Artigo de método

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

DOI:

10.3791/62041

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16 de junho de 2021

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1Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 2Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 3Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Resumo

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Eventos associados à maturação nuclear oócito foram bem descritos. No entanto, muito menos se sabe sobre as vias moleculares e processos que ocorrem no citoplasma em preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Durante a maturação do oócito, as mudanças na expressão genética dependem exclusivamente da tradução e degradação das RNAs (mRNAs) do mensageiro materno, em vez da transcrição. A execução do programa translacional, portanto, desempenha um papel fundamental no estabelecimento da competência de desenvolvimento oócito para sustentar o desenvolvimento de embriões. Este artigo faz parte de um foco na definição do programa de tradução materna de mRNA que ocorre durante a maturação meiotica e na transição oócito-zigoto. Neste artigo de método, é apresentada uma estratégia para estudar a regulação da tradução de mRNAs-alvo durante a maturação in vitro oócito. Aqui, um repórter Ypet é fundido à região não traduzida (UTR) de 3' do gene de interesse e, em seguida, micro-injetado em oócitos juntamente com codificação mRNA poliadenilada para mCherry para controlar o volume injetado. Usando microscopia de lapso de tempo para medir o acúmulo de repórteres, as taxas de tradução são calculadas em diferentes transições durante o maturação meiotic oócito. Aqui, os protocolos de isolamento e injeção de oócitos, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos, usando o repórter Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR como exemplo.

Introdução

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Um oócito mamífero totalmente cultivado sofre mudanças rápidas na preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Essas mudanças são essenciais para sustentar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. Embora os eventos associados à maturação nuclear sejam relativamente bem descritos, muito menos se sabe sobre os processos moleculares e caminhos no citoplasma oócito. Durante os estágios finais da maturação do oócito, os oócitos são transcricionalmente silenciosos, e a expressão genética é inteiramente dependente da tradução e degradação do mRNA1,2. A síntese de proteínas críticas para a compet....

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Protocolo

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Os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em São Francisco (protocolo AN182026).

1. Preparação de mídia

  1. Adicione todos os componentes, conforme descrito na Tabela 1,para tornar a média de maturação básica da coleta de oócitos e oócitos. Para o meio de coleta básica, defina o pH para 7,4. Para o meio de coleta e maturação, adicione 3 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e 1 μM cilostamida no dia do uso.

2. Preparação de codificação mRNA para UTR Ypet-3' e mCherry

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    Resultados

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    Os oócitos desnudados prophase I-arrested de ratos C57/BL6 de 21 dias de idade foram injetados com uma mistura de repórter contendo mRNA codificando o repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7 e mRNA codificação mCherry. YFP e mCherry expressão foi registrado em 39 oócitos, dos quais 30 foram amadurecidos, e 9 foram presos em prophase I como um controle negativo. Três oócitos maduros foram excluídos para análise por terem um GVBD atrasado (N=2) ou movidos no prato durante a gravação (N=1). A Figura .......

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    Discussão

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    O método apresentado descreve uma estratégia para estudar a ativação e a repressão da tradução do mRNA alvo em diferentes transições durante a maturação meiotic in vitro oocito. IL-7, uma citocina liberada pelo oócito que pode estar envolvida na comunicação celular oócito-cumulus8,13, foi escolhida com o propósito de descrever este método. O IL-7 é conhecido por ser cada vez mais traduzido durante a maturação do oócito8 e permite .......

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    Divulgações

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    Os autores não declaram conflitos de interesse.

    Agradecimentos

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    Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM097165, GM116926 e Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 para Marco Conti. Enrico M. Daldello foi apoiado por uma bolsa da Fundação Lalor e Natasja G. J. Costermans foi apoiada por uma bolsa Rubicon da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO).

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Preparação de meios
    Albumina de Soro Bovino em Pó BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
    CilostamidaEMD Millipore231085
    MEM alphaGibco12561-056
    Mínimo Essencial Médio Águia Sigma-AldrichM2645
    Penicilina-Estreptomicina 100x Solução, Filtrada EstérilGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
    Bicarbonato de Sódio JT-Baker3506-1
    Piruvato de SódioGibco 11360-070
    Água destilada ultrapuraInvitrogen10977-015
    Preparação de mRNA que codifica YFP/3' UTR e mCherry
    AgaroseApex Biomedical 20-102QD
    Sal dissódico de carbenicilinaSigma-AldrichC1389-1G
    Kit de clonagem Choo-ChooMcLabCCK-20
    CutSmart Buffer (10x)England BiolabsB7204
    (6x)Thermo ScientificR0611
    NewEngland BiolabsN0447S
    DpnINew England BiolabsR0176
    GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
    LB com 100 µ g/mL de carbenicilina, Teknova TeknovaL1010
    LB Médio (Cápsulas)MP Biomedicals3002-021
    MEGAclear Kit de Limpeza de Transcrição LifeTechnologiesAM1908
    MfeI-HF enzima de restriçãoNew England BiolabsR3589
    mMESSAGE mMACHINE T7 Kit de TranscriçãoInvitrogenAM1344
    Phusion DNA de Alta Fidelidade polimeraseNew England BiolabsM0530
    Poly(A) Kit de rejeitosInvitrogenAM1350
    QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
    QIAquickQiagen28704
    S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
    tampão TAE Apex Biomedical 20-193
    Solução de Brometo de Etídio UltrapuroLife Technologies15585011
    Coleta de oócitos
    Tubo de aspiração para micro-pipetas calibradasSigma-AldrichA5177-5EA
    Micro-pipetas calibradasDrummond Scientific Company2-000-025 
    PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
    Agulha PrecisionGlide 26 G x 1/2BD
    1 mlBD309659
    Microinjeção de oócitos
    35 mm Prato | Nº 0 Lamínula | Diâmetro do vidro de 20 mm | MatTekP35G-0-20-CPara microscopia de lapso de tempo
    Vidro de borossilicato com filamentoSutter InstrumentBF100-78-10
    Óleo para Cultura de EmbriõesIrvine Scientific9305
    Placade PetriFalcon 351006para microinjeção
    Placa de cultura de tecidosFalcon353001Para incubação de oócitos
    VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
    Software
    BiorenderBioRenderPreparação do Figure 1S
    MetaMorph, versão 7.8.13.0 Dispositivos Moleculares  Para microscopia de lapso de tempo, análise de translação UTR de 3' 
    Corante de carregamento de DNA New Solução dNTP Placas de Ágar Kit de Extração de Gel Seringa 305111 não revestido

    Referências

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
    2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigati....

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    Etiquetas

    Maternal mRNA TranslationOocyte MaturationSingle Oocyte AssayIn Vitro MaturationReporter AccumulationTime Lapse MicroscopyOocyte InjectionCumulus Oocyte ComplexTranslation RegulationYFP mCherry Ratio

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