kapillæren over glasperlen på glødetråden, og sænk kapillæren for at komme i kontakt med glasperlen, mens filamentet opvarmes.
- Bryd kapillæren ved at slukke for opvarmningen og løsne den fra glasperlen, så dens ydre diameter er 60-100 μm.
- Placer kapillærspidsen vandret mod glasperlen på glødetråden.
- Filamentet opvarmes, så kapillærspidsens indvendige diameter kan smelte til en diameter på 10-20 μm.
- Flyt kapillæren, så glasperlen placeres på et punkt ~1 mm fra kapillærspidsen uden kontakt. Varm glødetråden, så kapillæren kan bøjes i en vinkel på 20°. Afmonter kapillæren, hed en holdepipette, fra mikroforge.
BEMÆRK: For at måle kapillærens størrelse monteres der helst en reticle i mikroforseglet.
- Fremstilling af mikroinjektionspipetter
- Sæt en trukket kapillær tilberedt i trin 11.1 til en mikroforge. Placer kapillæren over glasperlen på glødetråden, og sænk kapillæren for at komme i kontakt med glasperlen, mens filamentet opvarmes.
- Bryd kapillæren ved at slukke for opvarmningen og løsne den fra glasperlen i en position, hvor dens ydre diameter er 6 μm.
- Flyt kapillæren, så glasperlen placeres på et punkt ~1 mm fra kapillærspidsen uden kontakt. Varm glødetråden, så kapillæren kan bøje opad i en vinkel på 20°. Afmonter mikroinjektionspipetten fra mikroforge og opbevar den i en sikker kasse til senere brug.
BEMÆRK: Mikroinjektionspipetterne fremstilles med følgende specifikationer: ydre diameter, 6 μm; indvendig diameter, 4,5-5 μm; bøje vinkel, 20°. At definere det optimale design af mikroinjection pipetten er vigtigt for succesen af den intracytoplasmiske injektion. For stor en indvendig diameter kan forhindre brud på plasmamembranen hos donor DKO-phESCs (se diskussionsafsnittet). Hvis den indre diameter er for smal, kan det hindre glat pipettering af donor DKO-phESCs. En bøjningsvinkel < 30° er at foretrække, da en høj bøjningsvinkel hæmmer effekten af piezoimpulser.
12. Intracytoplasmisk injektion af DKO-phaESCs
- Inden den intracytoplasmiske injektion (fra trin 12.2) fremstilles en polyvinylpyrrolidoneopløsning (PVP) ved at tilsætte 5 ml M2 medium i et 50 ml rør, der indeholder 0,6 g PVP, og røret omrøret på en vippe ved 4 °C i 2 dage. Når PVP er opløst fuldstændigt, filtreres opløsningen sterilt og opbevares ved 4 °C.
- På dagen for den intracytoplasmiske injektion skal du tilberede en center-well skål med 900 μL KSOM medium og forvarme skålen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Forbered en mikromanipulationsskål ved at justere dråber på 5 μL PVP-opløsning og 20 μL M2-medium på et låg på en 10 cm skål, der er placeret på hovedet. Dæk dråberne med mineralsk olie, og læg skålen på indsprøjtningens mikroskop.
BEMÆRK: Det anbefalede arrangement af mikromanipulationsskålen er vist i figur 4B. - Installer en holdepipette på mikromanipulatoren. Fyld mikroinjection pipetten med fluorocarbonolien ved hjælp af en mikrolæsserspids, og monter den på piezo aktuatoren.
- Nedsænk mikroinjektionspipetten i en dråbe med PVP-opløsning og pipette op og ned flere gange for at belægge glasset med PVP og gøre det mindre klæbrigt. Læg en lille mængde PVP-opløsning i mikroinjektionspipetten, og flyt pipetten til en dråbe med M2-medium.
- Fordyb holdepipetten i M2-mediet, og fokuser på pipetten i bunden af dråben.
- Der overføres ca. 2 μL DKO-phaESC-affjedring fra trin 10.6 til M2-mediumfaldet.
- Overfør 10 MII oocytter fra trin 8.5 til samme M2 medium drop ved hjælp af en mundpipette.
- Til injektion skal du rotere en oocyt i M2-mediumdråben, så perivitellinerummet vender mod mikroinjektionspipetten, og MII-pladen ikke er placeret i stien til mikroinjektionspipetten (Figur 4A). Hold oocytten ved at trykke negativt gennem holdepipetten.
BEMÆRK: En MII-plade identificeres visuelt som et fremspring af ooplasmos, der kaldes en "pukkel" og ofte placeret ved siden af den første polære krop. MII-pladen indeholder den meiotiske spindel med tilhørende kromosomer. Berøring af mikroinjektionspipetten og MII-pladen skal undgås, da mekanisk skade på spindel og kromosomer kan forstyrre embryoudviklingen. - Læg en DKO-phaESC i spidsen af mikroinjection pipetten ved at anvende blidt undertryk. Brud plasmamembranen i en DKO-phaESC ved pipetter for at undgå injektion af en intakt DKO-phaESC(Figur 3C; se diskussion).
BEMÆRK: Hvis plasmamembranen i en DKO-phaESC ikke bristes ved pipettering, skal du kassere DKO-phaESC og indlæse en anden DKO-phaESC. - Placer mikroinjection pipetten i kontakt med oocytens zona pellucida, og påfør en lille mængde undertryk i mikroinjection pipetten.
- Påfør piezoimpulser (intensitet, 20; frekvens, 4) for at bryde gennem zonaen, mens du skubber spidsen af mikroinjektionspipetten mod perivitellinerummet. Bekræft, at MII-pladen, der indeholder en spindel og kromosomer, ikke er placeret i stien til mikroinjection pipetten.
BEMÆRK: Empirisk justere indstillingen til de laveste piezo pulser til boring gennem zona for at minimere risikoen for skader på oolemma. - Kassér fragmentet af zona pellucida fra mikroinjection pipetten, og placer DKO-phaESC på kanten af pipetten.
- Træng ind i oocytten med mikroinjection pipetten, så oolemmaen når den modsatte side.
BEMÆRK: Rør ikke ved MII-pladen for at undgå skader på spindel og kromosomer. - Påfør en piezo puls (intensitet, 6; frekvens, 1) for at gennembore oolemma. Sørg for, at oolemmaen slapper af langs mikroinjection pipettens aksel.
BEMÆRK: Empirisk definere den laveste indstilling af piezo puls for at bryde oolemma at minimere skaderne på oocyt. - DKO-phaESC injiceres med et minimalt mediumindhold i ooplasmen, og mikroinjektionspipetten trækkes jævnt ud af oocytten.
- Udløs den injicerede oocyt fra holdepipetten, og læg den på siden af mikrodråben til senere opsamling.
- Injektionsproceduren gentages fra trin 12.9 til 12.17 for de andre MII-oocytter i M2-mediumdråben.
BEMÆRK: Undgå at holde oocytterne ude af inkubatoren i mere end 20 minutter. Det er vores erfaring, at et parti på 10 oocytter kan manipuleres komfortabelt inden for 15 minutter efter passende træning. - Overfør partiet af injicerede oocytter fra M2 medium drop til en forvarmet center-well parabol med KSOM medium.
- Skålen opbevares i 1 time ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.
- Der gentages oocytmanipulationen fra trin 12.5 og 12.20 med yderligere grupper af MII-oocytter for at opnå nok injicerede oocytter.
13. Aktivering af konstruerede halvklonede embryoner
- Forbered to center-well retter med 900 μL hver af KSOM medium og aktivering medium. Forbered en 4-brønds plade med 700 μL KSOM medium i hver brønd. Forvarm opvasken og pladen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Efter 1 time i KSOM medium overføres de injicerede oocytter fra trin 12.21 til den forvarmede center-well skål med aktiveringsmedium.
- Skålen opbevares i 6 timer ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære til aktivering.
- Efter aktivering, observere nogle semi-klonede embryoner danner tre polære organer, som er den første og den anden polære organer oocyt, og pseudo polære krop fra DKO-phaESC (Figur 3E).
- Vask embryonerne 3 gange ved at overføre dem til nye brønde med KSOM medium i en 4-brønds plade.
- Overfør embryonerne til midterbrønden med KSOM-medium, og hold skålen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære for yderligere udvikling.
14. Udvikling af konstruerede halvklonede embryoner
- Efter 1 dags kultur i KSOM-mediet fra trin 13.6 når flere halvklonede embryoner 2-cellestadiet (Figur 5A).
- Til videreudvikling af præimplantationsembryoner in vitro fortsætte med at dyrke de halvklonede embryoner i KSOM-medium ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. Overfør de halvklonede embryoner til frisk KSOM medium på dag 2. På dag 4 vil flere embryoner nå blastocyststadiet (Figur 5A).
- Til afledning af halvklonede mus overføres 2-cellede embryoner fra trin 14.1 til ovidukterne af pseudo-gravide recipienthunner. Identificer pseudo-gravide hunner ved at parre sig med vasektiserede hanner en dag før embryooverførslen og vælge dem på grundlag af tilstedeværelsen af et klart synligt stik om morgenen på dagen for embryooverførslen (0,5 dage efter coitum (dpc)). Omkring 19,5 dpc, fuld sigt hvalpe er naturligt leveret fra modtageren hunner (Figur 5B).
Representative Results
Formålet med denne protokol er at anvende haESC'er som erstatning for sædceller for at opnå halvklonede embryoner og mus. Til dette formål blev der genereret en DKO-phaESC-linje med CAG-EGFP-transgenet, som blev anvendt til intracytoplasmisk injektion i MII-oocytter. For at opnå en passende phaESC-linje med en faderlig aftrykskonfiguration udførte vi genteknologi ved hjælp af Cas9-kerner. En haploid ESC-linje indeholder haploide og diploide celler, der opstår på grund af en iboende tendens til haploid ESC'er til diploidisering10. Et haploid kromosomsæt er en forudsætning for en vellykket udskiftning af sædgenomet. DNA-indholdsanalyse efter flowcytometri viser fordelingen af haploide og diploide celler i G0/G1-, S- og G2/M-faser(figur 2A).
For at etablere DKO-phaESC-linjerne blev wildtype phaESC-linjer transfected med piggyBac transposon konstruktioner for stabile transgene EGFP-udtryk og med CRISPR/Cas9 plasmider for at opnå sletninger af H19- og IG-DMRs. For at udelukke diploid ESC'er og isolere kun haploid ESC'er, der udtrykker EGFP, blev der defineret en bestemt sorteringsport (figur 2A). Enkelte haploide EGFP-positive celler blev derefter belagt i individuelle brønde af 96-brønds plader for at opnå subklononer. MEF-feedere blev brugt til at øge de transinficerede faESC'ers platingeffektivitet og overlevelse. Efter udvidelse af kulturerne blev en indledende runde af genotyping udført af PCR for at identificere subkloner, der bærer sletninger af begge DMR'er. Efter at MEF-feedere var blevet fjernet fra kulturerne, blev der udført en anden genotyping for at bekræfte fraværet af vilde alleler ved H19- og IG-DMRs (Figur 2B). Fra i alt 135 subkloner opnåede vi 5 haploid DKO-phESC-linjer, der bar de slettede alleler og var fri for wildtype-alleler af både H19-DMR og IG-DMR.
En CAG-EGFP-transgen blev indført i DKO-phaESCs for at studere deres bidrag til halvklonede embryoner ved visualisering af grøn fluorescens under et mikroskop (Figur 3A). For den intracytoplasmiske injektion blev DKO-phaESCs behandlet med demecolcine for at arrestere dem i M-fase. Således blev cellecyklussen for DKO-phaESCs synkroniseret med MII oocytter. Flowcytometrianalyse viste 2 populationer svarende til G2/M-fasen arresteret haploid (2n) og diploidceller (4n) efter behandling med demecolcine (Figur 3B). Fraværet af 1n haploid peak indikerede, at cellecyklus anholdelsen stort set var afsluttet. M-fase haploid ESCs blev derefter sorteret og injiceret i oocytter. Til dette formål blev en enkelt DKO-phaESC lastet i mikroinjektionspipetten og sprøjtet ind i cytoplasmaet i en MII-oocyt (Figur 3C). Plasmamembranen i DKO-phaESC blev bristet ved at pipettere ind i spidsen af mikroinjektionspipetten.
Efter injektionen blev EGFP-ekspressionen sjældent påvist i de konstruerede halvklonede embryoner, da cytoplasmaet i DKO-phaESC havde spredt sig i oocytens store cytoplasma (figur 3D). I sjældne tilfælde kunne der observeres et rundt sted med intens EGFP-udtryk inden for ooplasmen. Denne observation var sandsynligvis forårsaget af utilsigtet injektion af intakte DKO-phaESCs. Manglende brud på DKO-phaESC-cellemembranen er sandsynligvis ikke forenelig med yderligere embryoudvikling og bør undgås. En time efter injektionen blev embryoner aktiveret ved behandling med strontiumchlorid18. Seks timer efter påbegyndelsen af aktiveringen blev der observeret op til 3 polære kroppe under mikroskopet (Figur 3E). Disse polære kroppe svarer til den første og anden polære organer oocyt og en pseudo polar krop fra DKO-phaESC7. Derudover blev to pronuclei observeret under et differentialinterferenskonsistenskontrastmikroskop, der lignede den pronukleare fase af zygoter efter normal befrugtning med sædceller.
For at demonstrere udviklingskompetence blev halvklonede embryoner dyrket til blastocyststadiet (Figur 5A). Desuden blev der opnået en heltidsmus efter overførsel af halvklonede 2-cellede embryoner til en recipientkvindes ovidukter (figur 5B). Som forventet var musen afledt af et halvklonet embryon en hun, da hverken oocytter eller oocyt-afledte faESC'er bærer et Y-kromosom. Den halvklonede mus var åbenlyst normal og producerede sunde afkom, når den blev parret med en vildtype schweizisk Webster-mand. Indtil nu har den halvklonede mus været i live i over 600 dage uden nogen synlige sundhedsproblemer.
Figur 1: Oversigt over anvendelsen af DKO-phaESCs som sæderstatning. (A)En tidsramme for protokollens procedurer. (B) Ordningen viser, hvordan DKO-phaESC-linjerne skal etableres (trin 1-6). (C) Ordningen viser, hvilke skridt der er taget for at konstruere halvklonede embryoner ved intracytoplasmisk injektion af en DKO-phaESC i en MII-oocyt (trin 7-14). Forkortelser: DKO = dobbelt-knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; MEF = mus embryonal fibroblast. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Etablering af DKO-phaESC-linjer ved CRISPR/Cas9-medierede sletninger af H19- og IG-DMR' er. (A) Flowcytometrianalyse af phaESCs efter transfekt med piggyBac plasmider for stabil EGFP-udtryk og med 4 CRISPR/Cas9 plasmider. Ikke-transficerede faseopdelinger vises som kontrol. DNA-profilen (øverst) viser cellecyklusfordelingen af haploide og diploide celler. G1/S-fase haploide celler, der udtrykker EGFP, er angivet med den grønne port (nederst, til højre). (B) Genotyping af phaESC-underkloner, der blev dyrket på MEF'er (første genotyping) og efter fjernelse af MEF'er (anden genotyping). Subklonede phaESC-linjer 1, 2, 3 og 4 repræsenterer wildtype-celler, celler med en H19-DMR-sletning, med en IG-DMR-sletning og med kombinerede H19-og IG-DMR-sletninger. DKO-phaESC linje 5-8 besidder både H19-DMR og IG-DMRsletninger og er fri for wildtype alleler. Forkortelser: DKO = dobbelt-knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; DMR = differentieret methyleret region; MEF = embryonale musefibroblast; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; WT = vildtype. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Injektion af mitotically anholdt DKO-phaESCs i MII oocytter. (A) Morfologi af en DKO-phaESC kultur, der bærer en CAG-EGFP transgene og sletninger af H19- og IG-DMRs; scale bar = 50 μm. (B) Repræsentativ flowcytometrianalyse af DKO-phaESC'er efter anholdelse med demecolcine i 8 timer. (C) DKO-phaESC's morfologi i mikroinjektionspipetten. Der vises en enkelt intakt DKO-phaESC før (venstre) og efter (højre) brud på plasmamembranen ved pipettering. scale bar = 20 μm. (D) Konstruerede embryoner ved 1 time efter injektion af DKO-phaESCs i MII oocytter. Der vises et flettet billede af EGFP-fluorescens og lyst felt. Sorte pilespidser angiver runde pletter af intens EGFP-ekspression efter injektion af intakte DKO-phaESC'er, som bør undgås. skalastang = 50 μm. (E) Der vises et differentialinterferenskontrastbillede af halvklonede embryoner 6 timer efter påbegyndelsen af aktiveringen med strontiumchlorid. Hvide pilespidser angiver embryoner med 3 polære kroppe, herunder en pseudopolær krop fra den injicerede DKO-phaESC; skalastang = 50 μm. Forkortelser: DKO = dobbelt-knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ordning for opsætning af intracytoplasmisk injektion af DKO-phaESCs i oocytter. (A) Der vises et arrangement af en injektionspipette, en holdepipette og en oocyt i injektionskammeret. α, bøje vinkel mikroinjection pipette. (B) Layout af dråberne i mikromanipulationsskålen til intracytoplasmisk injektion. Forkortelser: DKO = dobbelt-knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcelle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Udvikling af halvklonede embryoner. (A)Præimplantationsudvikling af halvklonede embryoner in vitro. EGFP-ekspressionen observeres i første omgang i firecellede embryoner på dag 2 efter intracytoplasmisk injektion. På dag 4 kan intens EGFP-udtryk observeres i blastocysts; scale bar = 100 μm. (B) En halvklonet mus opnået efter 2-cellet embryooverførsel til en recipientkvinde. Ved 74 dpp leverede den halvklonede mus (pilespids) sine første hvalpe (stjerne) ved naturlig fødsel efter parring med en vildtype schweizisk Webster-mand. Halvklonede embryoner og den halvklonede mus, der er vist i dette tal, er identiske med dem, der er rapporteret i Aizawa et al.3. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; .dpp, dage efter fødslen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Gelatine løsning | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| Vand | - | 500 mL | - |
| Gelatine | - | 1 g | 0.2% |
| Haploid embryonale stamceller (HaESC) medium | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| NDiff 227 | - | 10 mL | - |
| CHIR 99021 | 10 mM | 3 μL | 3 μM |
| PD 0325901 | 10 mM | 1 μL | 1 μM |
| Lif | 1 x 106 IE/mL | 10 μL | 1.000 IE/mL |
| Penicillin-Streptomycin | 100x | 100 μL | 1x |
| HaESC-vedligeholdelsesbuffer | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| HaESC-medie | - | 1 mL | - |
| HEPES løsning | 1 M | 20 μL | 20 mM |
| Vask buffer | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| DMEM / F-12 | - | 100 mL | - |
| BSA-brøk | 7.5% | 7,1 mL | 0.5% |
| MEF-medie | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| DMEM | - | 500 mL | - |
| Fbs | - | 56 mL | 10% |
| β-Mercaptoethanol | 14,3 mol/L | 3,9 μL | 100 μM |
| Penicillin-Streptomycin | 100x | 5,6 mL | 1x |
| Lysis buffer | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| Vand | - | 8,25 mL | - |
| Tris-HCl (pH 8,5) | 1 M | 1 mL | 100 mM |
| Edta | 0,5 mio. | 100 μL | 5 mM |
| SDS-løsning | 10% | 200 μL | 0.2% |
| Nacl | 5 M | 400 μL | 200 mM |
| Proteinase K | 20 mg/mL | 50 μL | 100 μg/mL |
| Aktiveringsmedium | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| KSOM | - | 1 mL | - |
| Strontiumchlorid | 1 M | 5 μL | 5 mM |
| EGTA | 0,5 M, pH 8,0 | 4 μL | 2 mM |
| PVP-løsning | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| M2-medie | - | 5 mL | - |
| Pvp | - | 0,6 g | 12% |
| PMSG-løsning | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| Pbs | - | 450 μL | - |
| PMSG | 500 IE/mL | 50 μL | 50 IE/mL |
| hCG-løsning | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| Pbs | - | 450 μL | - |
| Hcg | 500 IE/mL | 50 μL | 50 IE/mL |
| Hyaluronidase medium | |||
| Komponent | Koncentration af bestanden | Volumen/vægt | Endelig koncentration |
| M2-medie | - | 380 μL | - |
| Hyaluronidase | 10 mg/mL | 20 μL | 0,5 mg/mL |
| Forkortelser: LIF = leukæmi hæmmende faktor; MEF = embryonale musefibroblast; | |||
| FBS = føtalt kvægserum; DMEM = Dulbeccos modificerede ørnemedium; BSA = bovin serumalbumin; | |||
| EDTA = ethylendiaminetetraeddikesyre; SDS = natrium-dodecylsulfat; EGTA = ethylen-bis(oxyethylenitrilo)tetraeddikesyre; | |||
| PBS = fosfatbufferet saltvand; PVP = polyvinylpyrrolidone; hCG = human chorionic gonadotropin; | |||
| PMSG = gravid hoppe serum gonadotropin. | |||
Tabel 1: Opskrift på medium, buffer og løsning.
| Navn | Sekvens (5' til 3') | Program | |
| H19-DMR-P1 | GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG | Genotypebestemmelse | |
| H19-DMR-P2 | AGA TGG GGT KAT TCTT CC | Genotypebestemmelse | |
| H19-DMR-P3 | 1984 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1 | Genotypebestemmelse | |
| IG-DMR-P1 | TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG | Genotypebestemmelse | |
| IG-DMR-P2 | CCA CAA AAA FT CCC TTT CA | Genotypebestemmelse | |
| IG-DMR-P3 | ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG | Genotypebestemmelse | |
| H19-DMR-gRNA1-F | CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA1-R | 1984 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1989 | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-F | CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-R | 1984 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 1988 19 | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-F | CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-R | AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-F | CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-R | AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG | gRNA | |
Tabel 2: Liste over oligonukleotider.
Discussion
Kloning af pattedyr ved somatisk cellekerneoverførsel (SCNT) har været banebrydende i 1990'erne19,20,21. Denne udvikling fulgte kloningsundersøgelser udført 30 år tidligere i amfibier22. Den betydelige forsinkelse afspejler vanskeligheden ved embryologi og genomisk prægning hos pattedyr. Udviklingen af pattedyrs SCNT er grundlaget for anvendelsen af haESC til erstatning af sædceller, som er beskrevet i denne protokol.
Synkronisering af cellecyklus er en vigtig faktor for, om SCNT23 kanlykkes. Dette er også tilfældet for injektion af haESC i denne protokol. Indførelse af et donorgenom i en modtager kræver, at cellecyklusfaserne matches for at undgå kromosombrud eller aneuploidies, der ville ophæve embryoudvikling. Halvkloning har den yderligere kompleksitet, at to genomer og en cytoplast skal være kompatible. En tidligere rapport har vist, at injektion af M-fase-anholdte androgenetiske haESC'er gav bedre udviklingshastigheder af halvklonede embryoner end injektion af G1-fase haESC'er i oocytter7. I denne betænkning foreslås M-fase som et passende synkroniseringspunkt for halvkloning. Derfor blev phaESCs mitotically arresteret i metafase med demecolcine og injiceres i ooplasm af MII oocytter, som naturligt blev arresteret i metafase II af meiose. Det er vigtigt, M-fase anholdelse kan opnås i mus ESCs med høj effektivitet, hvilket giver fremragende synkronisering mellem donor og modtager celle cyklusser.
Under mitose nedbrydes den nukleare membran, og der dannes en spindel, som de replikerede kromosomer fastgøres til. Efter injektion af M-fase DKO-phaESCs, søster kromatiderne er opdelt i en pseudo polar krop og zygote7 (Figur 3E). Derfor bidrager et enkelt sæt kromosomer fra en DKO-phaESC til det halvklonede embryo. Det er afgørende, at søsterkromatiderne af DKO-phaESC-kromosomer kan adskilles korrekt efter injektion. Plasmamembranen i en intakt DKO-phaESC forhindrer adskillelse i en pseudopolær krop. Vi observerede faktisk sjældne tilfælde, hvor plasmamembranen i DKO-phaESCs ikke blev bristet, og embryoner udviste intakte DKO-phaESC'er i ooplasma efter injektion (Figur 3D). Derfor skal man sørge for at fjerne plasmamembranen i DKO-phaESCs ved pipettering. Under injektionen er det lige så vigtigt at undgå afbrydelse af oocytens meiotiske spindel, hvilket kan føre til kromosomadskillelsesdefekter og også fremkalde aneuploidy.
Hos pattedyr begrænser genomisk prægning anvendelsen af phaESC'er som sæderstatning. Parthenogenetiske haESC'er har en moderlig konfiguration af genomiske aftryk, mens sædceller har en faderlig konfiguration. Derfor er der ikke sket generering af heltidsunger efter injektionen af wildtype phaESCs som sæderstatning. For at overvinde denne begrænsning, sletninger af IG- og H19-DMRs er manipuleret i phaESCs. Ændring af påtrykte udtryk på moderens Igf2-H19 og Gtl2-Dlk1 loci er tilstrækkelig til at ændre konfigurationen af genomiske aftryk for at tillade generering af halvklonede mus med en frekvens på over 5,1%, baseret på overførte 2-cellede embryoner. Disse observationer tyder på, at målretning af to præget gener skifter genomet af phaESCs til en funktionel faderlig konfiguration, der kan erstatte sædceller i mus. Ikke desto mindre er der behov for en permanent genetisk modifikation af de forskellige lande i den europæiske beskæftigelsesstrategi i forbindelse med denne strategi. Som en alternativ strategi, androgenetic haESC kan overvejes. Androgenetiske haESC'er stammer fra sædgenomet og har faderlige aftryk. Der har været rapporter om , at wildtype androgenetic haESCs bidraget som sæd udskiftning til at generere fuld sigt hvalpe med en frekvens mellem 1,3% og 1,9% af overførte embryoner4,7,24. Heltidsunger er også opnået ved at injicere androgenetiske haESC'er med sletninger af IG- og H19-DMR med en hyppighed på 20,2% af overførte 2-cellede embryoner24. Den øgede effektivitet af semi-kloning ved hjælp af modificerede androgenetiske haESC'er er sandsynligt, fordi aftryk kan blive ustabile i kulturen. Aftryksdefekter korrigeres ved genetisk sletning af kritiske DMR'er.
I betragtning af vanskeligheden ved at indføre genetiske modifikationer direkte i oocyt- eller sædgenomer er haESC'er et værdifuldt værktøj til at manipulere forældrenes genomer separat. Brug af haESC'er som erstatning for sæd giver en bemærkelsesværdig fordel for genomredigering i musekimlinjen. En nylig undersøgelse har kombineret CRISPR/Cas9-baseret genomredigering med anvendelse af haESC'er til karakterisering af prægningsområder, der er afgørende for embryonal udvikling12. Denne undersøgelse analyserede Rasgrf1-DMR'srolle i kombination med H19-ogIG-DMR'erne i udviklingen af bimaternal mus og funktionen af 7 forskellige DMR'er i udviklingen af bipaternale mus. Metoden til erstatning af haESC'er til sæd dannede grundlag for genetiske screeningsmetoder til identifikation af vigtige aminosyrer i DND1-proteinet i urkimcelleudvikling og til identifikation af gener i knogleudvikling24,25,26. Undersøgelser af genomisk prægning og genetisk screening for at identificere nøglefaktorer i embryonal udvikling er betydelige tilgange til anvendelse af haESC'er som spiliske genomer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Giulio Di Minin for afledning af phaESC linjer og Dr. Remo Freimann for flow cytometry operation. Vi anerkender også Ms Michèle Schaffner og Mr. Thomas M. Hennek for teknisk støtte med embryo overførsel. Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (tilskud 31003A_152814/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mLTube | Eppendorf | 0030 125.150 | haESC culture |
| 15 ml Tube | Greiner Bio-One | 188271 | haESC culture |
| 12-well plate | Thermo Scientific | 150628 | haESC culture |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | haESC culture |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | haESC culture |
| 96-well plate | Thermo Scientific | 167008 | haESC culture |
| β-Mercaptoethanol | Merck | M6250 | haESC culture |
| BSA fraction | Gibco | 15260-037 | haESC culture |
| CHIR 99021 | Axon | 1386 | haESC culture |
| Demecolcine solution | Merck | D1925 | haESC culture |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | haESC culture |
| DMEM / F-12 | Gibco | 11320-033 | haESC culture |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | haESC culture |
| EDTA | Merck | E5134 | haESC culture |
| FBS | biowest | S1810-500 | haESC culture |
| Freezing medium | amsbio | 11897 | haESC culture |
| Gelatin | Merck | G1890 | haESC culture |
| Hepes solution | Gibco | 15630-056 | haESC culture |
| Irradiated MEF | Gibco | A34966 | haESC culture |
| LIF (Leukemia inhibitory factor) | (Homemade) | - | haESC culture |
| Lipofection reagent | Invitrogen | 11668019 | haESC culture |
| NDiff 227 | Takara | Y40002 | haESC culture |
| PD 0325901 | Axon | 1408 | haESC culture |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | haESC culture |
| piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene | Addgene | #40973 | haESC culture |
| piggyBac transposase plasmid | System Biosciences | PB210PA-1 | haESC culture |
| pX330 plasmid | Addgene | #42230 | haESC culture |
| pX458 plasmid | Addgene | #48138 | haESC culture |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | haESC culture |
| DNA polymerase | Thermo Scientific | F549S | Genotyping |
| dNTP Mix | Thermo Scientific | R0192 | Genotyping |
| Ethanol | Merck | 100983 | Genotyping |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | Genotyping |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Genotyping |
| Proteinase K | Axon | A3830 | Genotyping |
| SDS | Merck | 71729 | Genotyping |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Genotyping |
| ThermoMixer | Epeendorf | 5384000012 | Genotyping |
| Tris | Merck | T1503 | Genotyping |
| 5 mL Tube | Falcon | 352063 | Flow cytometry |
| 5 mL Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Flow cytometry |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Flow cytometry |
| MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | Flow cytometry |
| 1 mL syringe | Codan | 62.1640 | Superovulation |
| 30-gauge 1/2 inch needle | Merck | Z192362-100EA | Superovulation |
| B6D2F1 mouse | The Jackson Laboratory | 100006 | Superovulation |
| hCG | MSD animal health | 49451 | Superovulation |
| PBS | Gibco | 10010015 | Superovulation |
| PMSG | Avivasysbio | OPPA1037 5000 IU | Superovulation |
| 10-cm dish | Thermo Scientific | 150350 | Embryo manipulation |
| 4-well plate | Thermo Scientific | 179830 | Embryo manipulation |
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 227261 | Embryo manipulation |
| 6 cm dish | Thermo Scientific | 150288 | Embryo manipulation |
| Center-well dish | Corning | 3260 | Embryo manipulation |
| Digital rocker | Thermo Scientific | 88880020 | Embryo manipulation |
| EGTA | AppliChem | A0878 | Embryo manipulation |
| Hyaluronidase | Merck | H4272 | Embryo manipulation |
| KSOM | Merck | MR-020P-5F | Embryo manipulation |
| M16 medium | Merck | M7292 | Embryo manipulation |
| M2 medium | Merck | M7167 | Embryo manipulation |
| Mineral oil | Merck | M8410 | Embryo manipulation |
| Glass capillary | Merck | P1049-1PAK | Embryo manipulation |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | Embryo manipulation |
| Strontium chloride | Merck | 13909 | Embryo manipulation |
| 5ml syringe | Codan | 62.5607 | Microinjection |
| Borosilicate glass cappilary | Science product | GB100T-8P | Microinjection |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Microinjection |
| Fluorinert FC-770 | Merck | F3556 | Microinjection |
| Holding pipette | BioMedical Instruments | - | Microinjection |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | Microinjection |
| Microforge | Narishige | MF-900 | Microinjection |
| Microinjection pipette | BioMedical Instruments | - | Microinjection |
| Microlaoder tips | Eppendorf | 5252 956.003 | Microinjection |
| Micromanipulaor arms | Narishige | NT-88-V3 | Microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | Microinjection |
| PiezoXpert | Eppendorf | 5194000016 | Microinjection |
| PVP (Polyvinylpyrrolidine) | Merck | PVP360 | Microinjection |
| Syringe filter | SARSTEDT | 83.1826.001 | Microinjection |
References
- Ellegren, H., Galtier, N.
- Huijbers, I. J. Generating genetically modified mice: A decision guide. Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).
- Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells. PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).
- Li, W., et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).
- Li, Z., et al. Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells. Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).
- Wan, H., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice. Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).
- Yang, H., et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell. 149 (3), 605-617 (2012).
- Zhong, C., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).
- Elling, U., et al. Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).
- Leeb, M., Wutz, A. Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos. Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).
- Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).
- Li, Z. K., et al. Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions. Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).
- Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Shuai, L., et al. Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection. Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
- O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).
- Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).
- Gurdon, J. B. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).
- Campbell, K. H., Alberio, R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).
- Zhong, C., et al. CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).
- Bai, M., et al. Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development. PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).
- Li, Q., et al. CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development. Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).
