Avaliação da dispersão de biofilme em feridas de Murine

Resumo

Aqui, descrevemos métodos ex vivo e in vivo para avaliar a dispersão bacteriana de uma infecção por ferida em camundongos. Este protocolo pode ser utilizado para testar a eficácia de terapias antimicrobianas e anti-biofilme tópicas, ou para avaliar a capacidade de dispersão de diferentes cepas bacterianas ou espécies.

Resumo

As infecções relacionadas ao biofilm estão implicadas em uma ampla gama de condições crônicas, como úlceras diabéticas não curativas, sinusite crônica, otite média recorrente e muito mais. As células microbianas dentro dessas infecções são protegidas por uma substância polimérica extracelular (EPS), que pode impedir que antibióticos e células imunes hospedeiras limpem a infecção. Para superar esse obstáculo, os investigadores começaram a desenvolver agentes dispersos como potenciais terapêuticos. Esses agentes têm como alvo vários componentes dentro do EPS biofilme, enfraquecendo a estrutura e iniciando a dispersão das bactérias, o que pode teoricamente melhorar a potência dos antibióticos e o despejo imunológico. Para determinar a eficácia dos agentes de dispersão para infecções por feridas, desenvolvemos protocolos que medem a dispersão de biofilmes tanto ex vivo quanto in vivo. Usamos um modelo de excisão cirúrgica de camundongos que foi bem descrito para criar infecções de feridas crônicas associadas a biofilmes. Para monitorar a dispersão in vivo,infectamos as feridas com cepas bacterianas que expressam luciferase. Uma vez estabelecidas infecções maduras, irrigamos as feridas com uma solução contendo enzimas que degradam componentes do EPS biofilme. Em seguida, monitoramos a localização e intensidade do sinal luminescente na ferida e órgãos filtrantes para fornecer informações sobre o nível de dispersão alcançado. Para análise ex vivo da dispersão de biofilmes, o tecido da ferida infectada está submerso em solução enzimética degradante de biofilme, após a qual a carga bacteriana restante no tecido, versus a carga bacteriana em solução, é avaliada. Ambos os protocolos têm pontos fortes e fracos e podem ser otimizados para ajudar a determinar com precisão a eficácia dos tratamentos de dispersão.

Introdução

O aumento da resistência a antibióticos em todo o mundo está levando à falta de opções de antibióticos para tratar uma variedade de infecções bacterianas¹. Além da resistência a antibióticos, as bactérias podem ganhar tolerância a antibióticos adotando um estilo de vida associado ao biofilme². Um biofilme é uma comunidade de microrganismos que são protegidos por uma matriz de polissacarídeos, DNA extracelular, lipídios e proteínas³, coletivamente chamada de substância polimérica extracelular (EPS). À medida que a crise de resistência a antibióticos continua, novas estratégias que prolongam o uso o....

Protocolo

Este protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Texas Tech University Health Sciences Center (protocolo número 07044). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação de bactérias para infecções de camundongos

NOTA: Aqui descrevemos ratos infectantes apenas com Pseudomonas aeruginosa. No entanto, outras espécies bacterianas podem ser usadas para causar infecção. Cepas e materiais bacterianos estão detalhados na Tabela de M....

Resultados

Neste experimento, camundongos webster suíços de 8 a 10 semanas foram infectados com 104 UFC de PAO1 carregando a luminescence plasmid pQF50-lux. Como descrito acima, foi permitida uma infecção estabelecer-se por 48 horas antes de administrar tratamentos de 3 x 30 min de PBS (controle de veículo) ou 10% GH (tratamento) para digerir o EPS biofilme. Os camundongos foram retratados antes do tratamento, logo após o tratamento (0h) e às 10h e 20h após o tratamento. Figura 2A e .......

Discussão

Aqui descrevemos protocolos que podem ser utilizados para estudar a eficácia dos agentes de dispersão de biofilmes. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para uso com diferentes tipos de agentes dispersivos, espécies bacterianas ou amostras ex vivo, incluindo amostras de debridamento clínico. Este protocolo também fornece um modelo clinicamente relevante para coletar e estudar células bacterianas dispersas. Os fenótipos de células bacterianas dispersas têm se mostrado distintos dos das células planctôn.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher	14823434	Use para completar diluições seriais de amostras
25G 58 na agulha	Fisher	14823434	Anexa a uma seringa de 1 mL
Ampicilina Sal de Sódio	Fisher	BP1760-5	Faça uma solução estoque de 50 mg/mL e adicione 100 µ L a 10 mL de caldo LB para durante a noite e subcultura
Amilase	MP Biomedicals	2100447	Faça uma solução a 5% p/v, vórtice - outros agentes de dispersão podem ser usados
Buprenorfina SR-LAB 5 mL (1 mg / mL)	ZooPharm	RX216118	Use como manutenção da dor - pode usar outras opções
Celulase	MP Biomedicals	2150583	Adicione 5% p/v à solução de amilase a 5% p/v, vórtice, ative a 37 &graus; C por 30 min - outros agentes de dispersão podem ser usados
Creme depilatório	Walmart	287746	Use uma pequena quantidade para massagear os folículos pilosos nas costas do animal e aloque 10 min para remover os pelos
Pinças de Curativo, Pontas Serrilhadas	Fisher	12-460-536	Pode usar outras formas de pinças
Frascos de Erlenmeyer perplexos 125 mL	Fisher	101406	Use para crescer durante a noite e subculturas de bactérias
FastPrep-24 Homogeneizador de bancada	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s por 60 s duas vezes para homogeneizar o tecido
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Injete 0,2 mL intraperitaneal para cada camundongo
Tubos de homogeneização (Bead Tube 2 mL 2,4 mm Metal)	Fisher	15340151	Usado para homogeneizar amostras para revestimento
Isoflurano	Diamond Back Drugs
Solução de cloridrato de cetamina/cloridrato de xilazina C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use como anasetia- outras opções também podem ser utilizadas para obter um campo cirúrgico de caldo de anasethia
LB, Miller	Fisher	BP1426-2	Adicione 25 g/L e autoclave
Lidocaína 2% Injetável	Diamond Back Drugs	2468	Injete 0,05 mL através do lado da área marcada do leito da ferida para que seja depositado no centro da marca. Colocar 10 min antes do corte
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Faça 5 mg/mL para adicionar à solução de GH para aplicar topicamente e uma solução de 15 mg/mL para injetar intraperitaneal 4 h antes e 6 h pós-tratamento
Esponjas de gaze de algodão não estéreis	Fisher	13-761-52	Use para remover o creme depilatório
PAO1 pQF50-lux cepa bacteriana	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux foi usado como a cepa de P. aeruginosa de interesse nos resultados representativos deste artigo
Placas de Petri	Fisher	PHR1772-500MG
Tampão de fosfato Salino 10x	Fisher	BP3991	Diluir 10x a 1x antes de usar
Curativo de poliuretano	Mckesson	66024007	Corte a borda arredondada e corte o quadrado restante em 4 seções iguais
Pseudomonas ágar isolamento	VWR	90004-394	Adicione 20 mL/L de glicerol e 45 g/mL à água, autoclave e despeje 20 mL em placas de Petri
Refresque o P.M.	Walmart		Use nos olhos para reduzir o ressecamento durante o procedimento.
Almofadas de Preparação de Álcool Estéril	Fisher	22-363-750	Use para limpar a pele imediatamente antes de ferir para desinfetar a área
Tesoura Reta Delicada	Fisher	89515	Também pode usar tesoura curva
Ratos Swiss Webster	Charles River	551NCISWWEB	Outras cepas de ratos podem ser usadas
Ponta deslizante de seringa 1 mL	Fisher	14823434	Usado para administrar drogas e Tratamento enzimático