Artigo de método

Fabricação de plataformas magnéticas para organização em escala de micron de neurônios interligados

DOI:

10.3791/62013

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14 de julho de 2021

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1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho apresenta uma abordagem de baixo para cima para a engenharia de forças magnéticas locais para o controle da organização neuronal. Células semelhantes a neurônios carregadas com nanopartículas magnéticas (MNPs) são banhadas no topo e controladas por uma plataforma micro-padronizada com magnetização perpendicular. Também são descritas caracterização magnética, captação celular MNP, viabilidade celular e análise estatística.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A capacidade de direcionar neurônios para redes neurais organizadas tem grandes implicações para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e bio-interligação. Muitos estudos têm como objetivo direcionar neurônios usando pistas químicas e topográficas. No entanto, os relatos de controle organizacional em escala de micron sobre grandes áreas são escassos. Aqui, um método eficaz foi descrito para colocar neurônios em locais predefinidos e orientar o crescimento neuronal com resolução em escala de micron, usando plataformas magnéticas incorporadas com elementos magnéticos micro-padronizados. Foi demonstrado que carregar neurônios com nanopartículas magnéticas (MNPs) os converte em unidades magnéticas sensíveis que podem ser influenciadas por gradientes magnéticos. Após essa abordagem, uma plataforma magnética única foi fabricada na qual as células PC12, um modelo comum semelhante a neurônios, foram banhadas e carregadas com nanopartículas superparammagnéticas. Filmes finos de multicamadas ferromagnéticas (FM) com magnetização perpendicular estável foram depositados para fornecer forças de atração eficazes em direção aos padrões magnéticos. Estas células PC12 carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, foram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. São apresentados métodos quantitativos de caracterização das propriedades magnéticas, captação de MNP celular, viabilidade celular e análise estatística dos resultados. Essa abordagem permite o controle da formação da rede neural e melhora a interface neurônio-eletrodo através da manipulação de forças magnéticas, que pode ser uma ferramenta eficaz para estudos in vitro de redes e pode oferecer novas direções terapêuticas biointerfacing.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A micropatters de neurônios tem grande potencial para a regeneração tecidual1,2,3,4,5 e o desenvolvimento de dispositivos neuroeletráticos6,7,8. No entanto, o posicionamento em escala de micron de neurônios em alta resolução espacial, como nos tecidos biológicos, representa um desafio significativo. A formação de estruturas pré-escaladas nesta escala requer a orientação dos processos de células nervosas controlando localmente a soma motilidade e o crescimento axonal. Estudos anteriores sugeriram o uso de pistas químicas e físicas9,10,11,12 para orientar o crescimento neuronal. Aqui, uma nova abordagem se concentra no controle do posicionamento celular por gradientes de campo magnético13,14,15,16,17, transformando células carregadas com MNPs em unidades sensíveis ao magnético, que podem ser remotamente manipuladas.

Kunze et al., que caracterizaram a força necessária para induzir respostas celulares usando células magnéticas carregadas de chip e MNP, provaram que o alongamento axonal precoce pode ser desencadeado pela tensão mecânica dentro das células18. Tay et al. confirmaram que substratos micro-fabricados com gradientes de campo magnético aprimorados permitem a estimulação sem fio de circuitos neurais dosados com MNPs usando corantes indicadores de cálcio19. Além disso, Tseng et al. coalesced nanopartículas dentro das células, resultando em forças localizadas mediadas por nanopartículas que se aproximavam da tensão celular20. Isso levou à fabricação de padrões definidos de substratos micromagnéticos que ajudaram a estudar a resposta celular às forças mecânicas. A tensão celular decorrente da aplicação de forças localizadas mediadas por nanopartículas foi alcançada por nanopartículas de coalizão dentro das células20. Um sistema híbrido complementar de óxido de metal (CMOS) microfluidic foi desenvolvido por Lee et al. que incorporaram uma matriz de micro-eletroímãs no chip CMOS para controlar o movimento de células individuais marcadas com contas magnéticas21.

Alon et al. usaram almofadas magnéticas em microescala, pré-programadas como "pontos quentes" magnéticos para localizar células22. Atividade específica também poderia ser estimulada dentro de células usando matrizes magnéticas micro-padronizadas para localização de nanopartículas em locais subcelulares específicos23. A absorção de MNP celular foi demonstrada com sucesso nos neurônios primários de sanguessuga, rato e rato24,25,26. Aqui, isso foi demonstrado em uma linha celular de feocromocitoma pc12 rato, que foi relatado anteriormente para mostrar alta absorção de MNPs27. Nos últimos anos, houve diversas aplicações médicas de MNPs, incluindo entrega de medicamentos e termoterapia em tratamentos oncológicos28,29,30,31. Especificamente, os estudos tratam da aplicação de MNPs e redes de neurônios32,33,34,35. No entanto, a organização magnética de neurônios usando MNPs em um nível de célula única merece uma investigação mais aprofundada.

Neste trabalho, uma abordagem de baixo para cima foi descrita para projetar forças magnéticas locais através de plataformas pré-projetadas para controlar o arranjo neuronal. A fabricação de padrões em escala de micron de multicamadas FM foi apresentada. Esta estrutura multicamadas FM única cria magnetização perpendicular estável que resulta em forças de atração eficazes em direção a todos os padrões magnéticos. Via incubação, os MNPs foram carregados em células PC12, transformando-as em unidades sensíveis magnéticas. As células carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, eram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. Vários métodos foram descritos para caracterizar as propriedades magnéticas das multicamadas FM e dos MNPs, e técnicas de captação de MNP celular e ensaios de viabilidade celular também foram apresentadas. Além disso, parâmetros morfométricos de crescimento neuronal e análise estatística dos resultados são detalhados.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Realize todas as reações biológicas em um armário de biossegurança.

1. Fabricação de plataformas magnéticas

  1. litografia
    1. Corte os slides de vidro em 2 x 2 cm2 usando uma caneta escribra. Limpe as lâminas de vidro em acetona e, em seguida, isopropanol por 5 min cada em um banho de ultra-sônicação. Seque com nitrogênio de pureza ultra-alta (UHP).
    2. Cubra o vidro com fotoresistia usando revestimento de spin a 6.000 rpm por 60 s, para atingir 1,5 μm de espessura, e asse a 100 °C por 60 s. Exponha a amostra a uma fonte de luz, usando um comprimento de onda apropriado para fotoresist, com um padrão desejado, usando uma máscara ou litografia sem máscara.
    3. Desenvolver para 40 s em um desenvolvedor, diluído em água destilada (DW) de acordo com as instruções do fabricante; lavar em DW para 45 s, e secar com gás nitrogênio UHP. Inspecione o padrão sob um microscópio óptico.
  2. Depoimento de Sputter
    1. Insira a amostra na câmara principal do sistema de deposição e aguarde a pressão base (~5 × 10-8 Torr). Abra o fluxo de gás; definir o fluxo de argônio para sputtering padrão (28 sccm [cm cúbico padrão por min) aqui. Aclaça os alvos do sputter e, em seguida, coloque a pressão do sputter para 3 mTorr.
    2. Aumente a potência em cada alvo até que a taxa desejada seja alcançada.
      NOTA: Taxa de PD: 0,62 A/s = 1,0 nm em 16 s; Co80Fe20 Taxa: 0,32 A/s, 0,2 nm em 6,25 s.
    3. Ligue a rotação. Deposite a multicamadas FM, alternando entre as metas Co80Fe20 e Pd, abrindo e fechando as persianas alvo, respectivamente. Deposite 14 bicamadas de Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm), e finalize com uma camada adicional de tampa de Pd de 2 nm.
    4. Decolagem: Mergulhe a amostra em acetona por 30 minutos e enxágue com isopropanol. Em seguida, seque com nitrogênio UHP, e mantenha a amostra em um ambiente limpo e seco até usar.

2. Caracterização do dispositivo magnético através de medições de transporte

  1. Use um substrato Si ou lâmina de vidro com uma barra magnética em forma cruzada de 100 μm de largura, depositada com multicamadas FM (ver 1C inset). Conecte a amostra ao suporte usando fita dupla face.
  2. Usando um conectador de arame, ligue 4 fios à amostra, um em cada perna do eletrodo cruzado. Defina o porta-amostras e a amostra dentro do sistema de medição de transporte com um campo magnético para que o campo magnético seja perpendicular à amostra. Realizar medições em temperatura ambiente.
  3. Realizar a medição da tensão transversal (VT)do dispositivo; seguir as marcas na Figura 1C (inset): aplicar uma corrente de 1 mA entre os contatos 1 e 3; medir o VT entre os contatos 2 e 4; em seguida, aplique uma corrente entre 2 e 4 e meça a tensão entre 1 e 3. Por fim, calcule a diferença entre as tensões das medições e divida por 2 para obter VT. Use um sistema de comutação para alterar automaticamente entre as duas configurações de medição.
  4. Varrer o campo magnético entre 0,4 T e -0,4 T em passos de 5 mT e medir o VT em função do campo. Plote a resistência transversal (VT/I) vs. o campo magnético para determinar o sinal de Hall anômeo, que é proporcional à magnetização perpendicular no filme.

3. Caracterização de MNPs e multicamadas magnéticas por medições de magnetometria

  1. Medição magnetométrica para multicamadas FM
    1. Deposite a multicamadas FM no substrato Si (ver seção 1.2). Corte a amostra em 6 quadrados de tamanho de 4 x 4 mm2. Empilhe as amostras uma em cima da outra e organize-as na cápsula perpendicular à direção do campo magnético (ver 1D inset da Figura 1D).
    2. Insira a cápsula no magnetômetro e meça a magnetização à temperatura ambiente. Varrer o campo magnético entre -0,4 T e 0,4 T.
    3. Calcule o volume total do material magnético, considerando a espessura da camada magnética, o tamanho das amostras e o número de substratos. Divida a magnetização pelo volume total do material magnético.
    4. Plote a magnetização (por volume de unidade) versus o campo magnético. Subtrair o fundo diamagnético do substrato a partir da resposta de campo magnético elevado e extrapolar a magnetização de saturação da FM do gráfico.
  2. Medição magnetométrica para MNPs
    1. Insira uma massa designada de MNPs em uma cápsula de polímero sintético. Considere um volume maior se medir pequenos valores de saturação de magnetização.
    2. Se os MNPs forem suspensos em um solvente, seque os MNPs deixando a cápsula aberta durante a noite. Insira a cápsula no magnetômetro e meça a magnetização à temperatura ambiente. Varrer o campo magnético entre -0,2 T e 0,2 T.
    3. Calcule a massa total dos MNPs multiplicando o volume designado pela concentração de partículas. Normalize os resultados para 1 g.
    4. Plote a magnetização normalizada (por grama) versus o campo magnético. Extrapolar a saturação de magnetização dos MNPs do gráfico.

4. Protocolo de revestimento de colágeno

  1. Revestimento de pratos plásticos
    1. Prepare 0,01 M HCl adicionando 490 μL de HCl a 500 mL de água autoclavada dupla destilada (DDW).
      NOTA: Realize esta etapa apenas na coifa química.
    2. Colágeno diluído tipo 1 (solução da cauda de rato) 1:60-1:80 em 0,01 M HCl para obter a concentração final de trabalho de 50 μg/mL. Coloque 1,5 mL da solução diluída em um prato de cultura de 35 mm. Deixe o prato no capô por 1h, coberto.
    3. Remova a solução e lave 3x em salina estéril tamponada com fosfato (PBS). O prato está pronto para semeadura celular.
  2. Lâminas de vidro de revestimento
    1. Diluir o colágeno tipo 1 (solução da cauda de rato) 1:50 em 30% v/v de etanol. Para revestir um prato de 35 mm, adicione 20 μL de colágeno a 1 mL de 30% de etanol.
    2. Cubra o prato com a solução, e espere até que toda a solução evaporar, deixando o prato descoberto por algumas horas. Lave 3x em 1x PBS estéril; o slide de vidro está pronto para semeadura celular.

5. Captação e viabilidade de MNP celular

  1. Captação de MNP celular
    1. Prepare o meio básico de crescimento para a cultura celular PC12 adicionando 10% de soro de cavalo (SH), 5% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio do Roswell Park Medical Institute (RPMI) e filtro usando um filtro de nin nin alumínio de 0,22 μm.
    2. Adicione 1% de soro de cavalo (HS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio RPMI para preparar o meio de diferenciação do PC12 e filtro usando um filtro de ninfa de 0,22 μm.
    3. Cultivar células em um frasco de cultura não tratada com 10 mL de meio básico de crescimento; adicionar 10 mL de meio de crescimento básico ao frasco a cada 2-3 dias, e subcultura as células após 8 dias.
    4. Para captação celular, centrifugar a suspensão celular em um tubo de centrífuga por 8 min a 200 × g e temperatura ambiente, e descartar o sobrenante.
    5. Resuspense as células em 3 mL de meio de crescimento básico fresco. Novamente, centrifugar a suspensão celular por 5 min a 200 × g e temperatura ambiente, e descartar o supernasce. Resuspense as células em 3 mL de meio de diferenciação fresco.
    6. Aspire as células 10x usando uma seringa e uma agulha para quebrar aglomerados celulares. Conte as células usando um hemótmetro, e sementes 106 células em um prato regular não revestido de 35 mm.
    7. Adicione ao prato o volume calculado de suspensão MNP e volume de meio de diferenciação para alcançar a concentração MNP desejada e o volume total. Misturar as células, MNPs e meio de diferenciação; incubar o prato em uma incubadora umidificada de CO2 de 5% a 37 °C por 24 h.
    8. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 200 × g à temperatura ambiente, e descartar o sobrenatante. Resuspend as células em 1 mL de meio de diferenciação fresco, e conte as células usando um hemótmetro.
  2. Diferenciação celular carregada por MNP
    1. Executar o protocolo de captação (seção 5.1). Semente 8 × 10 células carregadas de4 MNP em um prato revestido de colágeno de 35 mm na presença de meio de diferenciação (ver protocolo de revestimento de colágeno na seção 4.1). Após 24 h, adicione 1:100 novo fator de crescimento beta-nervo murine (β-NGF) (concentração final 50 ng/mL).
    2. Renove o meio de diferenciação e adicione murine fresco β-NGF a cada 2 dias. Imagem das células a cada 2 dias usando microscopia óptica. Após a formação da rede (6-8 dias para células PC12), imagem as células usando microscopia confocal, e observe a fluorescência das partículas.
  3. Ensaio de viabilidade para células carregadas de MNP: 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) teste de viabilidade celular.
    1. Prepare o meio básico de crescimento de acordo com a etapa 5.1.1. Cultivar as células PC12 com MNPs em diferentes concentrações (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL em meio de crescimento básico) e também sem MNPs para o controle em triplicado em uma placa plana de 96 poços (volume total de 100 μL/well). Incubar as células por 24 h em um CO2de 5%, incubadora umidificada a 37 °C.
    2. Prepare poços em branco contendo meio sem células para correção de fundo. Descongele a solução de reagente XTT e a solução dereação contendo sulfato de metila) em um banho de 37 °C imediatamente antes do uso. Gire suavemente até obter soluções claras.
    3. Para uma placa de 96 poços, misture 0,1 mL de solução de ativação com 5 mL de reagente XTT. Adicione 50 μL da solução de reação a cada poço, agite ligeiramente a placa para uma distribuição uniforme do corante nos poços e, em seguida, incubar a placa em uma incubadora por 5h.
    4. Meça a absorvância da amostra contra os poços em branco usando um leitor de ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) a um comprimento de onda de 450 nm. Meça a absorvância de referência usando um comprimento de onda de 630 nm e subtraia-a da medição de 450 nm.
    5. Como uma leve absorvância espontânea ocorre no meio de cultura incubado com o reagente XTT a 450 nm, subtrair a absorção média dos poços em branco dos outros poços. Subtrair valores de sinal de amostras paralelas de MNPs nas mesmas concentrações testadas que as amostras de células.
  4. Ensaio de viabilidade para células carregadas de MNP: teste de viabilidade celular baseado em resazurina
    1. Prepare o meio de crescimento básico de acordo com a etapa 5.1.1. Cultivar as células PC12 com MNPs em diferentes concentrações (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL em meio de crescimento básico) e sem MNPs como controle em triplicado em uma placa plana de 96 poços por 24 horas. Incubar as células por 24 h em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. Prepare poços em branco contendo meio sem células.
    2. Lave as células com 1x PBS. Adicione o reagente à base de resazurina (10% c/v) ao médio e incubar por 2h em uma incubadora de 37 °C.
    3. Coloque 150 alíquotas de μL das amostras no leitor ELISA e meça a absorvância em um comprimento de onda de excitação de 560 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. Subtrair os valores de sinal das amostras paralelas de MNPs nas mesmas concentrações testadas que as amostras de células.

6. Caracterização da concentração de MNP dentro das células usando plasma acoplado indutivamente (ICP)

  1. Prepare o meio de crescimento básico de acordo com a etapa 5.1.1. Cultivar as células PC12 com MNPs em diferentes concentrações (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL em meio de crescimento básico) e sem MNPs como controle em triplicado em uma placa plana de 96 poços (volume total de 100 μL/well). Incubar em 5% de CO2, incubadora umidificada a 37 °C por 24 h.
  2. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga (de cada poço separadamente), células centrífugas a 200 × g por 5 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenante. Resuspend as células em 1 mL de meio de diferenciação fresco, e conte as células usando um hemótmetro.
  3. Lise as células por tratamento com 100 μL de ácido nítrico de 70% para cada poço separadamente por pelo menos 15 minutos. Adicione 5 mL de DDW às células líssedas e filtre as soluções.
  4. Meça a concentração de ferro usando ICP e use a contagem celular para registrar concentração fe por célula.

7. Diferenciação celular e crescimento em plataforma magnética

  1. Limpe o substrato padronizado com 70% v/v/ etanol e coloque o substrato em um prato de cultura de 35 mm no capô. Coloque um grande ímã (~1500 Oe) abaixo do substrato padronizado por 1 min e remova o ímã movendo primeiro o prato para cima e para longe do ímã, e depois tire o ímã do capô. Ligue a luz ultravioleta por 15 minutos.
  2. Cubra o substrato com colágeno tipo 1 de acordo com a seção 4.2. Suspenda as células após a captação de MNP celular (seção 5.1), semente 105 células em um prato de cultura de 35 mm e adicione 2 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em 5% de CO2,incubadora umidificada a 37 °C.
  3. Após 24 h, adicione 1:100 murine fresco β-NGF (concentração final de 50 ng/mL). Renove o meio de diferenciação e adicione murine fresco β-NGF a cada 2 dias. Imagem das células a cada 2 dias usando microscopia leve, e após a formação da rede, realiza imunossagens nas células (seção 8.1).

8. Coloração celular carregada por MNP

  1. Imunostaining tubulin
    1. Prepare 4% de solução paraformaldeída (PFA) misturando 10 mL de solução PFA de 16% c/v, 4 mL de PBS 10x e 26 mL de DDW. Prepare 50 mL de 1% PBT adicionando 500 μL de um surfactante não iônico a 50 mL de 1x PBS. Prepare 50 mL de 0,5% PBT misturando 25 mL de 1% PBT com 25 mL de 1x PBS. Prepare a solução de bloqueio misturando 1% de albumina de soro bovino e 1% de soro de burro normal em 0,25% PBT.
      NOTA: Use PFA somente dentro da capa química.
    2. Remova o meio supernante das células. Fixar as células carregadas de MNP em 4% pfa por 15 minutos à temperatura ambiente dentro de um capô químico. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem, dentro de uma capa química.
    3. Permeabilize as células carregadas de MNP com 0,5% de PBT por 10 min. Incubar as células carregadas de MNP primeiro na solução de bloqueio por 45 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, com anticorpo anti-α-tubulin de coelho na solução de bloqueio durante a noite a 4 °C. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem.
    4. Incubar as células carregadas de MNP com anticorpo anti-coelho de burro conjugado Cy2 por 45 minutos na escuridão e à temperatura ambiente. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem.
    5. Realize imagens confocal. Para tubulina, use um comprimento de onda de excitação de 492 nm e um comprimento de onda de emissão de 510 nm. Para os MNPs (rhodamina), use um comprimento de onda de excitação de 578 nm e um comprimento de onda de emissão de 613 nm.
  2. Coloração nuclear com 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI)
    1. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem. Remova o excesso de líquido ao redor da amostra, adicione 1 gota (~50 μL) de meio de montagem contendo DAPI para cobrir uma área de 22 mm x 22 mm, e incubar por 5 minutos na escuridão e à temperatura ambiente.
    2. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem. Realize imagens confocal. Para DAPI, use um comprimento de onda de excitação de 358 nm e um comprimento de onda de emissão de 461 nm. Para os MNPs (rhodamina), use um comprimento de onda de excitação de 578 nm e um comprimento de onda de emissão de 613 nm.

9. Medições e análises estatísticas

  1. Análise morfométrica da diferenciação celular carregada de MNP
    1. Para medir o número de intersecções a várias distâncias do corpo celular, adquira imagens de fase de células cultivadas até 3 dias após o tratamento com NGF.
      NOTA: Se feitas mais tarde, as células podem desenvolver redes, impedindo medições de resolução unicelular.
      1. Abra as imagens no programa de processamento de imagens, ImageJ, e use o plug-in NeuronJ, que permite um rastreamento de neurite semiautomático e medição de comprimento36. Usando o plug-in do rastreador neurite, rastreie os neurites e converta os dados em imagens binárias. Defina o centro da soma.
      2. Realize a análise de Sholl, disponível no plug-in NeuronJ. Defina o raio máximo. Repita o experimento três vezes. Analise mais de 100 células em cada experimento.
  2. Análise de localização celular
    1. Para determinar a porcentagem de células localizadas na área magnética após 3 dias de incubação, adquira imagens microscópicas confocal de células com e sem absorção de MNP. Use a coloração DAPI (seção 8.2).
    2. Conte manualmente as células no topo ou parcialmente em cima do padrão (células de toque) e das células que não são. Repita para três experimentos. Analise mais de 400 células com MNP e sem absorção.
    3. Calcule a proporção relativa das células que estão no topo dos padrões magnéticos do número total de células, com e sem MNPs. Além disso, calcule a porcentagem da área efetiva do padrão magnético adicionando o diâmetro do corpo celular à largura do padrão para determinar a probabilidade aleatória de as células pousarem em um padrão magnético.
    4. Realize uma única amostra Z-teste para analisar se a distribuição celular é resultado de pouso de células isotrópicas, ou se há um viés preferido para o padrão magnético.
  3. Análise de direcionalidade de crescimento
    1. Para quantificar o efeito sobre a direcionalidade do crescimento do neurite, adquira imagens microscópicas confocal das células com e sem tratamento MNP após 8 dias de incubação. Realizar imuno-coloração (seção 8.1).
    2. Usando o software ImageJ, meça o ângulo entre o neurite celular e as listras magnéticas em ambas as condições.
      NOTA: Analise apenas os neurites originários das somas localizadas nas listras magnéticas.
    3. Plote a distribuição dos ângulos dos neurites em relação à direção das listras (Δφ). Realize um teste qui-quadrado da distribuição de Δφ para demonstrar que a distribuição não é normal ou uniforme.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plataformas magnéticas com diferentes formas geométricas foram fabricadas(Figura 1A). Os padrões magnéticos foram depositados por sputtering: 14 multicamadas de Co80Fe20 e Pd, 0,2 nm e 1 nm, respectivamente. A microscopia eletrônica revelou a altura total dos padrões magnéticos a ~18 nm(Figura 1B). Esta deposição multicamada FM única cria uma plataforma estável com anisotropia de magnetização perpendicular (...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os resultados representativos demonstram a eficácia da metodologia apresentada para controlar e organizar a formação da rede neuronal na escala de míccros. As células PC12 carregadas por MNP permaneceram viáveis e foram transformadas em unidades sensíveis magnéticas que foram atraídas pelas forças magnéticas dos eletrodos FM para locais específicos. Isso é melhor demonstrado na Figura 5C,onde as células preferencialmente aderiram aos vértices maiores dos hexágonos e não às linhas finas. Além...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência & Tecnologia, Israel, e pela Fundação israelense de Ciência (569/16).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução aquosa de paraformaldeído (formaldeído) a 16%ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
Placa de cultura de células de 6 poçosFALCON353846
Placa de cultura de células de 96 poçosSPL life sciences30096
Solução de anfotericina BBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H fotorresistenteMicroChemicals
AZ 351 B desenvolvedorMicroChemicals GmbH
Albumina de soro bovino (BSA)Biological Industries03-010-1B
Frasco de cultura de células e tecidosBiofilTCF00225075,0 cm^2 250 mL Tampa de ventilação, não tratada
Placa de cultura de célulasGreiner Bio-One627-160 Kit dede 35 mm
(baseado em XTT)Biological Industries20-300-1000
Tubo de centrífugaBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% alvo de pulverização catódicaACI Alloys99.95%
Collagen tipo ICorning Inc.354236Cauda de rato, faixa de concentração 3-4 mg/mL
Microscópio confocalLeicaTCS SP5
Cy2-conjugado AffiniPure Donkey Anticorpo secundário anti-coelhoJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Agulha descartávelKDL23 G
Seringa descartável Medispo116022764010 mL
Soro de cavalo doadorBiological Industries04-124-1A
Leitor ELISAMerk MilliporeBioTek synergy 4 híbrido leitor de microplacas
Etanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Etanol absoluto (Desidratado)Biolab-chemicals52505
Soro bovino fetal (FBS)Indústrias Biológicas04-127-1A
Eletroímã murino fresco β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Ácido clorídrico 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Plasma indutivamente acoplado (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley fonte-medida Keithley2400
Keithley sistema de comutação Keithley3700
L-glutaminaBiological Industries03-020-1B
Microscópio ópticoLeicaDMIL LED
Fotolitografia sem máscaraHeidelberg Inst.MLA150
Microscópio SlidesBAR-NAORBN1042000C
Ácido nítrico 70%Sigma-Aldrich438073
Soro de burro normal (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507 / 1LD
PC12 linha celularATCCCRL-1721
Pd alvo de pulverização catódicaACI ligas99,95%
Solução de penicilina-estreptomicina nistatinaBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue reagente de viabilidade celularSondas molecularesA-13261à base de resazurina
para &alfa;-tubulinaSanta Cruz Biotechnology, Inc.
Sistema de pulverização catódica de magnetron RFOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 com l-glutaminaBiological Industries01-100-1A
Banho de sonicaçãoKUDOSSK3210HPFrequência: 53 kHz. Potência ultrassônica: 135 W
Magnetômetro SQUIDQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEXINTERNATIONAL 1279surfactante não iônico
XTT reagente
GmbH proliferação celular anticorpo de coelho de viabilidade celular

Referências

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