Artigo de método

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização

DOI:

10.3791/62067

⸱

23 de dezembro de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito fornece um protocolo para reação em cadeia de hibridização in situ (HCR) juntamente com a imunofluorescência para visualizar a síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA na linha celular e culturas tridimensionais (3D) do epitélio das vias aéreas humanas. O método permite uma visualização altamente específica e sensível do RNA viral, contando com o HCR iniciado pela localização da sonda. As sondas de iniciação dividida ajudam a amplificar o sinal por amplificadores fluorescentes rotulados, resultando em fluorescência de fundo insignificante na microscopia confocal. A rotulagem de amplificadores com diferentes corantes fluorescentes facilita o reconhecimento simultâneo de vários alvos. Isso, por sua vez, permite o mapeamento da infecção nos tecidos para entender melhor a patogênese viral e a replicação no nível unicelular. Acoplamento deste método com imunofluorescência pode facilitar uma melhor compreensão das interações hospedeiro-vírus, incluindo a alternância das vias de epigenome hospedeiro e resposta imune. Devido à tecnologia de HCR sensível e específica, este protocolo também pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico. Também é importante lembrar que a técnica pode ser modificada facilmente para permitir a detecção de qualquer RNA, incluindo RNAs não codificadas e vírus RNA que possam surgir no futuro.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2 é um novo betacoronavírus humano que surgiu no final de 2019, causando uma pandemia sem precedentes alguns meses depois. Como o vírus é novo na ciência, grande parte de sua biologia e seu impacto nas células hospedeiras permanecem desconhecidos. Portanto, mapear o tropismo de células vírus e tecidos durante a infecção é importante para que suas características biológicas básicas e seus efeitos sobre o hospedeiro sejam compreendidos. Várias técnicas são usadas para examinar a interação entre vírus, incluindo ensaios bioquímicos, biológicos e físicos. A hibridização in situ é um método comum que emprega dna complementar rotulado, RNA ou sondas de ácido nucleico modificado, que se localizam para sequências específicas de DNA ou RNA em uma célula ou tecido.

Foi desenvolvido um novo método de hibridização fluorescente de RNA (RNA-FISH) que incorpora modificações para aumentar a sensibilidade, amplificando a relação sinal-ruído através de um HCR1. O HCR permite o estudo da localização do RNA em um nível unicelular. Devido à sua alta especificidade, sensibilidade e resolução, este método é útil não apenas para estudos científicos básicos, mas também para projetos aplicativos, por exemplo, diagnósticos. Recentemente, foi demonstrada a viabilidade desse método para a detecção do RNA SARS-CoV-2 localizado em células ciliadas dentro de culturas de epitélio 3D (HAE) totalmente diferenciadas3D. As culturas hae constituem uma das ferramentas mais avançadas utilizadas para estudar a infecção viral no contexto do microambiente "infecção natural"3,4.

Vários relatórios sobre coronavírus humanos (HCoV), incluindo SARS-CoV-2, destacam a importância de modificações epigenéticas em relação à infecção por HCoV e à fisiopatologia [revisada em 5],por exemplo, o padrão de metilação do gene codificando o receptor de enzima conversor de angiotensina 2 (ACE-2)receptor 6,7. Curiosamente, a triagem em massa-espectrométrica identificou vários fatores epigenéticos que interagem com o proteome SARS-CoV-28. Mais especificamente, a proteína não estrutural 5 (NSP5) se liga ao regulador epigenético, histona deacetillase 2, e o catalítico inativo NSP5 (C145A) interage com o tRNA metiltransferase 1 (24). Além disso, a atividade de metiltransferase NSP16 é bloqueada pelo inibidor de metiltransferase, sinefungin9. No entanto, o papel exato desses fatores epigenéticos no COVID-19 ainda não está claro. A replicação do HCoV ocorre no citoplasma da célula infectada, e desencadeia respostas inflamatórias que são reguladas por modificações epigenéticas10.

Por exemplo, hCoV-229E afina a sinalização fator nuclear-kappa B e reprograma profundamente a paisagem de cromatina celular hospedeira aumentando a acetilação de H3K36 e H4K5 em certas regiões11. A infecção por coronavírus relacionada à síndrome respiratória do Oriente Médio aumenta os níveis de H3K27me3 e esgota o H3K4me3 nas regiões promotoras de subconjuntos de genes sensíveis a interferon específicos12. Além disso, o RNA viral desencadeia respostas imunes celulares, como demonstrado para os flavivírus13, retrovírus14,15e coronavírus16. Os marcadores epigenéticos no RNA viral podem desempenhar um papel no reconhecimento pelos sensores celulares, como mostrado para a metilação m7A do vírus da imunodeficiência humana-1 RNA17. No entanto, permanecem as perguntas: Qual é o impacto do RNA SARS-CoV-2 na resposta imune, e são marcas epigenéticas envolvidas?

Aqui, foi descrito um método RNA-FISH otimizado, juntamente com a análise de imunofluorescência de linhas celulares e tecidos 3D (HAE totalmente diferenciado). Embora métodos citológicos, como FISH e imunofluorescência, sejam amplamente utilizados, este método de hibridização in situ de nova geração baseado no HCR nunca foi utilizado para detecção de vírus (exceto em uma publicação recente)2. Em geral, imunostenções e PEIXEs requerem as seguintes etapas: permeabilização para permitir a penetração de sondas ou anticorpos; fixação em que o material celular é fixo e preservado; detecção em que anticorpos ou sondas de ácido nucleico são aplicadas; e, finalmente, montagem das amostras para visualização.

Embora os protocolos existentes compartilhem essas características gerais, elas variam significativamente em relação aos parâmetros envolvidos. Aqui, um protocolo otimizado, simples e imuno-RNA-FISH foi descrito para detectar RNA SARS-CoV-2 em culturas HAE e células Vero. A técnica compreende as seguintes etapas: (1) fixação de células com paraformaldeído; (2) permeabilização com detergente ou metanol (MeOH); (3) reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH (apenas culturas HAE); (4) detecção; (5) amplificação utilizando a tecnologia HCR para detectar RNA SARS-CoV-2; (6) imunostaining; e (7) imagens sob um microscópio confocal.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação do buffer

  1. Para 500 mL de tampão PHEM 2x, combinar 18,14 g de piperazina-N,N′-bis(2-ácido elfônico) (PIPES), 6,5 g de 4-(2-hidroxitila)-1-piper Ácido esulfônico de eazina (HEPES), 3,8 g de ácido tetraacético etileno glicol (EGTA) e 0,99 g de sulfato de magnésio (MgSO4). Faça o volume até ~400 mL com água destilada (dH2O), mexa e ajuste o pH para 7,0 usando hidróxido de potássio de 10 M (KOH) ou hidróxido de sódio (NaOH). Faça o volume final até 500 mL e, em seguida, divida em alíquotas de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário.
    NOTA: O buffer não estará claro até que o pH atinja 7,0.
  2. Prepare uma solução de estoque de 37% de paraformaldeído (PFA). Para 50 mL, misture 18,5 g de PFA e 35 mL de dH2O em uma garrafa de vidro. Coloque a garrafa em um agitador magnético com aquecimento. Adicione 900 μL de 1 M KOH ou NaOH, e mexa até que a solução fique clara. Deixe esfriar e transferir para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL; topo até 50 mL com dH2O. A solução pode ser armazenada a -20 °C até que seja necessária.
    NOTA: O formaldeído deve ser tratado em um capuz de fumaça enquanto usa luvas de proteção e um jaleco.
  3. Prepare o buffer de fixação (3,7% PFA tamponado com PHEM). Para 50 mL, combine 5 mL de solução PFA de 37%, 25 mL de tampão PHEM 2x e 20 mL de dH2O em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário.
    NOTA: Após o descongelamento, o buffer pode ser armazenado a 4 °C por até 3 meses.
  4. Preparar PBST (0,1% Tween-20 em 1x salina tamponada com fosfato [PBS]). Para 50 mL, adicione 50 μL de 100% Tween-20 a 50 mL de 1x PBS e misture bem.
    NOTA: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT).
  5. Prepare buffers de reidratação combinando MeOH/PBST em proporções de 3:1, 1:1 e 1:3 (volume final de 100 mL de cada; ver Tabela 1).
    NOTA: MeOH é muito tóxico e inflamável. Como pode danificar o nervo óptico, deve ser manuseado em um capô de fumaça evitando qualquer chama aberta. Como a mistura de MeOH e PBST gera uma reação extermática, combine as soluções no gelo.
  6. Para 1000 mL de 20x SSC, combine 175,3 g de cloreto de sódio (NaCl) e 88,2 g de citrato de sódio em um béquer, e encha com 800 mL de dH2O. Mexa até dissolver, e ajuste o pH para 7,2 usando NaOH. Adicione dH2O a um volume total de 1000 mL, e autoclave ou filtro através de um filtro de 0,22 μm em uma garrafa autoclaved.
  7. Para 50 mL de 5x SSCT, combine 12,5 mL de tampão SSC de 20x com 37,5 mL de dH2O e adicione 50 μL de 100% Tween-20. Misture bem.
  8. Para 50 mL de 50% 5x SSCT/50% PBST, combine 25 mL de 5x SSCT com 25 mL de PBST.
  9. Para 50 mL de 2x SSC, misture 5 mL de tampão SSC de 10x com 45 mL de dH2O. Misture bem.
    NOTA: Todos os buffers SSC devem ser armazenados em RT no escuro.

2. Definição de alvo, sondas e amplificadores

  1. Use as ferramentas disponíveis no site do fabricante para projetar amplificadores e sondas. Certifique-se de que as sondas são complementares à cadeia de DNA reversa do gene SARS-CoV-2 N(Figura Suplementar 1).
  2. Determine o melhor tamanho do conjunto da sonda (um conjunto de 20 sondas é suficiente para visualização).
  3. Defina os amplificadores usados para detecção de RNA de destino.
    1. Use o amplificador HCR B1 rotulado com Alexa Fluor 647.
      NOTA: Um amplificador HCR compreende pinos de cabelo HCR metastáveis h1 e h2. Experimentos multiplexados podem ser projetados usando este protocolo. Se isso for planejado, escolha um amplificador HCR diferente (B1, B2, ...) para que cada RNA alvo seja imagedo dentro da mesma amostra (por exemplo, amplificador B1 para o alvo 1, amplificador B2 para o alvo 2, ...).

3. Cultura celular e infecção com SARS-CoV-2

  1. Cultura Vero (células epiteliais renais de macaco) no meio de Águia modificado de Dulbecco contendo 5% de soro bovino fetal.
    1. Sementes 50.000 células em tampas (nº 1, 15 × 15 mm) em uma placa de 12 poços.
  2. Prepare culturas HAE totalmente diferenciadas como descrito18 em suportes permeáveis de inserção transwell com uma membrana (diâmetro = 6,5 mm) e cultura em meio de crescimento epitelial brônquico até totalmente confluente.
  3. Infecção por vírus
    1. Células inoculadas com SARS-CoV-2 a 1000x dose infecciosa da cultura tecidual mediana (TCID50) por mL
    2. Incubar células por 2 h a 37 °C.
    3. Lave as células duas vezes com PBS para remover o vírus não ligado.
    4. Células de cultura por 48 h.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH em células Vero cultivadas em deslizamentos de cobertura

DIA 1º

  1. Fixação e permeabilização de células
    1. Corrija células infectadas com solução PFA de 3,7% por 1 h no RT.
    2. Aspire a solução pfa de 3,7% e lave as células duas vezes usando 1x PBS.
    3. Permeabilize as células com solução PBST por 10 min em RT com agitação.
    4. Aspire o PBST e lave as células duas vezes com 1x PBS.
  2. detecção
    1. Aspire a solução 1x PBS e lave as células duas vezes com 2x SSC na RT.
    2. Aspire a solução 2x SSC e pré-hibridize as amostras adicionando pelo menos 300 μL de buffer de hibridização da sonda. Cubra os poços que contêm as células e incubar a 37 °C por 30 min.
    3. Prepare a solução da sonda adicionando 1,2 pmol de mistura de sonda ao buffer de hibridização da sonda.
      1. Use 1,2 μL do estoque da sonda de 1 μM para preparar 300 μL de estoque de trabalho.
    4. Remova a solução de pré-lubrificação e transfira as tampas para uma câmara umidificada.
      1. Pipeta 30-50 μL de solução de sonda em parafilm para formar gotículas individuais.
    5. Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) a 37 °C.

      DIA 2.
    6. Transfira as tampas de volta para uma placa de 12 poços e remova a solução de sonda em excesso lavando por 4 x 5 min com 400 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
      NOTA: Como alternativa para colocar alíquotas de 30-50 μl no parafilme e sob deslizamentos de cobertura para incubação, adicione 300 μL de solução de sonda diretamente para tampas em uma placa de 12 poços. Este procedimento é mais simples, mas requer quantidades substanciais de reagentes. Aqueça o tampão de lavagem da sonda a 37 °C antes de usar. Calcule a quantidade de tampão necessária e transfira-a para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL.
    7. Lave amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT na RT.
    8. Substitua a solução SSCT de 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.
  3. amplificação
    1. Remova a solução 1x PBS dos poços e adicione pelo menos 300 μL de tampão de amplificação a cada poço. Incubar as amostras por 30 minutos na RT.
    2. Prepare cada grampo de cabelo HCR (h1 e h2) resfriando o volume desejado em tubos separados.
      1. Para preparar 300 μL de solução de amplificação, utilize 18 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 300 μL, use 6 μL de uma solução de grampo de estoque de 3 μM).
      2. Transfira a solução do grampo de cabelo para tubos.
      3. Incubar a 95 °C para 90 s.
      4. Esfrie para RT por 30 minutos no escuro.
    3. Prepare uma mistura de grampos adicionando os grampos "h1" e "h2" refrigerados a snap ao tampão de amplificação.
    4. Coloque gotas de 30-50 μL de mistura de grampo de cabelo no parafilme.
    5. Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no escuro em RT.

      DIA 3.
    6. Transfira as tampas de volta para a placa de 12 poços e remova o excesso de grampos lavando por 5 x 5 min com 5x SSCT no RT com agitação.
    7. Aspire o buffer SSCT 5x e substitua-o por 1x PBS.
      NOTA: Se necessário, use as amostras de RNA-FISH em um ensaio padrão de imunofluorescência, seguido de coloração de núcleos (ver seção 5).
  4. Coloração nuclear e montagem de slides
    1. Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por 4′,6-diamidino-2-fenilômola (DAPI, 0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.
    2. Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
    3. Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
    4. Coloque duas gotas de 10 μL cada de meio de montagem; garantir que as gotas sejam separadas o suficiente para permitir que duas tampas sejam colocadas em um único slide.
    5. Remova o excesso de líquido tocando as tampas em uma toalha limpa e, em seguida, coloque-as em meio de montagem antifade com as células voltadas para baixo.
    6. Coloque as amostras montadas em uma superfície seca e plana no escuro e deixe-as curar.
    7. Após a cura, sele as bordas das tampas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH em culturas HAE

DIA 1º

  1. Fixação e permeabilização da cultura HAE
    1. Aspire o meio e corrija as células infectadas usando solução PFA de 3,7% por 1h no RT.
    2. Aspire a solução pfa de 3,7% e lave as células duas vezes com 1x PBS.
      1. Substitua a solução PFA de 3,7% por 1x PBS sob uma inserção Transwell.
    3. Descarte o PBS e desidrate as amostras usando lavagens de 2 x 5 min com 100% de MeOH pré-100% pré-20 °C.
    4. Após a segunda lavagem, substitua o tampão por MeOH fresco e refrigerado para permeabilização sob a pastilha Transwell. Armazene durante a noite a -20 °C.

DIA 2.

  1. reidratação
    Reidratar as amostras através de uma série classificada de soluções MeOH/PBST (cada uma por 5 min) no gelo: 75% MEOH/25% PBST, 50% MEOH/50% PBST, 25% MEOH/75% PBTS e 100% PBST (duas vezes).
    1. Lave as células por 5 minutos no gelo com 50% 5x SSCT/50% PBST.
    2. Lave as células por 5 minutos no gelo com 5x SSCT.
    3. Substitua o buffer SSCT 5x por 1x PBS.
  2. detecção
    1. Incubar as células (dentro da pastilha Transwell) por 5 minutos no gelo com 100 μL de tampão de hibridização da sonda. Em seguida, transfira a placa para incubadora por 30 min a 37 °C (pré-lubrificação).
      NOTA: O tampão de hibridização da sonda deve ser pré-aquecido a 37 °C antes de usar. Calcule o volume necessário: 100 μL é necessário para uma única inserção Transwell.
    2. Prepare a solução da sonda. Como 1 mL de solução de sonda requer 4 pmol de sonda, adicione 4 μL de solução de estoque de sonda de 1 μM a 1 mL de tampão de hibridização da sonda e misture bem.
      NOTA: Para detecção de RNA, use 100 μL de solução de teste por inserção Transwell. Deixe a solução da sonda no gelo até o final da etapa de pré-lubrificação.
    3. Remova a solução de pré-lubrificação e adicione a solução da sonda.
    4. Incubar as células durante a noite (12-18 h) a 37 °C.

      DIA 3.
    5. Remova o excesso de sonda lavando por 4 x 15 min com 100 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
    6. Lave as amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT no RT.
    7. Substitua o SSCT de 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.
  3. amplificação
    1. Preamplifice as amostras incubando-as com tampão de amplificação por 30 minutos no RT.
    2. Prepare cada grampo de cabelo resfriando os volumes desejados em tubos separados.
      1. Para preparar 500 μL de solução de amplificação, utilize 30 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 500 μL, use 10 μL de solução de grampo de estoque de 3 μM).
      2. Transfira a solução do grampo para os tubos.
      3. Incubar a 95 °C para 90 s.
      4. Esfrie para RT por 30 minutos no escuro.
    3. Prepare a solução de grampo de cabelo adicionando todos os grampos refrigerados a 500 μL de tampão de amplificação no RT.
    4. Remova a solução de pré-amplificação e adicione a solução completa do grampo.
    5. Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no RT no escuro.
    6. Remova o excesso de grampos lavando com 5x SSCT no RT da seguinte forma: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.
    7. Substitua a solução SSCT 5x por 1x PBS e armazene a 4 °C por não mais de 2-3 dias ou prossiga diretamente para a coloração nuclear.
      NOTA: Se necessário, use as amostras de RNA-FISH em um ensaio padrão de imunofluorescência, seguido de coloração nuclear (ver seção 6).
  4. Coloração nuclear e montagem de slides
    1. Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por solução DAPI (0,2 μg/mL) em PBS 1x.
    2. Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
    3. Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
    4. Coloque a membrana de corte das pastilhas Transwell em 10 μL de meio de montagem antifado com as células voltadas para cima e adicione meio de montagem extra (5 μL) à membrana.
    5. Cubra as membranas com tampas.
    6. Cure as amostras montadas em uma superfície seca e plana no escuro.
    7. Após a cura, sele as bordas das tampas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.

6. Análise de imunofluorescência de células Vero e culturas HAE

NOTA: Realize o ensaio de imunofluorescência no dia 3 para linhas celulares ou dia 4 para culturas HAE. Use uma abordagem diferente para cada modelo. Todas as diferenças são indicadas claramente.

  1. Aspire a solução 1x PBS dos poços.
  2. Bloqueie as amostras por incubação com 1% de g/v de gânbio bovino em solução PBST por 30 min a 37 °C.
  3. Prepare os anticorpos primários preparando diluições apropriadas na solução de bloqueio e incubar.
    1. Para células Vero em tampas:
      1. Coloque gotas (30-50 μL) de solução de anticorpos em parafilme em uma câmara de umidade.
      2. Coloque manchas nas gotas de anticorpos com as células viradas para baixo.
    2. Para HAE, substitua o agente de bloqueio nas pastilhas por solução de anticorpos (100 μL) e incuba as amostras em uma câmara umidificada.
      NOTA: Ajuste a hora e a temperatura de cada incubação com anticorpo primário. Os parâmetros típicos são 2 h em RT ou durante a noite a 4 °C.
  4. Lave as amostras por 3 x 5 min com PBST.
    1. Para células em tampas, transfira para uma placa de 12 poços e adicione a solução PBST.
    2. Para culturas HAE, substitua a solução de anticorpos por solução PBST.
  5. Verifique as fontes de luz e filtros disponíveis para o microscópio confocal.
  6. Escolha anticorpos secundários de acordo com a espécie hospedeira. Escolha os parâmetros fluoróforos (comprimentos de onda de excitação e emissão, largura de espectro e eficiência de excitação de acordo com a fonte de luz disponível).
    NOTA: Os parâmetros espectrais podem ser modelados utilizando ferramentas online (ver Tabela de Materiais).
  7. Prepare soluções secundárias de anticorpos adequadas diluindo-as com a solução de bloqueio.
  8. Incubar com anticorpos secundários (como em 6,3), mas incubar por 1h a 37 °C.
  9. Lave as amostras como na etapa 6.4.
  10. Coloração nuclear e montagem de slides
    1. Para células em tampas
      1. Aspire o PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.
      2. Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
      3. Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
      4. Coloque as tampas em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para baixo.
      5. Sele as tampas com esmalte.
    2. Para culturas HAE
      1. Aspire o 1x PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.
      2. Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
      3. Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
      4. Coloque as membranas recortados em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para cima e adicione um meio de montagem extra (5 μL) à membrana.
      5. Cubra as membranas com tampas.
      6. Sele as tampas com esmalte.

7. Microscopia confocal

  1. Defina as faixas especificando os fluoroforos utilizados.
  2. Escolha o modo de digitalização e a velocidade.
  3. Ajuste a potência do laser, ganho e valores de compensação para cada fluoróforo, comparando-os com os respectivos controles negativos: para vírus, células infectadas por simulação; para proteínas celulares, amostras manchadas com anticorpos de controle de isótipo de um hospedeiro apropriado.
  4. Para adquirir uma imagem 3D, ative o modo z-stack e defina os limites superior e inferior. Defina o tamanho/número da etapa.
    NOTA: Para obter mais detalhes sobre a imagem do coronavírus, consulte19.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo imuno-RNA-FISH descrito neste manuscrito foi realizado utilizando dois sistemas celulares: uma linha celular Vero e uma cultura 3D HAE. Os principais passos para ambos os modelos celulares são mostrados na Tabela 2. O protocolo RNA-FISH para visualização de SARS-CoV-2 nas culturas HAE inclui etapas típicas para amostras de tecido, ou seja, permeabilização com 100% meOH e reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH-PBS e 0,1% Tween. A imunofl...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O Imuno-RNA-FISH é um método confiável para coloração dupla de RNA e proteínas celulares. Aqui, foi descrito um protocolo modificado de imuno-RNA-FISH que permite a detecção de RNA SARS-CoV-2 e proteínas celulares em linhas celulares e culturas HAE. Este protocolo pode ser adaptado para uso em diferentes modelos celulares, incluindo monocamadas celulares ou tecidos específicos. O método se baseia no conceito de um HCR iniciado pela localização adequada da sonda. Em seguida, o uso de sondas de iniciação dividida para inic...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior para pesquisa sobre SARS-CoV-2, e por bolsas do Centro Nacional de Ciência (bolsas UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. e UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Microscópio Confocal LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker-ShakerFisher Scientific12965501
Incubadora Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materiais
15 mm x 15 mm N.º 1 lamínulasLabSolute7695022
tubos de 1,5mL FL-MEDICAL5.350.023.053
Placa de 12 poçosTTP92412
Tubo de centrífuga cónicoSarstedt5.332.547.254
parafilmeSigmaP7793-1EA
pipetas serológicasVWR Collection612-5523P, 612-5827P
vidro deslizantePTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagentes
Alexa fluoróforo 488-conjugado anticorpos secundários Invitrogen
β 5-tubulina Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
Fosfato dissódicoSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR Amplification BufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522O tampão também pode ser preparado doi:10.1242/dev.165753: Informações suplementares
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
amplificador HCR B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
HCR Sonda Hibridização BufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821tampão também pode ser preparado doi:10.1242/dev.165753: Informações suplementares
Conjunto de sonda HCR para SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR Sonda Tampão de LavagemMolecular Instruments, Inc.BPW01522Tampão também pode ser preparado doi:10.1242/dev.165753: Informações complementares
HEPESBioShopHEP001.100
Sulfato de magnésio heptahidratadoSigma63138-250G
MetanolSigma32213-1L-M
Fosfato monopotássicoSigmaP5655-100G
ParaformaldeídoSigmaP6148-1KG
TUBOSBioShopPIP666.100
Cloreto de PotássioSigmaP5405-250G
Prolongar Diamante Antifade Meio de MontagemInvitrogenP36970
Cloreto de SódioBioShopSOD001.5
Citrato Trissódico 2-hidratoPOCH 6132-04-3
Tween-20Software
S013922S012522 BioShop TWN580.500 Espectrovisor de fluorescência Modelagem de parâmetros espectrais ImageJ Fiji Aquisição e processamento de imagens z-stack

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118(2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286(2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8(2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889(2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830(2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

SARS CoV 2 VisualizationImmuno RNA FISHIn Situ HybridizationHybridization Chain ReactionViral RNA DetectionHuman Airway EpitheliumConfocal MicroscopyImmunofluorescence LabelingSingle Cell AnalysisProtein RNA Interactions

Artigos relacionados