Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Resumo

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Resumo

Neurotransmissores de monoamina estão associados a inúmeras doenças neurológicas e psiquiátricas. Modelos animais de tais condições têm mostrado alterações na liberação e dinâmica de absorção de neurotransmissores de monoamina. Métodos tecnicamente complexos como eletrofisiologia, Voltammetry Ciclílica de Varredura Rápida (FSCV), imagem, microdiálise in vivo, optogenética ou uso de radioatividade são necessários para estudar a função monoamina. O método aqui apresentado é uma abordagem otimizada em duas etapas para detectar a liberação de monoamina em fatias cerebrais agudas usando uma placa de 48 poços contendo suportes teciduais para examinar a liberação de monoamina, e cromatografia líquida de alto desempenho, juntamente com a detecção eletroquímica (HPLC-ECD) para medição de liberação de monoamina. Resumidamente, seções cerebrais de ratos contendo regiões de interesse, incluindo córtex pré-frontal, hipocampo e estriado dorsal foram obtidas usando um cortador de tecido ou vibratome. Essas regiões de interesse foram dissecadas de todo o cérebro e incubadas em um tampão fisiológico oxigenado. A viabilidade foi examinada ao longo do curso de tempo experimental, por 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brometo (MTT). As regiões cerebrais dissecadas agudamente foram incubadas em diferentes condições de drogas que são conhecidas por induzir a liberação de monoamina através do transportador (anfetamina) ou através da ativação da liberação vesicular exociótica (KCl). Após a incubação, os produtos liberados no supernasciente foram coletados e analisados por meio de um sistema HPLC-ECD. Aqui, a liberação de monoamina basal é detectada pelo HPLC a partir de fatias cerebrais agudas. Esses dados suportam resultados in vivo e in vitro anteriores mostrando que a versão de amph e kcl induzem a liberação de monoamina. Este método é particularmente útil para estudar mecanismos associados à liberação dependente de transporte de monoamina e oferece uma oportunidade de triagem de compostos que afetam a liberação de monoamina de forma rápida e de baixo custo.

Introdução

Uma infinidade de doenças neurológicas e psiquiátricas estão associadas à desregulação ou à manutenção insuficiente do neurotransmissor de monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norrepinefrina [NE]) homeostasis1,2,3. Essas condições incluem, mas não se limitam a, ^{depressão1,2}, ^{esquizofrenia2}, ^ansiedade2, ^vício4, ^{menopausa5,6,7}, ^dor....

Protocolo

Todos os experimentos, incluindo manejo de animais e coleta de tecidos, foram realizados de acordo com a Universidade da Flórida e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), seguindo o protocolo aprovado 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Para reagentes e tampão, consulte o Arquivo Suplementar.

1. Prepare fatias agudas do cérebro de ratos

NOTA: Neste experimento foram utilizados ratos machos adultos (250-350 g). No entanto, essa configuração é funcional para diferentes pontos de desenvolvimento, ratos fêmeas e outras espécies. Se usar um animal menor, como ratos, o experimentador pode ....

Resultados

Esta técnica descreve o uso de fatias cerebrais para medir a liberação de monoaminas endógenas usando HPLC com detecção eletroquímica baseada em uma placa de 48 poços com um suporte interno de tecido. A configuração experimental é retratada na Figura 1 e Figura 2. Inicialmente, para garantir a viabilidade tecidual até o final da experimentação, foi realizado um ensaio de MTT (4-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium, um.......

Discussão

As medidas de liberação de monoaminas têm sido realizadas durante anos em vários sistemas como células heterólogas, culturas neuronais, sinapstosas cerebrais, fatias cerebrais agudas ex vivo e animais inteiros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 48 poços	NA	NA	Ensaio
Acetonitrila	Fischer Scientific	A998-1	Fase móvel
Cloreto de cálcio Anidro	Sigma	Aldrich C1016	Líquido cefalorraquidiano artificial modificado OU Tampão de efluxo
Clareza Software	Anetc
Ácido cítrico	Sigma Aldrich		Fase móvel
D-(+)-glicose	Sigma	1002608421	tampão de dissecção
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Ensaio
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad	Software, Inc		Análise estatística
glicerol	Sigma Aldrich	G5516	tampão de lise
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	tampão de lise
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, sistema LC-EC
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
dissecação	de ácido L-asróbico	Sigma Aldrich	A5960
Sulfato de magnésio	Sigma	7487-88-9	KH
Buffer Microcentrifuge Unidades de filtro UltraFree	Millipore	C7554	Ensaio - 6 para caber em placa de 48 poços
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Ensaio
Nanosep	VWR	29300-606	Ensaio; ensaio de proteína
Ácido octanessulfônico	Sigma Aldrich	V800010	Fase Móvel
Pargyline Clorohidrato	Sigma Aldrich	P8013	Líquido Cefalorraquidiano Artificial Modificado OU Tampão de Efluxo
Ácido Fosfórico	Sigma Aldrich		Fase Móvel
Cloreto de Potássio	Sigma	12636	KH Tampão
Fosfato de Potássio Monobásico	Sigma	1001655559	KH
Buffer Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Tampão de lise.
bicarbonato de sódio	Sigma	S5761	Tampão de dissecção
de bicarbonato de sódio	Sigma Aldrich	S5761	Tampão de dissecção
Cloreto de sódio	Sigma	S3014	KH Tampão
de dodecil sulfato de sódio	Sigma Aldrich	L3771	Tampão de lise
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Ensaio / tampão de lise

Tampão de Tampão de dissecação de