Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

Resumo

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N⁰) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Resumo

O uso de um modelo de RNA autêntico é fundamental para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA viral que pode guiar tanto a descoberta mecanicista quanto o desenvolvimento de ensaios em virologia. O modelo de RNA de vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS), como o vírus sincicial respiratório (RSV), não é apenas uma molécula de RNA, mas sim um complexo de ribonucleoproteína encapsidada por nucleoproteína. Apesar da importância do autêntico modelo de RNA, a geração e montagem de tal complexo ribonucleoproteína permanecem sofisticadas e requerem elucidação aprofundada. O principal desafio é que o RSV N superexpresso liga-se não especificamente às RNAs celulares para formar partículas aleatórias semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs). Aqui, estabelecemos um protocolo para obter N (N⁰⁾livre de RNA primeiro, co-expressando N com uma fosfoproteína acompanhante (P), depois montando n⁰ com oligos de RNA com a sequência de RNA específica do RSV para obter nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs). Este protocolo mostra como superar a dificuldade na preparação desse complexo tradicionalmente desafiador de ribonucleoproteína viral.

Introdução

Os vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) incluem muitos patógenos humanos significativos, como raiva, Ebola e vírus sincicial respiratório (RSV)^1,2. O RSV é a principal causa de doenças respiratórias, como bronquiolite e pneumonia em crianças pequenas e idosos em todo o mundo³. Atualmente, não há vacinas efetivas ou terapias antivirais disponíveis para prevenir ou tratar o RSV⁴. Como parte do ciclo de vida, o genoma RSV serve como modelo para replicação pela polimerase RNA dependente do RSV RNA para produzir um antígeno, que por sua vez atua como....

Protocolo

1. Clonagem molecular

NOTA: A Clonagem Independente de Ligase (LIC) foi usada para fazer um plasmídeo de coexpressão bi-cistronic RSV. LIC é um método desenvolvido no início da década de 1990, que utiliza a atividade Exo 3'-5' da polimerase de DNA T4 para criar saliências com complementaridade entre o vetor e a inserção de DNA^21,22. As construções foram feitas utilizando-se o DNA vetorial 2BT-10, que consiste em uma etiqueta de 10x no terminal N do Quadro de Leitura Aberto (ORF) (Figura 1).

1. Realize a linearização dos vetores L....

Resultados

Purificação da proteína N⁰P livre de RNA
Com este protocolo, um complexo solúvel solúvel RSV N⁰P pode ser obtido em larga escala. A extensão total da parte terminal N e N das proteínas P foi co-expressa com 10X His-Tag na proteína N em E. coli. N⁰P foi purificado usando uma coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho. O N⁰P contém o terminal N e N de comprimento completo P, mas não continha RNA celular baseado na absorção.......

Discussão

As conhecidas estruturas de partículas nucleocárides (NCLP) dos vírus RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) mostram que os NCLPs montados são o complexo N com RNAs celulares hospedeiros quando superexpressos em sistemas de expressão bacteriana ou eucariótica^{15,16,17,18,19}. Estudos anteriores tentaram obter o RNA free N com uma variedade de métodos, com.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	SIgma	A9539-500G	fazendo construção usando o método LIC
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15	Millipore	UFC901024	concentrar a amostra de proteína
Ampicilina sódica	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antibiótico para cultura de células
AseI	NEB	R0526S	fazendo construção usando o método LIC
Cobalto (Alta densidade) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	Para purificação da proteína His-tag
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Aqueça a amostra
dCTP	Invitrogen	10217016	construção usando o método LIC
dGTP	Invitrogen	10218014	construção usando o método LIC
Glicerol	Sigma	G5516-4L	solução de fabricação
HEPES	Sigma	H3375-100G	solução de fabricação
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Purificação de proteínas
Imidazole	Sigma	I5513-100G	solução de fabricação
IPTG (Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	induz a expressão de tubos de
microcentrífuga de proteína	VWR	47730-598	para PCR
Misonix Sonicator XL2020 Processador Ultrassônico de Líquidos	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonicator para células de lise
Grades de manchas negativas	Microscopia Eletrônica Sciences	CF400--TH	Para fazer grades de manchas negativas
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Agitador para cultura da célula
Nonidet P 40 Substitua	Sigma	74385-1L	que faz a solução
OneTaq DNA Polimerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Kit de extração de gel	QIAGEN	28706	Purificar DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	fazendo construção usando o método LIC
Superose 6 Aumento 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Purificação de proteínas
T4 DNA polimerase	Sigma	70099-3	fazendo construção usando o método LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Centrífuga, velocidade mais alta 20.000 rpm
Cloridrato de Trizma	Sigma	T3253-250G	fazendo solução
microscopia eletrônica	formato de uranilo	22451	fazendo solução de coloração negativa

o de de Ciências