Artigo de método

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

DOI:

10.3791/62093

⸱

11 de fevereiro de 2021

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Neste artigo

Resumo

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Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Resumo

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A mucosa intestinal é forrada por uma única camada de células epiteliais que forma uma barreira dinâmica que permite o transporte paracelular de nutrientes e água, evitando a passagem de bactérias luminais e substâncias exógenas. Uma violação dessa camada resulta em maior permeabilidade ao conteúdo luminal e recrutamento de células imunes, ambas marcas de estados patológicos no intestino, incluindo doença inflamatória intestinal (DII).

Os mecanismos que regulam a função da barreira epitelial e a migração transepitelial (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são incompletamente compreendidos devido à falta de métodos experimentais in vivo que permitem análises quantitativas. Aqui, descrevemos um modelo experimental murino robusto que emprega um segmento intestinal exteriorizado de íleo ou cólon proximal. O laço intestinal exteriorizado (iLoop) é totalmente vascularizado e oferece vantagens fisiológicas sobre abordagens baseadas em câmara ex vivo comumente usadas para estudar permeabilidade e migração de PMN através de monocamadas de células epiteliais.

Demonstramos duas aplicações deste modelo em detalhes: (1) medição quantitativa da permeabilidade intestinal através da detecção de dextrans rotulados por fluorescência no soro após injeção intraluminal, (2) avaliação quantitativa do PMN migrado através do epitélio intestinal para o lúmen intestinal após introdução intraluminal de quimioattractants. Demonstramos viabilidade deste modelo e fornecemos resultados utilizando o iLoop em camundongos sem a proteína epitelial associada à junção JAM-A em comparação com os controles. O JAM-A tem sido mostrado para regular a função da barreira epitelial, bem como pmn TEpM durante respostas inflamatórias. Nossos resultados utilizando o iLoop confirmam estudos anteriores e destacam a importância do JAM-A na regulação da permeabilidade intestinal e do PMN TEpM in vivo durante a homeostase e doença.

O modelo iLoop fornece um método altamente padronizado para estudos in vivo reprodutíveis de homeostase intestinal e inflamação e aumentará significativamente a compreensão da função da barreira intestinal e inflamação mucosa em doenças como o DII.

Introdução

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A mucosa intestinal abrange uma única camada de células epiteliais intestinais colunares (IECs), células imunes de lamina propria subjacentes e mucosa muscular. Além de seu papel na absorção de nutrientes, o epitélio intestinal é uma barreira física que protege o interior do corpo de bactérias luminais, patógenos e antígenos dietéticos. Além disso, IECs e células imunes lamina propria coordenam a resposta imune induzindo tolerância ou resposta, dependendo do contexto e estímulos. Foi relatado que o rompimento da barreira epitelial pode preceder o aparecimento de inflamação patológica da mucosa e contribuir para a doença inflamatória intestinal (DII) que abrange tanto ....

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Protocolo

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Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes e políticas dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan.

1. Preparação pré-operatória

NOTA: Este método foi gerado empregando camundongos adultos de origem genética C57BL/6, de 8 a 12 semanas. Todos os camundongos foram mantidos sob rigorosas condições específicas de livre patógenos com acesso ad libitum à comida e água normais. Os resultados foram obtidos utilizando C57BL/6, Jam-a - ratos nulos(Jam-a-/-) ou camundongos que ab....

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Resultados

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Uma representação esquemática dos modelos ileal loop e pcLoop é retratada na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. As imagens anatômicas exibem as etapas críticas do procedimento, incluindo a exteriorização do segmento intestinal (Figura 1B e Figura 2B),identificação de um local apropriado para ligaduras que permite perturbação mínima do suprimento de sangue.......

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Discussão

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Os mecanismos responsáveis pela desregulação da função da barreira intestinal e o recrutamento de células imunes em condições patológicas como o IBD são incompletamente compreendidos. Aqui, detalhamos um modelo robusto in vivo murine que emprega um segmento intestinal exteriorizado bem vascularizado de cólon ileum ou proximal e permite a avaliação da permeabilidade intestinal, estudos de migração de neutrófilos, bem como outras aplicações.

O iLoop é uma cirurgia de não recuperação que é realiz.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem ao Dr. Sven Flemming da Universidade de Wuerzburg por suas contribuições para o estabelecimento do modelo proximal de laço de cólon, Sean Watson pela gestão das colônias de ratos e Chithra K. Muraleedharan por ajudar na aquisição das fotos do modelo iLoop. Este trabalho foi apoiado pela German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) para KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 para C.A.P.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento e Material
BD Cotonetes com álcoolBD 326895
BD PrecisionGlide, 25G X 5/8"BD305122
BD Agulha PrecisionGlide, 30G X 1/2"BD305106
BD Seringa de Tuberculina BD 1ml Sem AgulhaBD309659
Tubo de Centrífuga de 15mlCorning14-959-53A
Microplaca de Poliestireno Preto Sólido de 96 PoçosFisherScientific07-200-592
Prato de Cultura Não Tratado Corning, 10cmMilliporeSigmaCLS430588
(cotonete), 6", estérilFisherScientific25806 2WC
Esponjas de Gaze Preenchidas com Algodão Dynarex, Não estéril, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 vaporizador de anestesia (Sistema Clássico, incluindo unidades de aquecimento)E-Z SystemsEZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml VWR21008-940
Fita de Rotulagem Colorida FisherBrandFisherScientific15-901-10R
Halsey Porta-Agulhas (porta-agulhas) FST12001-13
Kimwipes, pequeno (limpeza de tecido)FisherScientific06-666
Tubos de Microcentrífuga de 1,7ml Thomas Scientific c2170
Micro Tubo 1.3ml Z (tubo ativador de coágulo de soro)Sarstedt 41.1501.105
Tesoura Fina MoriaFST14370-22
5ml Tubo de Poliestireno de Fundo Redondo com Tampa de Filtro de Célula (35 µ m malha de nylon)Falcon352235
Puralube Vet Poma, Lubrificante Ocular EstérilDechra12920060
Ring Forceps (pinça de tecido rombudo)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YDFisherScientificNC9452680
Semken Forceps (fórceps anatômico)FST1108-13
Sofsilk Não Absorvível Revestido Preto Sutura Trançada Seda Tamanho 3-0, 18", Agulha 19mm comprimento 3/8 círculo corte reverso HenryScheinSS694
Pinça Fina para Estudantes, AngularFST91110-10
Seringa de 10ml PP/PE sem agulhaMillipore Sigma 
96 Placa de Cultura de Células de PoçoCorning3799
Tubos de Alimentação Amarelos para Roedores 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Soluções e Tampões
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Tampão de Lise de Cloreto de Amônio-Potássio (ACK)BioWhittaker10-548E
Solução salina balanceada de HanksCorning21-023-CV
tamponada com fosfato sem cálcio e magnésioCorning21-040-CV
strong>Reagents
Alexa Fluor 647 Anticorpo anti-mouse Ly-6G (1A8)BioLegend127610
CD11b Monoclonal Anticorpo, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolute Counting BeadsInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
Fetal Bovine Serum, inativado por calorR& D Systems511550
Isotiocianato de fluoresceína-Dextrano, peso molecular médio 4.000Sigma60842-46-8
IsofluranoHalocarbono12164-002-25
Leucotrieno B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rato Anti-Rato CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Rato purificado anti-rato CD16 / CD32 (bloco BD FC de camundongo)BD Bioscience553142
IFN murino recombinante -&gama;Peprotech315-05
TNF Murino Recombinante-&alfa;Peprotech315-01A
Aplicador de Ponta de Algodão Z248029 Solução salina <

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. M....

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Etiquetas

Migra o de Neutr filosBarreira EpitelialJun es EstreitasEnsaio de FITC DextranoDoen a Inflamat ria IntestinalCitometria de FluxoProte na JAM A

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