Artigo de método

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

DOI:

10.3791/62010

⸱

27 de julho de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N0) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Resumo

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O uso de um modelo de RNA autêntico é fundamental para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA viral que pode guiar tanto a descoberta mecanicista quanto o desenvolvimento de ensaios em virologia. O modelo de RNA de vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS), como o vírus sincicial respiratório (RSV), não é apenas uma molécula de RNA, mas sim um complexo de ribonucleoproteína encapsidada por nucleoproteína. Apesar da importância do autêntico modelo de RNA, a geração e montagem de tal complexo ribonucleoproteína permanecem sofisticadas e requerem elucidação aprofundada. O principal desafio é que o RSV N superexpresso liga-se não especificamente às RNAs celulares para formar partículas aleatórias semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs). Aqui, estabelecemos um protocolo para obter N (N0)livre de RNA primeiro, co-expressando N com uma fosfoproteína acompanhante (P), depois montando n0 com oligos de RNA com a sequência de RNA específica do RSV para obter nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs). Este protocolo mostra como superar a dificuldade na preparação desse complexo tradicionalmente desafiador de ribonucleoproteína viral.

Introdução

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Os vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) incluem muitos patógenos humanos significativos, como raiva, Ebola e vírus sincicial respiratório (RSV)1,2. O RSV é a principal causa de doenças respiratórias, como bronquiolite e pneumonia em crianças pequenas e idosos em todo o mundo3. Atualmente, não há vacinas efetivas ou terapias antivirais disponíveis para prevenir ou tratar o RSV4. Como parte do ciclo de vida, o genoma RSV serve como modelo para replicação pela polimerase RNA dependente do RSV RNA para produzir um antígeno, que por sua vez atua como modelo para gerar um genoma descendente. Tanto o genoma quanto o antígeno RNAs são inteiramente encapsidados pela nucleoproteína (N) para formar os nucleocapsídeos (NCs)3. Como os NCs servem como modelos para replicação e transcrição pela polimerase RSV, o conjunto NC adequado é crucial para que a polimerase tenha acesso aos modelos para síntese de RNA5. Curiosamente, com base nas análises estruturais das polmerases virais NNS, hipótese-se que várias proteínas N se dissociam transitoriamente das NCs para permitir o acesso da polimerase e rebinadas ao RNA após a síntese do RNA6,7,8,9,10,11,12.

Atualmente, o ensaio de polimerização RSV RNA foi estabelecido utilizando polimerase RSV purificada em modelos de RNA nus curtos13,14. No entanto, as atividades da polimerase RSV não alcançam o ideal, como observado nos produtos não processivos e abortivos gerados pela polimerase RSV ao usar modelos de RNA nus. A falta de NC com RNA específico do vírus é uma barreira primária para a compreensão mecanicista da síntese do RSV RNA. Portanto, o uso de um modelo de RNA autêntico torna-se uma necessidade crítica para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA RSV. As estruturas conhecidas das partículas semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs) do RSV e de outros vírus NNS RNA revelam que os RNAs nos NCLPs são RNAs celulares aleatórios ou RNAs genômicas viraismédias 15,16,17,18,19. Juntos, o principal obstáculo é que N liga não especificamente aos RNAs celulares para formar NCLPs quando n é superexpresso nas células host.

Para superar esse obstáculo, estabelecemos um protocolo para obter o RNA sem RNA (N0) primeiro e montar o N0 com RNA genômico viral autêntico em NCLPs20. O princípio deste protocolo é obter uma grande quantidade de N (N) recombinante livre de RNA (N0)co-expressando N com um acompanhante, o domínio n-terminal de fosfoproteína RSV (PNTD). O N0P purificado poderia ser estimulado e montado em NCLPs adicionando oligos RNA específicos do RSV, e durante o processo de montagem, o acompanhante PNTD é deslocado após a adição de oligos RNA.

Aqui, detalhamos um protocolo para a geração e montagem de NCs específicos do RSV RNA. Neste protocolo, descrevemos a clonagem molecular, preparação de proteínas, montagem in vitro e validação da montagem complexa. Destacamos a estratégia de clonagem para gerar construções bi-cistrônicas para coexpressão de proteínas para clonagem molecular. Para a preparação de proteínas, descrevemos os procedimentos da cultura celular, extração de proteínas e a purificação do complexo proteico. Em seguida, discutimos o método de montagem in vitro dos NCs específicos do RSV RNA. Finalmente, usamos cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) para caracterizar e visualizar os NCLPs montados.

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Protocolo

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1. Clonagem molecular

NOTA: A Clonagem Independente de Ligase (LIC) foi usada para fazer um plasmídeo de coexpressão bi-cistronic RSV. LIC é um método desenvolvido no início da década de 1990, que utiliza a atividade Exo 3'-5' da polimerase de DNA T4 para criar saliências com complementaridade entre o vetor e a inserção de DNA21,22. As construções foram feitas utilizando-se o DNA vetorial 2BT-10, que consiste em uma etiqueta de 10x no terminal N do Quadro de Leitura Aberto (ORF) (Figura 1).

  1. Realize a linearização dos vetores LIC usando digestão SSPI.
    1. Combine 10 μL de tampão SSPI 10X, 4 μL de enzima SSPI a uma concentração de 5 U/μL, o volume equivalente de 5 μg de DNA miniprep vetorial e ddH2O a 100 μL.
    2. Incubar o digestor por 3 horas a 37 °C.
    3. Execute o digestão em um gel de 1,0% de agarose para a extração de DNA vetorial.
    4. Use um kit de extração de gel para realizar extração e purificação. Suspenda o volume final de DNA vetorial em 30 μL de ddH2O e armazene-o a -20 °C.
  2. Prepare as pastilhas de DNA para n1-391 e P1-126 usando o Primer N1-391 Forward, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer e P1-126 Reverse Primer(Tabela 1).
    NOTA: Há sobreposição suficiente com o vetor linearizado para garantir uma temperatura de fusão entre 55 °C e 60 °C. Para o primer reverso, há sobreposição suficiente com a vertente complementar reversa do vetor linearizado pelo mesmo motivo.
    1. Realize a amplificação pcr da inserção de DNA utilizando as condições na Tabela 2 e Tabela 3.
    2. Extrair a inserção de DNA amplificada. Execute os produtos PCR da etapa anterior em um gel de 1,0% de agarose, em seguida, extraia e purifica as bandas por extração de gel. Suspenda o volume final de DNA extraído em 15 μL de ddH2O.
  3. Tratamento de polimerase de DNA T4 do vetor e inserir DNA(Tabela 4).
    NOTA: O tratamento deve ser realizado separadamente para o DNA vetorial e o DNA da inserção.
    1. Incubar a mistura por 40 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, inativar a polimerase a 75 °C por 20 minutos. Armazene a mistura de reação a -20 °C.
  4. Anneal o vetor LIC e o vetor de inserção.
    1. Configure um controle negativo com 2 μL de DNA vetorial LIC e 2 μL de ddH2O estéril.
    2. Combine 2 μL de DNA de inserção e 2 μL de DNA vetorial LIC das reações anteriores de polimerase de DNA T4 em um tubo de 0,2 mL.
    3. Realize a reação de ressarcial à temperatura ambiente por 10 minutos.
    4. Sacie a reação com 1,3 μL de EDTA a uma concentração de 25 mM.
    5. Transforme a reação em 100 μL de células competentes E. coli Top10 e emplaque-as em uma placa de seleção de ampicillin23,24.
  5. Identifique as construções positivas.
    1. Prepare a solução de miniprep plasmida. Isso pode ser feito através da colheita e inoculação de colônias em mídia LB. Normalmente, 3 colônias são suficientes.
    2. Incubar a mistura durante a noite a 37 °C.
    3. Centrifugar a mistura a 4.560 x g por 10 minutos e descartar o supernaspeso.
    4. Resuspenque as pelotas em 250 μL de tampão P1 e prepare minipreps plasmídeos usando um kit de miniprep spin.
    5. Realize uma análise de digestão do produto miniprep usando AseI ou outras enzimas de restrição.
    6. Carregue amostras em gel de 0,8% de agarose e execute o plasmídeo digerido. Analise o gel sob uma lâmpada UV.
    7. Use um serviço de sequenciamento para validar a sequência do produto positivo.
  6. Obtenha a inserção de DNA de coexpressão.
    1. Execute o PCR para obter n1-391 e P1-126 usando os modelos 2BT-10 N1-391 e 2BT-10 P1-126.
    2. Execute o 1st PCR para obter n1-391 da construção 2BT-10 N1-391 usando as condições pcr na Tabela 2 e Tabela 3 com o primer N1-391 Forward e Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGGCAATGCGGCGGCGG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
    3. Execute o2º PCR para obter P1-126 da construção 2BT-10 P1-126 usando o primer Forward: 5'-CCGCCGCATTGCAGCCAGCCAATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ e o primer reverso P1-126 (use as condições pcr na Tabela 2 e Tabela 3).
    4. Finalmente, execute a sobreposição de PCR nos produtos mistos das 2 reações pcr anteriores para mesclar n1-391 e P1-126. Use o primer N1-391 Forward e o primer P1-126 Reverse. Use as condições de PCR na Tabela 5 e Tabela 6.
  7. Junte-se ao vetor e à inserção de DNA.
    1. Trate o produto PCR sobreposto com polimerase de DNA T4 seguindo o protocolo na etapa 1.3.
    2. Anneal o vetor LIC e produto PCR seguindo o protocolo na etapa 1.4.
    3. Identifique os construtos positivos seguindo o protocolo na etapa 1.5.

2. Expressão e purificação de proteínas

NOTA: Use E. coli para a construção bi-cistrônica da coexpressão tanto da cultura N quanto da P. Cultura as células a 37 °C, mas realize a expressão a uma temperatura reduzida (16 °C) durante a noite. Purificar os complexos proteicos através de uma combinação de coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho(Figura 2).

  1. Use a cepa E. coli BL21(DE3) para produção de proteínas. Cresça 4 culturas celulares L a 37 °C em lb (Caldo de Luria) médio até OD600 chegar a 0,6.
  2. Abaixe a temperatura para 16 °C. Uma hora depois, induza a expressão com isopropílico de 0,5 mM 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) durante a noite.
  3. Centrifugar as células a 4.104 x g por 25 min e depois descartar o supernascedor.
  4. Resuspend as pelotas de célula em 200 mL de tampão de lise A (50 mM de fosfato de sódio, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 10% glicerol e 0,2% NP40). Use 50 mL de tampão de lise para resuspensar as pelotas celulares a partir de 1 L de cultura celular.
  5. Lyse as células por sônica por 15 minutos, 3 segundos e 3 segundos de distância. Em seguida, células centrífugas a 37.888 x g por 40 min.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando as células antes da sônica em um congelador de -80 °C.
  6. Carregue o supernante em uma coluna de gravidade de cobalto (diâmetro x comprimento: 2,5 cm x 10 cm) com ~10mL de contas pré-equilibradas com volumes de coluna de 5-10 (CV) de tampão de lise.
  7. Lave a coluna com 5 CV de buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% glicerol e 5 mM imidazol) e 5 CV de tampão C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% glicerol e 5 mM imidazol).
  8. Elute a proteína das contas usando 2 CV de tampão D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, e 250 mM imidazole).
  9. Diluir a proteína elucida 5x com tampão de QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glicerol) para a coluna Q.
  10. Lave os 5 mL da coluna Q com tampão de QA para equilibrar a coluna e, em seguida, carregue a amostra diluída na coluna Q usando a bomba peristáltica (por exemplo, Coelho).
  11. Carregue a coluna Q na máquina HPLC juntamente com buffer QA e buffer QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1,5 M NaCl, 5% glicerol). Configure a vazão em 1 mL/min.
  12. Execute o programa de "lavagem da bomba" para lavar a máquina com buffer QB seguido de buffer QA (1-2 CVs/cada). Defina o fluxo do sistema para 3 mL/min.
  13. Defina o UV1 para 280 nm e UV2 para 260 nm. Use uma placa de poço de 96 polegadas para coletar as frações.
  14. Proteínas elutos usando um gradiente stepwise do agente de elução (QB Buffer) aplicando 3-4 CV de cada concentração, aumentando a porcentagem em 5% cada vez começando em 0% de QB. O complexo de proteínas N0P sairá com 15% de QB Buffer.
  15. Uma vez que toda a proteína é eluvada, lave a coluna com 100% QB Buffer (2 CV).
  16. Isole a proteína por filtragem de gel Superdex 200 Aumente coluna 10/300 GL (diâmetro x comprimento: 1,0 cm x 30 cm) e equilibre com tampão E (20 mM HEPES pH 7,4 e 200 mM NaCl).
  17. Analise frações contendo proteínas por SDS-PAGE.

3. Montagem in vitro do NC específico do vírus

NOTA: A montagem in vitro do NC específico do RSV (N:RNA) foi realizada incubando o complexo N0P preparado com oligos de RNA. Em seguida, a cromatografia SEC foi utilizada para separar o complexo de montagem do N0P e o excesso de RNA(Figura 2).

  1. Misture e incuba o complexo N0P purificado com oligo de RNA com a razão molecular de 1:1.5 à temperatura ambiente por 1 hora, geralmente 1 mL da proteína N0P com uma concentração de 1 mg/mL é suficiente para o próximo passo. Configure a amostra de controle, que contém apenas a mesma quantidade de proteína N0P.
  2. Pré-equilibre a filtragem de gel Superdex 200 Aumente coluna 10/300 GL com o buffer E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
  3. Centrifugar a amostra com 21.130 x g por 15 minutos, remover qualquer precipitação e carregar o supernasal para a coluna SEC.
  4. Compare as imagens de cromatografia SEC da amostra de montagem N:RNA e da amostra de controle N0P, combine a razão A260/A280 para identificar quais picos são o N-RNA montado, N0P e RNA gratuito.
  5. Colete as frações de pico, execute o gel SDS-PAGE ou faça grades.
  6. Para o complexo de montagem N-RNA, colete todas as frações do pico N-RNA, faça a extração de RNA e execute o gel Urea-PAGE para verificar novamente o comprimento do RNA específico, que é o mesmo que misto e incubado na primeira etapa.

4. Fazer grades de manchas negativas

NOTA: A microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) é um método no qual as moléculas são adsorvidas a uma película de carbono e, em seguida, incorporadas em uma camada de átomos de metais pesados. A mancha negativa EM produz um alto contraste de imagem, facilitando a visão e alinhe computacionalmente as partículas. Outra vantagem é que a adsorção das partículas a um filme de carbono geralmente induz as moléculas a aderir à rede com poucas orientações preferidas. Quando as moléculas estão em uma orientação semelhante, é fácil separá-las em classes estruturalmente distintas. A mancha negativa EM é, portanto, a técnica adequada para orientar a preparação da amostra25,26 ( Figura3).

  1. Micro-ondas ou calor 5 mL de ddH2O em um pequeno copo de vidro usando um aquecedor de tungstênio até que esteja fervendo.
  2. Pese 37,5 mg de formatação de uranyl e adicione a 5 mL de ddH2O aquecido para fazer uma solução de coloração forma 0,75% de uranyl. Mexa sob um béquer coberto de papel alumínio para proteger da luz.
  3. Adicione 4 μL de 10 M NaOH à solução de coloração e continue mexendo por 15 minutos, protegido da luz.
  4. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 mm em um tubo de ensaio.
  5. Use a descarga de brilho para tornar as redes EM contínuas revestidas de carbono hidrofílicas27.
    NOTA: As grades são colocadas dentro de uma câmara conectada a uma fonte de alimentação. Quando a alta tensão é aplicada, o gás dentro da câmara ioniza, e os íons carregados negativamente depositam nas redes de carbono para torná-los hidrofílicos.
  6. Corte e dobre uma tira de parafilm. Pipet 2 gotas de 40 μL do buffer de um lado do parafilme, e pipet outras 2 gotas de 40 μL de solução de coloração para o outro lado.
  7. Para fazer as redes de carbono EM, aplique 3 μL de amostra de proteína por 1 minuto.
  8. Borrida as grades contra um papel manchado.
    NOTA: As grades são lavadas 2x com tampão, e 1x com a solução de coloração de formação de 0,75% de uranyl apagada após cada etapa.
  9. Segure a superfície da rede na segunda queda de 0,75% de solução de coloração de formação de urano por 30 segundos.
  10. Borrique a grade contra um papel manchador para remover a solução de excesso de manchas e permitir que a rede seque ao ar.
  11. Armazene as grades da caixa da grade antes de fotografar.

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Resultados

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Purificação da proteína N0P livre de RNA
Com este protocolo, um complexo solúvel solúvel RSV N0P pode ser obtido em larga escala. A extensão total da parte terminal N e N das proteínas P foi co-expressa com 10X His-Tag na proteína N em E. coli. N0P foi purificado usando uma coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho. O N0P contém o terminal N e N de comprimento completo P, mas não continha RNA celular baseado na absorção...

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Discussão

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As conhecidas estruturas de partículas nucleocárides (NCLP) dos vírus RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) mostram que os NCLPs montados são o complexo N com RNAs celulares hospedeiros quando superexpressos em sistemas de expressão bacteriana ou eucariótica15,16,17,18,19. Estudos anteriores tentaram obter o RNA free N com uma variedade de métodos, com...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os programas de pesquisa no laboratório de Liang em Emory são apoiados pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos EUA (NIGMS), Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de premiação R01GM130950 e o Research Start-Up Fund da Emory University School of Medicine. O autor reconhece os membros do laboratório Liang por apoio útil e discussão crítica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseSIgmaA9539-500Gfazendo construção usando o método LIC
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15MilliporeUFC901024concentrar a amostra de proteína
Ampicilina sódicaGOLD BIOTECHNOLOGY5118.111317Aantibiótico para cultura de células
AseINEBR0526Sfazendo construção usando o método LIC
Cobalto (Alta densidade) Agarose BeadsGold BioH-310-500Para purificação da proteína His-tag
Corning LSE Digital Dry Bath HeaterCORNING6885-DBAqueça a amostra
dCTPInvitrogen10217016construção usando o método LIC
dGTPInvitrogen10218014construção usando o método LIC
GlicerolSigmaG5516-4Lsolução de fabricação
HEPESSigmaH3375-100Gsolução de fabricação
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25Purificação de proteínas
ImidazoleSigmaI5513-100Gsolução de fabricação
IPTG (Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo)GOLD BIOTECHNOLOGY1116.071717Ainduz a expressão de tubos de
microcentrífuga de proteínaVWR47730-598para PCR
Misonix Sonicator XL2020 Processador Ultrassônico de LíquidosSpectraLabMSX-XL-2020sonicator para células de lise
Grades de manchas negativasMicroscopia Eletrônica SciencesCF400--THPara fazer grades de manchas negativas
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000Agitador para cultura da célula
Nonidet P 40 SubstituaSigma74385-1Lque faz a solução
OneTaq DNA PolimeraseNEBM0480LPCR
QIAquick Kit de extração de gelQIAGEN28706Purificar DNA
SSPI-HFNEBR3132Sfazendo construção usando o método LIC
Superose 6 Aumento 10/300 GLSigmaGE29-0915-96Purificação de proteínas
T4 DNA polimeraseSigma70099-3fazendo construção usando o método LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus CentrifugeFisher Scientific36-101-0816Centrífuga, velocidade mais alta 20.000 rpm
Cloridrato de TrizmaSigmaT3253-250Gfazendo solução
microscopia eletrônicaformato de uranilo22451fazendo solução de coloração negativa
o de de Ciências

Referências

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