Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

Resumo

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Resumo

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil e poderosa para análise genética funcional. A essência do sistema é cruzar linhas transgênicas de "driver" que expressam o fator de transcrição de leveduras GAL4 de forma específica do tecido, com linhas transgênicas de "responder" carregando uma construção de interferência genética/RNA candidata cuja expressão é controlada por Sequências de Ativação Upstream (UAS) que ligam GAL4. Na prole resultante, o gene ou a construção silenciante é, portanto, expressa de forma espesso prescrita, permitindo que os fenótipos resultantes sejam avaliados e a função genética inferida. O sistema binário permite flexibilidade em abordagens experimentais para tela fenótipos gerados pela expressão transgênica em múltiplos padrões específicos do tecido, mesmo que os custos severos de aptidão sejam induzidos. Adaptamos este sistema para Anopheles gambiae, o principal vetor de malária na África.

Neste artigo, fornecemos alguns dos procedimentos comuns utilizados durante a análise GAL4-UAS. Descrevemos as linhas An. gambiae GAL4-UAS já geradas, bem como a clonagem de novas construções de respondente para a regulação e o knockdown rnai. Especificamos um guia passo a passo para o sexing de pupas de mosquito para estabelecer cruzes genéticas, que também inclui a prole de triagem para seguir a herança de marcadores genéticos fluorescentes que marcam as inserções do motorista e do respondente. Também apresentamos um protocolo para limpar embriões de An. gambiae para estudar o desenvolvimento embrionário. Finalmente, introduzimos possíveis adaptações do método para gerar linhas de driver através da inserção CRISPR/Cas9 de genes alvo.

Introdução

O sistema bipartite GAL4-UAS é o cavalo de trabalho da caracterização funcional de genes no organismo modelo de insetos Drosophila melanogaster1,2,3. Para usar o sistema GAL4-UAS, as linhas de driver transgênicas, expressando o fator de transcrição da levedura GAL4 sob controle de uma sequência regulatória, são cruzadas com linhas de resposta carregando um gene de interesse ou interferência de RNA (RNAi) construída controlada por uma Sequência de Ativação Upstream (UAS) reconhecida pela GAL4. A descendência dessa cruz expressa o transgene de interesse em um padrão es....

Protocolo

1. Projeto e construção de construções da UAS

1. Projeto e montagem de vetores para expressão genética do candidato
   1. Determine a sequência a ser usada para a regulação genética do candidato.
      1. Sequencifique o cDNA/gDNA da tensão de interesse e compare-o com a sequência publicada para verificar sua identidade e identificar possíveis SNPs e locais de restrição para digestão diagnóstica.
      2. Certifique-se de que o primer dianteiro usado para amplificação genética cobre a sequência nativa de Kozak e iniciar o códon, quando apropriado. Um primer com ~10 bp ligando upstream do códon inicial englobará a sequênci....

Resultados

A expressão 3xP3 de eYFP, dsRed e eCFP fornece identificação confiável e facilmente distintiva de indivíduos que possuem os genes marcadores que produzem expressão nos olhos e gúlia ventral de An. gambiae pupae (Figura 3). A morfologia diferencial observada na genitália externa masculina e feminina utilizada para o sexo e um exemplo de pupae não identificável são destacadas na Figura 4. A remoção de toda a água da pupae aumenta a dificuldade de.......

Discussão

Entender a função genética do mosquito é vital para desenvolver novas abordagens para controlar anofelinos e impactar a transmissão da malária. O sistema GAL4-UAS descrito é um sistema versátil e poderoso para análise funcional de genes candidatos e até hoje usamos o sistema para examinar a base genética da resistência a inseticidas17 e produção de hidrocarbonetos cuticulares15,23, bem como para marcar fluorescentemente diferentes populações de células do

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri de plástico 100 x 15 mm	SLS	2175546	Pacote de 10
1000 µ L Gilson Pipeta	Gilson	F144059P
20/25 mL Tubos Universais	Starlab	E1412-3020	Pacote de 400
Pipetas Pasteur de 3 mL	SLS	G612398	Greiner Pipeta Pasteur 3 mL estéreis embaladas individualmente
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Ácido acético	SLS	45726-1L-F	1 L
Gaiolas	SLS	E6099	30x30x30 com porta de tela
Pincéis finos	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON Conjunto de pincéis de pintura de detalhes de 9 peças Pincéis em miniatura para aquarela, pintura acrílica, pintura a óleo (vinho tinto)
Comida de peixe	Amazon		Tetra Min Fish Food, Alimento Completo para Todos os Peixes Tropicais para Saúde, Cor e Vitalidade, 10 L
Solução de Formaldeído	Sigma Aldrich	F8775
Aspirador de Boca	John Hock	612
Sal de Lagoa	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, para Saúde de Peixes, Qualidade da Água, Tônico Geral, Tampão de pH, 9.08 kg, trata 9,092 L
Potes de Pupas	Cater4you	SP8OZ	250 potes com tampas
Baldes de Plástico Pequenos			2.5 L Balde de Plástico Branco Completo com Tampa Branca (Pacote de 10)
Hipoclorito de Sódio	Fisher Scientific	S25552

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