Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.
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Artigo de método
Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD), um processo ativo da doença que vai desde o espessamento leve da válvula até a calcificação grave, está associada à alta mortalidade, apesar de novas opções terapêuticas como a substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR).
As vias completas que começam com a calcificação da válvula e levam a estenose aórtica grave permanecem apenas parcialmente compreendidas. Ao fornecer uma representação atenta das células válvulas aórticas in vivo, o ensaio de linfócitos T a partir do tecido da válvula estenótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação. Após a excisão cirúrgica, a amostra fresca da válvula aórtica é dissecada em pequenos pedaços e os linfócitos T são cultivados, clonados e analisados por meio de triagem celular ativada de fluorescência (FACS).
O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados também podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os resultados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações nas concentrações de células T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subtipos específicos de células T de interesse. Neste estudo, mostramos o isolamento das células T, realizado em amostras de válvula aórtica calcificada fresca e as etapas de análise de clones de células T usando citometria de fluxo para entender melhor o papel da imunidade adaptativa na fisiopatologia cavd.
Introdução
A doença da válvula aórtica calcífica (CAVD) é uma das doenças mais comuns da válvula cardíaca, com forte impacto na assistência à saúde. A frequência de substituição da válvula aórtica nos últimos anos aumentou drasticamente e espera-se que aumente ainda mais, devido à crescente população idosa1.
A fisiopatologia subjacente do CAVD é apenas parcialmente conhecida e as estratégias terapêuticas atuais estão limitadas a medidas conservadoras ou substituição da válvula aórtica, seja através de procedimentos cirúrgicos ou percutâneos. Até o momento, nenhum tratamento médico eficaz pode dificultar ou reverter a progressão....
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Protocolo
O estudo foi realizado de acordo com o Estatuto do Charité para Assegurar boas Práticas Científicas e respeitadas as diretrizes legais e disposições sobre privacidade e ética. O Comitê de Ética aprovou todos os experimentos humanos e a privacidade e o anonimato dos pacientes foram mantidos de acordo com as regras relatadas no Formulário de Ética.
NOTA: Para o protocolo descrito abaixo foram utilizadas amostras frescas de válvulas estenóticas humanas.
1. Preparação do reagente
- Prepare o meio completo RPMI enriquecido adicionando em RPMI 1640 Médio: aminoácidos não essenciais; Piruvato de Sódio, L-Glutami....
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Resultados
Utilizamos um método simples e econômico para caracterizar a população leucócito de amostras frescas de válvulas aórticas derivadas de pacientes humanos com estenose de válvula aórtica grave (consulte o protocolo). O método de isolar os PBMCs é um passo vital na obtenção de células alimentadoras, que são usadas em todas as etapas do experimento (clonagem, realimentação e divisão de fases) e permitem a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Os passos-chave deste método são mo.......
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Discussão
Aqui apresentamos um método para caracterizar subpopulações de linfócitos T isoladas de amostras de válvulas aórticas esténticas, utilizando citometria de fluxo. Este método requer o uso de casaco de buffy irradiado para isolar os PBMCs. A frequência de radiação à qual os sacos de casacos buffy devem ser submetidos é 9000 Rad/90 Gray (Gy) e representa um passo crucial para parar a proliferação das células alimentadoras. O papel das células isoladas dos sacos de casacos buffy é agir apenas como células alimentadoras e for.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Todos os sacos de casacos polidos usados para este protocolo foram irradiados graças à disponibilidade do Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer e toda a equipe do Departamento de Radiologia de Charité Benjamin Franklin. Bolsista/Mary Roxana Christopher, este trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos da Sociedade Cardíaca Alemã (DGK).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringas de plástico de 50 mL | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- poços Placas Multiwell de fundo em U | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (sem agulha) | Sigma | P6148 | Diluir a 4% com PBS |
| CD14 Violeta brilhante 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE& | nbsp; Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Violeta brilhante 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Violeta brilhante 510 | Tubo Eppendorf | 301047 | |
| 1,5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tubo 0,5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon Tubo de centrífuga cônico de 15 mL | Falcon | 10136120 | |
| Falcon Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL Falcon | 10788561 | ||
| Falcon Tubos de poliestireno de fundo redondo | BD | 2300E | |
| Leitura rápida 102 câmara de contagem de plástico | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filtros para meio de cultura 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filtros para meio de cultura 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Suplemento liofilizado | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| FBS Inativado por Calor (Soro Fetal Bovino) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Soro Humano) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Humano IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamina | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Solução de aminoácidos não essenciais | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldeído | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (fitohemaglutinina) | Célula-tronco Tecnologias | 7811 | |
| Placas de Petri de Plástico | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Mídia | HyClone | 15-040-CV | |
| Piruvato de sódio | Gibco da Life technologies | 11360070 | |
| Filtros de seringa 0,45µ l | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Balões de cultura de células | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Balão de cultura de células | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoetanol | Gibco | A2916801 |
Referências
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic....
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Reimpressões e permissões
