Artigo de método
Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.
Medições precisas da heterogeneidade entre e dentro da tensão nas taxas de crescimento microbiano são essenciais para a compreensão de insumos genéticos e ambientais na tolerância ao estresse, patogenicidade e outros componentes-chave da aptidão. Este manuscrito descreve um ensaio baseado em microscópio que rastreia aproximadamente 105 microcolônias de Saccharomyces por experimento. Após a imagem automatizada de lapso de tempo de levedura imobilizada em uma placa multiwell, as taxas de crescimento de microcolonia são facilmente analisadas com software personalizado de análise de imagem. Para cada microcolonia, a expressão e a localização de proteínas fluorescentes e a sobrevivência do estresse agudo também podem ser monitoradas. Este ensaio permite uma estimativa precisa das taxas médias de crescimento das cepas, bem como uma medição abrangente da heterogeneidade no crescimento, expressão genética e tolerância ao estresse dentro das populações clonais.
Fenótipos de crescimento contribuem criticamente para o condicionamento físico da levedura. A seleção natural pode distinguir eficientemente entre linhagens com taxas de crescimento diferidas pelo inverso do tamanho populacional efetivo, que pode exceder 108 indivíduos1. Além disso, a variabilidade das taxas de crescimento entre indivíduos dentro de uma população é um parâmetro evolutivamente relevante, pois pode servir de base para estratégias de sobrevivência como cobertura de apostas2,3,4,5,
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1. Preparação de placas aleatórias (antes do Dia do Experimento)
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A novidade deste protocolo é que a taxa de crescimento pode ser calculada para células individuais dentro de uma população, rastreando seu crescimento em microcolônias através de imagens de lapso de tempo(Figura 2A). Como as microcolônias crescem por muitas horas de forma planar devido à presença de concanavalina A, suas áreas podem ser rastreadas ao longo do experimento, e um ajuste linear à mudança no tronco natural da área ao longo do tempo pode ser usado para calcular a taxa de crescimen.......
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O protocolo descrito aqui é um ensaio versátil que permite que o crescimento celular e a expressão genética sejam monitorados simultaneamente ao nível de microcolônias individuais. A combinação dessas duas modalidades produz insights biológicos únicos. Por exemplo, trabalhos anteriores usaram este ensaio para mostrar uma correlação negativa entre a expressão do gene TSL1 e a taxa de crescimento da microcolonia em células selvagens isogênicas medindo simultaneamente7,
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Os autores não têm nada a revelar.
Agradecemos a Naomi Ziv, Sasha Levy e Shuang Li por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo, David Gresham por equipamentos compartilhados, e Marissa Knoll por ajuda na produção de vídeo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde do Instituto R35GM118170.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais Gerais | |||
| 500 mL Filtro de Garrafa .22 µ m Esterilização PES, Baixa Ligação a Proteínas, com Pescoço de 45mm | Fisher | CLS431154 | usado para filtrar o meio |
| BD Falcon*Placas de Cultura de Tecidos, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | Tubos de cultura de 96 poços usados para congelar células, células pré-crescidas e diluições |
| Seringas BD sem Agulha, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Usado para filtrar os |
| Reservatórios de Reagentes Descartáveis Estéreis Concanavalin A Costar | Fisher | 07-200-127 | usados para pipetar soluções com pipeta multicanal |
| Fita de vedação de alumínio Costar Thermowell | Fisher | 07-200-684 | Vedação de placa de 96 poços para pré-crescimento e congelamento |
| fiapos e estática Kimwipes | Fisher | 06-666A | toalhetes livres de fiapos e estática para manter o fundo da placa do microscópio livre de detritos e arranhões |
| Filtros | de seringa NalgeneThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μ tamanho do poro m, 25 mm de diâmetro; usado para filtrar solução de concanavalina A |
| Componentes de mídia | |||
| alternativos de mídia quimicamente definida mínima (MD; 2% de glicose) | usados para pré-crescimento e crescimento de levedura durante a microscopia | ||
| de mídia sintética completa (SC; 2% de glicose) | usados para pré-crescimento e crescimento de levedura durante a microscopia | ||
| Extrato de levedura-peptona-dextrose (YEPD; 2% de glicose) crescimento celular médio | antes do congelamento de placas aleatórias | ||
| Materiais de microscopia | |||
| Membrana de vedação Breathe-Easy | Membranas respiráveis Millipore Sigma | Z380059-1PAK | usadas para selar a placa durante o experimento de microscopia. Nesta fase, as membranas respiráveis são recomendadas porque evitam a condensação nos poços e permitem melhores imagens de microscopia |
| Placa de microscópio com fundo de vidro transparente plano de 96 poços | microscópio | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L |
| Concanavalina A de canavalia ensiformis (Jack Bean), pó liofilizado | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Faça 5x solução de concanavalina A e congele 5ml de 5x concanavalina A em tubos cônicos de 50 mL a -80 & C |
| cepas usadas | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Cepas de acúmulo de mutação haplóide em fundo de laboratório, descritas em Hall e Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progênie da cepa ancestral de acumulação de mutação Hall e Joseph 2010, transformada com YFR054cΔ::Scw11P: :GFP | ||
| Equipamento | |||
| Misonix Sonicator S-4000 com fixação | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E com sistema | Microscópio invertido com platina automatizada e sistema de foco automático |
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