Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Resumo

Pancreatite crônica (PC) é uma doença caracterizada por inflamação e fibrose do pâncreas, frequentemente associada a dor abdominal intratável. Este artigo se concentra na refinação da técnica para gerar um modelo de camundongo de CP via infusão de ducto biliar com ácido sulfônico de 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS).

Resumo

Pancreatite crônica (PC) é uma doença complexa que envolve inflamação pancreática e fibrose, atrofia glandular, dor abdominal e outros sintomas. Vários modelos de roedores foram desenvolvidos para estudar CP, dos quais o ducto biliar 2,4,6 -trinitrobenzeno modelo de infusão de ácido sulfônico (TNBS) replica as características da dor neuropática vista em CP. No entanto, a infusão de drogas de ducto biliar em camundongos é tecnicamente desafiadora. Este protocolo demonstra o procedimento de infusão tnbs do ducto biliar para a geração de um modelo de mouse CP. TNBS foi infundido no pâncreas através da ampola de Vater no duodeno. Este protocolo otimizeu o volume de medicamentos, técnicas cirúrgicas e o manuseio de drogas durante o procedimento. Os camundongos tratados com TNBS apresentaram características de CP refletidas por reduções de peso corporal e pâncreas, alterações nos comportamentos associados à dor e morfologia pancreática anormal. Com essas melhorias, a mortalidade associada à injeção de TNBS foi mínima. Este procedimento não é apenas crítico na geração de modelos de doenças pancreáticas, mas também é útil na entrega de medicamentos pancreáticos locais.

Introdução

Pancreatite crônica (PC) é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela atrofia do pâncreas, fibrose, dor abdominal e eventual perda das funções exócrina e endócrina¹. Os tratamentos médicos e cirúrgicos atuais não são curativos, mas são realizados para aliviar sintomas que são consequência da doença: dor abdominal refratária, disfunção endócrina e exócrina. Portanto, tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários². Os modelos animais fornecem uma ferramenta essencial para desenvolver uma melhor compreensão da doença e investigar possíveis terapêuticas³. Vários modelos de mouse para CP foram desenvolvidos, dos quais modelos de ceruleina e/ou álcool são comumente usados. Cerulein, um oligopeptide estimulando a secreção pancreática, tem sido mostrado para induzir reproduivelmente um modelo de CP com atrofia pancreática, fibrose, entre outros⁴. Outro modelo comum utiliza injeções seriais de L-arginina, que produz insuficiência exócrina semelhante à observada em pacientes humanos⁵. A CP também pode ser induzida por ligadura completa ou parcial do ducto pancreático, bem como hipertensão do ducto pancreático^6,7. Apesar da variedade de modelos animais disponíveis para PC, nenhum desses modelos reproduz efetivamente a dor abdominal experimentada pelos pacientes de PC⁸.

Estudos anteriores mostraram que a injeção pancreática local de 2,4,6 -trinitrobenzene ácido sulfônico (TNBS) replica a dor persistente experimentada pelos pacientes de PC^9,10,11. Os camundongos tratados com TNBS demonstraram hipersensibilidade abdominal e aumentaram os comportamentos relacionados à dor, bem como uma "hipersensibilidade generalizada" a estímulos dolorosos, fenômeno que tem sido observado em pacientes com PC¹⁰. Além de imitar com precisão a dor de CP, o modelo TNBS também replica outras características patológicas da condição humana, como fibrose, infiltração de células mononucleares e substituição de células acinar por tecido gorduroso^10,12. No entanto, a infusão de TNBS via ducto biliar é um procedimento tecnicamente desafiador em camundongos que pode causar a morte. Pelo que sabemos, não há protocolo visual para mostrar como a infusão do ducto biliar é realizada. Neste artigo, demonstramos o procedimento da infusão de dução bile de TNBS para gerar um modelo de mouse CP. Este procedimento ajudará a gerar modelos animais valiosos para o estudo de CP e outras doenças pancreáticas e pode ser usado para infundir outros materiais (por exemplo, vírus, células) no pâncreas¹³.

Protocolo

Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H. Johnson Medical Center. Neste estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J entre 8 e 10 semanas de idade. Os camundongos estavam alojados sob um ciclo escuro padrão de 12 luz/12 com litbitumaccess ad libitumaccess à comida e à água.

1. Preparação da solução TNBS para injeção

1. Prepare 10% de etanol em 0,9% salina. Dissolver o estoque TNBS (ver Tabela de Materiais) em 10% de etanol para uma concentração final de 7,5 mM adicionando 7,5 μL de TNBS em 1 mL de 10% de etanol.
   ATENÇÃO: A TNBS apresenta um risco químico. Prepare a solução dentro de um capô de fumaça e use equipamentos de proteção individual, como luvas, óculos e um jaleco para evitar contato direto com a TNBS.
2. Carregue 50 μL de solução TNBS de 0,75% em uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 31. Carregue 50 μL de 10% de etanol em soro fisiológico em uma seringa do mesmo tamanho do controle do veículo. Coloque as seringas no gelo e proteja-as da luz até que seja necessário.

2. Preparação e cirurgia do rato

1. Raspe o cabelo da área cirúrgica abdominal.
2. Injete uma dose preventiva do analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) antes da cirurgia.
3. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurane e 1 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia beliscando os dedo dos dedo e observando o animal por falta de reflexo.
4. Coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia. Aplique pomada veterinária em cada olho quando o rato estiver sob anestesia.
5. Desinfetar o local cirúrgico limpando a área cirúrgica 3x com 2% de iodo, seguido por 70% de álcool(Tabela de Materiais).
6. Faça uma laparotomia com micro tesoura para gerar uma incisão de 0,5-1 cm.
7. Exponha suavemente o duodeno e localize o ducto biliar comum utilizando cotonetes de algodão (Tabela de Materiais).
8. Coloque um micro clipe de micro hemo retosobreo duto comum proximal para evitar o fluxo de TNBS ou soluções de veículo no fígado e na vesícula biliar(Figura 1A,B).
9. Exponha suavemente o duodeno e insira a agulha no ducto pancreático através da papila de Vater.
10. Uma vez que a agulha esteja dentro do duto, coloque um micro clipe de micro hemo curva(Tabela de Materiais) sobre o duodeno ao redor da agulha (Figura 1A) para fixar a agulha no lugar e evitar que a solução injetada entre no duodeno.
11. Infundir gradualmente a solução (TNBS ou veículo) no duto pancreático ao longo de um minuto.
    NOTA: O TNBS precisa ser infundido lentamente ao longo de um minuto de tempo, e é fácil controlar a velocidade de infusão quando o pâncreas é perfundido com uma seringa de insulina com uma agulha de 5/16 polegadas e 31G. Mantenha a mão o mais estável possível para evitar picar o ducto biliar. Se o TNBS for injetado com sucesso, a cor amarela pode ser visível dentro do pâncreas.
12. Após a infusão, remova cuidadosamente o micro grampo perto do fígado e, em seguida, remova o micro grampo segurando a agulha e o duodeno.
13. Retorne cuidadosamente o duodeno à sua posição original.
14. Deixe 0,5 mL de soro estéril quente (36-37 °C) na cavidade abdominal antes do fechamento, para ajudar o duodeno a retornar à sua posição original e auxiliar na recuperação da peristalse.
15. Feche a incisão na camada muscular usando sutura contínua com um ponto de 5-0. Feche a pele usando sutura interrompida com um ponto 4-0.
16. Coloque a gaiola contendo ratos em uma almofada de aquecimento para permitir a recuperação da anestesia.
17. Confirme se os ratos são quentes e capazes de movimento espontâneo antes de devolvê-los para a sala de espera.
18. Continue fornecendo um analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) a cada 12h e calor suplementar para 48 h pós-cirurgia.

3. Monitorando o comportamento do mouse

1. Remova as suturas no 7º dia pós-cirurgia.
2. Monitore a saúde e o comportamento do rato diariamente durante a primeira semana pós-cirurgia. Cuidado com sinais de angústia, como vocalização, postura curvada nas costas ou menor locomoção. Meça o peso corporal dia não.
3. Use monofilamentos Von Frey (VFFs) para medir a hipersensibilidade mecânica abdominal antes, e 2, 3 semanas após a cirurgia, conforme descrito^9,14.
   1. Aplique VFFs de diferentes forças aplicadas na ordem ascendente à área abdominal superior 10x a cada 1-2 s. Considere o aumento, retração ou lambida do abdômen (resposta de retirada) como uma resposta positiva.
   2. Aplique um estímulo mais forte se uma resposta positiva não for observada, e um estímulo mais fraco se uma resposta positiva for observada. O limiar de retirada é a força com que o mouse responde 50% das vezes.

4. Coleta e análise histológica do tecido pancreático

1. Sacrifique os camundongos sob anestesia por deslocamento cervical, e disseca cuidadosamente o pâncreas do intestino e outros órgãos.
2. Fixar o pâncreas em 10% de paraformaldeído por 24 horas, incorporar em parafina, cortar seções teciduais de 5 μm de espessura e colocá-los em lâminas de vidro para coloração.
3. Realize a hematoxylin-eosina, e a coloração tricrática de Masson usando métodos padrão como relatado anteriormente⁴.

Resultados

Os procedimentos de infusão do ducto biliar foram otimizados para reduzir a mortalidade do camundongo associada a este procedimento¹⁰. O TNBS foi dado pela primeira vez em um volume total de 35 μL ou 50 μL. A injeção de TNBS em um volume de 50 μL poderia atingir todo o pâncreas e induzir um fenótipo de doença mais homogêneo(Figura 1B). Além disso, a injeção de TNBS usando seringa de insulina com agulha 31G poderia controlar melhor a velocidade de infusão em relação às...

Discussão

A infusão do ducto biliar de TNBS para induzir pancreatite crônica é tecnicamente desafiadora em camundongos, pois até 22,5% dos camundongos podem morrer dentro de 3-4 dias de infusão de medicamentos¹⁰. Aqui, este relatório refinou o procedimento com base em estudos anteriores e reduziu a mortalidade precoce do camundongo para <10%. Por exemplo, o aumento do volume de drogas (de 35 μL a 50μL) pode garantir que as drogas atinjam todo o pâncreas. O uso de uma seringa de insulina e um tamanho menor d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% de formalina tamponada neutra v/v	Fisher Scientific	23426796
Almofadas de preparação de álcool, estéreis	Fisher Scientific	22-363-750
Sistema de anestesia animal	VetEquip, Inc.
Cloridrato de buprenorfina, injeção	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Tubos de centrífuga, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Etanol, absoluto (200 provas), grau de biologia molecular	Fisher Scientific	BP2818500
Tesoura de microdissecação extra fina 4" reta afiada	Roboz Surgical Instrumento Co.	RS-5882
Pinça Graefe 4" ponta extra delicada	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Almofada aquecida	Amazon	B07HMKMBKM
Suporte de agulha Hegar-Baumgartner 5,25"	Roboz Instrumento Cirúrgico Co.	Seringa de insulina RS-7850
com agulha de calibre 31	BD	324909
almofadas de preparação de iodo	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurano	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clipe aplicando fórceps 5.5"	Roboz Instrumento Cirúrgico Co.	RS-5410
Micro clipe, reto forte curvo 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clipe, reto, largura do clipe de 0,75 mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Solução de ácido picrilsulfônico, TNBS, 1M em H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Sutura de polipropileno 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Sutura de polipropileno 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Cloreto de sódio, solução intravenosa a 0,9%	VWR	2B1322Q
Campo cirúrgico, estéril	Med-Vet International	DR1826
de tecido	Fisher Scientific	22-272416
Filamentos de Von Frey	Bioseb	EB2-VFF

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