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Artigo de método

Um modelo de rato de osteossarcoma ortotópico sintérico sprague dawley com amputação para controlar a taxa de metástase

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DOI:

10.3791/62139

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3 de maio de 2021

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1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, uma implantação ortotópica sinténica seguida de um procedimento de amputação do osteossarcoma com metástase pulmonar espontânea que pode ser usada para investigação pré-inlinética da biologia da metástase e desenvolvimento de novas terapêuticas é descrita.

Resumo

O avanço mais recente no tratamento do osteossarcoma (OS) ocorreu na década de 1980, quando a quimioterapia multi-agente mostrou melhorar a sobrevida geral em comparação apenas com a cirurgia. Para resolver esse problema, o objetivo do estudo é refinar um modelo menos conhecido de OS em ratos com uma abordagem cirúrgica histológica, de imagem, biológica, implantação e amputação abrangente que prolonga a sobrevivência. Utilizamos um imunocompetente, sprague-Dawley (SD), modelo de rato síngênico com linha celular UMR106 OS implantada (originária de um rato SD) com implantes de tumor tibial ortotópico em ratos machos e fêmeas de 3 semanas de idade para modelar o OS pediátrico. Descobrimos que os ratos desenvolvem tumores pulmonares primários e metastáticos reprodutíveis, e que as amputações de membros em 3 semanas após a implantação reduzem significativamente a incidência de metástase pulmonar e previnem mortes inesperadas. Histologicamente, as OSs primárias e metastáticas em ratos eram muito semelhantes aos humanos. Usando métodos imunohistoquímicos, o estudo mostra que os os ratos estão infiltrados com macrófagos e células T. Um levantamento de expressão proteica das células de OS revela que esses tumores expressam cineases familiares ErbB. Uma vez que essas quinases também são altamente expressas na maioria das OSs humanas, este modelo de rato poderia ser usado para testar inibidores da via ErbB para terapia.

Introdução

O osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo primário mais comum em crianças, adolescentes e adultos jovens. O avanço mais recente no tratamento da OS ocorreu na década de 1980, quando a quimioterapia multi-agente mostrou-se para melhorar a sobrevida geral em comparação apenas com a cirurgia1. O SISTEMA OPERACIONAL desenvolve-se durante o rápido crescimento ósseo, tipicamente ocorrendo em ossos tubulares longos como fêmur, tíbia e úmero. Caracterizam-se por uma aparência osteolítica, osteoblástica ou mista com notável reação peristeal2. A quimioterapia e a ressecção cirúrgica podem melhorar o resultado para pacientes com sobrevida de 5 anos para 65% dos pacientes2,3. Infelizmente, pacientes com doença metastática de alto grau têm 20% de sobrevida. O OS invade regionalmente e metástase principalmente para os pulmões ou outros ossos e é mais prevalente em machos. A necessidade mais convincente para esses pacientes jovens é uma nova terapia que previne e elimina a viabilidade de metástases distantes.

Foram revisados modelos pré-clínicos de OS4,5,6,7 e poucos modelos imunocompetntes disponíveis utilizando amputação de os os ortotópicos. Em 2000, um modelo importante foi desenvolvido utilizando camundongos BALB/c com OS ortotópicos e amputação8. Comparado a este modelo de camundongo, o modelo de rato é baseado em animais geneticamente superados e 10 vezes maiores levando a algumas vantagens. O modelo UMR106 de rato foi desenvolvido a partir de um SO induzido de 32P em um rato Sprague Dawley (SD), que foi derivado em uma linhacelular 9. Em 2001, a implantação ortotópica de UMR106-01 foi descrita pela primeira vez em tíbias implantadas de camundongos atrímicos com desenvolvimento rápido e consistente do tumor primário e características radiológicas, histológicas em comum com o OS em humanos. As metástases pulmonares desenvolveram-se e dependiam da colocação ortotópica de UMR106 no microambiente ósseo10. Em 2009, Yu et al.11 estabeleceram um modelo de rato de fêmur ortotópico reprodutopico usando células UMR106 em ratos maiores do sexo masculino. As implantações tumorais bem sucedidas e a taxa de metástase pulmonar em ratos sem amputação foram semelhantes aos dados aqui apresentados. Neste estudo, foi realizada uma amputação adicional ao modelo de uso de ratos jovens, o que sugere que o tempo de remoção do tumor primário é crucial na modelagem da OS, especialmente relacionada à progressão metastática. Com este refinamento, amputação e imagem in vivo melhoram este modelo para estudos pré-clínicos para avaliação de novos medicamentos para OS.

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Protocolo

Todos os procedimentos e experimentos envolvendo ratos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Johns Hopkins.

1. O protocolo de cultura celular DA linha celular OS de rato SD UMR-106

  1. Células de cultivo em DMEM, suplementadas com 10% (v/v) FBS, penicilina (10 U/mL)-estreptomicina (10 U/mL) a 37 °C na atmosfera umidificada de 5% de CO2. Realizar experimentos usando células com passagens de 2-812.

2. Injeção intratibial de protocolo de células do SISTEMA

NOTA: Ratos SD gestantes com acasalamento do tempo dão à luz na instalação animal e, com 3 semanas de idade, são usadas ninhadas (uma vez que a linha celular UMR 106 é síngênica para ratos SD, não é necessária irradiação).

  1. Indução
    1. Coloque o rato em uma câmara de indução de tamanho médio e induza a anestesia com isoflurane de 2%-3%. Monitore o animal continuamente para a profundidade da anestesia por reflexo para beliscar o dedo do dedo do sol, a taxa respiratória e o caráter.
    2. Insira o nariz no nariz. Proteja com fita adesiva, se necessário.
    3. Remova o cabelo da perna direita até o ventral e o abdômen inferior dorsal com cortadores ou use agente depilatório. Coloque o rato em uma posição supina.
    4. Esfregue a área cirúrgica asepticamente usando 70% de etanol e diluir acetato de clorexidina ou diluir betadina. Comece ao redor da área do joelho e esfregue em um movimento circular tanto proximally quanto distally. Repita este passo três vezes. Nenhuma cortina é usada para implantação de tumor.
    5. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos do rato para evitar a dessecação da córnea causada pela anestesia. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento de ajuste de fogo baixo. Certifique-se de que o rato tenha temperatura corporal normal (37 °C) e taxa respiratória normal.
  2. Cirurgia
    1. Ligue isoflurane a ~1,5%-2% (para manutenção). Certifique-se de que o animal está em um plano adequado de anestesia por falta de um reflexo de dedo do dedo do dedo do dedo. Caso não, aumente o percentual de isoflurane para 2,5%.
    2. Marque uma agulha estéril (aproximadamente 22 G) a 10 mm da ponta para orientação de profundidade para inserir.
    3. Insira a agulha 10 mm para baixo na diáfise da tíbia, entrando no joelho dobrado no meio do planalto tibial, estendendo a agulha através da metafise na difise usando um movimento leve como uma broca para fazer uma abertura. Remova a agulha.
    4. Carregue a suspensão da célula na seringa Hamilton diretamente antes da injeção na tíbia. Para isso, misture suavemente as células antes de desenhar em seringa, pois a gravidade faz com que as células se instalem no fundo do tubo.
      NOTA: As células podem ser armazenadas em um tubo de 1,5 a 2 mL (à temperatura ambiente) antes de desenhar na seringa Hamilton (100 μL) após uma mistura cuidadosa. As células podem ser mantidas à temperatura ambiente por 2-3 h durante o procedimento de implantação. Verifique sempre a viabilidade celular das células no tubo antes e depois da sessão de implantação. A exclusão azul trypan é o método mais fácil para avaliação da viabilidade celular.
    5. Uma vez que o osso é atravessado com a primeira agulha, insira uma segunda agulha (agulha de diâmetro menor também marcada a 10 mm) agulha presa à seringa Hamilton de 100 μL carregada com células. Certifique-se de inserir a agulha até a marca de 10 mm no mesmo orifício que se estende até a diafísica.
    6. Descarreza suavemente 20 μL de 75.000 células de SO suspensas em PBS na diáfise e cavidade da medula.
      NOTA: A agulha não deve oscilar no osso e deve se sentir segura. Se a agulha se move facilmente, o córtex pode ter sido atravessado na diáfise. Repita a inserção novamente para obter uma colocação mais firme antes da injeção de células.
    7. Remova a agulha Hamilton do osso.
      NOTA: Se uma pequena gota de forma sanguínea, aplique pressão leve. Se a gota de fluido claro se formar no local da punção, a agulha pode não ter sido estendida o suficiente no osso e a suspensão da célula tumoral pode ter vazado de volta através do buraco. Registo nas notas, mas geralmente, a implantação do tumor será bem sucedida. Com experiência, o procedimento de implantação do tumor deve levar 5 minutos por rato. Com a experiência, a implantação tumoral das células no osso ficará mais fácil. A injeção acidental de células no músculo ao redor do osso pode não levar ao microambiente tumoral necessário para a metástase pulmonar.
  3. Recuperação
    1. Certifique-se de que o rato é normoérmico. Coloque o rato em uma gaiola com uma almofada de aquecimento colocada sob a gaiola para recuperação.
    2. Depois de totalmente acordado, móvel e respirando bem, injete os ratos com Buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
      NOTA: Para ter acesso à Buprenorfina, consulte a instituição para ver as opções de aprovação através da equipe veterinária para fazer o pedido.
    3. Mova os ratos de volta para limpar gaiolas e monitore uma vez por dia, toda semana.

3. Medição e monitoramento

  1. Meça o tamanho do tumor de 9 a 10 dias após a implantação e, em seguida, a cada 2 dias até 3 semanas após a implantação para estabelecer uma taxa de crescimento. Meça o diâmetro máximo da tíbia usando uma pinça eletrônica ou manual. Armazene os dados em uma planilha com uma fórmula para calcular o volume do tumor. Meça a tíbia contralateral (não implantada) como a linha de base.
    NOTA: Os diâmetros de cetamina implantados são usados como substituto para o tamanho do tumor. Os membros traseiros são medidos perpendicularmente ao eixo longo da tíbia no maior diâmetro para duas medidas, ventral/dorsal e mídia/ lateral no membro. O volume estimado do tumor é calculado pela fórmula11: Volume tumoral (mm3) = maior diâmetro (mm) x menor diâmetro (mm)2/2.
  2. Considere os ratos para amputação de sobrevivência ou tratamento quimioterápico quando os tumores se aproximam de 15 mm na maior dimensão ou 3 semanas após a implantação do tumor. O membro contralateral mede cerca de 7-9 mm na maioria dos ratos nesta idade.

4. Administração intravenosa de doxorubicina

  1. Anestesiar os ratos com 2% de isofurane. Prepare a pele sobre a veia jugular com três lavagens cirúrgicas usando betadina e álcool como descrito13.
  2. Sob dissecção cuidadosa, visualize a veia jugular direita ou esquerda. Insira a agulha no músculo sobrelado e, em seguida, dirija-se em direção à cabeça do rato para o lúmen da veia jugular, pois é visualizado na veia jugular anterior ao músculo peitoral.
    1. Quando a agulha é inserida na veia jugular, retire suavemente o sangue da seringa para garantir a inserção adequada. É possível acreditar que a agulha é através da veia, mas a agulha está sob a veia e não no lúmen. Se a veia jugular se tornar muito pequena para injeções quando dissecar sem cortes para expor a veia jugular, use a outra veia jugular para a injeção.
  3. Injete doxorubicina (2 mg/kg) lentamente mais de 1 min em um volume de 100-150 μL. A solução pode ser visualizada por via intravenosa na veia jugular durante o parto.
  4. Injete volumes semelhantes de soro fisiológico normal em ratos de controle.
  5. Retire a agulha e aplique pressão suave na veia com uma gaze estéril.
  6. Feche a incisão da pele usando 3-4 clipes de ferida. Remova os clipes em 7-10 dias após a injeção.
    NOTA: Os ratos não costumam tentar remover clipes de metal, mas mordem e removem suturas. O método de injeção jugular é preferível às injeções de veias traseiras para doxorubicina, uma vez que qualquer droga que vaze fora do vaso causa necrose da cauda que pode exigir amputação da cauda.

5. Protocolo de amputação de membros traseiros

  1. Indução
    1. Coloque o rato em uma câmara de indução de tamanho médio e induza a anestesia com isoflurane de 2%-4%. Monitore o rato continuamente para a profundidade da anestesia.
      NOTA: A câmara de indução é limpa em um recipiente de carvão e quaisquer outros gases são removidos por uma tabela de baixo-rascunho usada para cirurgia.
    2. Insira o nariz em um nariz. Proteja com fita adesiva, se necessário.
      NOTA: Este procedimento é feito em uma tabela de rascunho para ressargar gases voláteis em excesso (ou seja, isoflurane).
    3. Remova o cabelo da perna direita até o ventral e o abdômen inferior dorsal com cortadores ou use agente depilatório. Coloque o rato em uma posição supina.
    4. Esfregue a área cirúrgica asepticamente usando 70% de etanol e diluir acetato de clorexidina ou diluir betadina. Prepare a pele para cirurgia do meio da panturrilha até a área da pele logo acima da articulação do quadril do abdômen inferior direito. Esfregue a perna proximal e a área distal circunferencialmente. Repita este passo três vezes.
    5. Aplique o lubrificante dos olhos em ambos os olhos do rato. Certifique-se de que o rato tenha temperatura corporal normal (37 °C) e sinais vitais normais. Monitore e regulamente a temperatura corporal usando uma almofada de aquecimento conectada a um monitor de sonda de temperatura retal.
  2. Cirurgia
    1. Ligue isoflurane a 1,5%-3% (manutenção). Monitore a profundidade anestésico, incluindo reação ao aperto do dedo do sol, taxa respiratória e caráter. Ajuste a taxa de isoflurane conforme necessário para manter um plano apropriado de anestesia.
      NOTA: A taxa respiratória enquanto estiver sob anestesia deve ser entre 50-100 respirações por minuto. Respirações profundas e pouco frequentes são uma indicação de que o rato está muito profundamente anestesiado.
    2. Abra pacotes de instrumentos estéreis e cortinas e não luvas estéreis. Tome cuidado para manter a esterilidade durante a duração do procedimento. Os instrumentos cirúrgicos estéreis básicos necessários incluem, suporte de lâmina de bisturi, fórceps, hemostats, porta agulha, tesoura e aplicador de clipe de ferida.
    3. Puxe a perna do rato através da ventilação da cortina cirúrgica estéril. Certifique-se de que o animal está em um plano adequado de anestesia através de reflexo de dedo do dedo do dedo do sol.
    4. Usando uma lâmina de bisturi ou uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão circunferencial e cutânea apenas proximal ao sufocamento (articulação do joelho).
    5. Deglove o membro traseiro usando gaze ou dissecção contundente para expor a artéria femoral e a veia na superfície ventral-medial do membro traseiro.
    6. Ligate os vasos usando suturas absorvíveis 4-0 ao nível do fêmur médio e transecte distally.
    7. Fixar a veia distally para reduzir o vazamento durante a dissecção muscular.
      NOTA: A musculatura circunferencial será transectada distal ao nível de ligadura do vaso da artéria femoral e músculos elevados do fêmur ao nível da articulação coxofemoral.
    8. Usando dissecção contundente, abduzir a articulação do quadril com rotação lateral para fora.
    9. Encontre a cabeça do fêmur e desarticula-o do acetábulo. Corte qualquer tecido restante mantendo a perna presa ao corpo.
    10. Dê um bloco de respingos ao acetábulo e nervo ciático com aproximadamente 6 mg/kg ropivacaína.
    11. Feche a musculatura sobre o acetábulo usando uma sutura simples interrompida (4-0, sutura absorvível).
      NOTA: Podem ser injetados 0,5% adicionais de bupivacaína ou lidocaína (0,15-0,2 mg total) em vários locais ao longo da camada muscular fechada (bloqueio local de infiltração/respingo).
    12. Oponha-se e feche as bordas da pele usando clipes de ferida separados a cada 5-10 mm.
  3. Recuperação
    1. Coloque o rato em uma gaiola de recuperação limpa com suporte térmico usando uma almofada de aquecimento colocada sob a gaiola.
      NOTA: Para evitar hipertermia, a almofada de aquecimento não deve estar em contato direto com o animal e não deve exceder 40 °C.
    2. Monitore o animal até que ele se recupere completamente e esteja normoérmico (37,5-39 °C).
      NOTA: O animal não deve ser deixado desacompanhado até que esteja totalmente consciente e severamente reclinado e se movendo facilmente ao redor da gaiola.
    3. Depois de totalmente acordado, móvel e respirando bem, injete os ratos com Buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
      NOTA: Dar Buprenorfina em um rato anestesiado pode prejudicar a recuperação.
    4. Administrar 10 mL de solução de Ringer lactado quente subcutâneamente entre as omoplatas.
    5. Mova os ratos de volta para a gaiola limpa e reúna-se com conespecíficos.
    6. Monitore todos os animais duas vezes por dia durante o próximo mês em busca de sinais de dor e angústia, incluindo piloereção, postura curvada ou inapetitosidade ou sinais de infecção no local da incisão, incluindo eritema, descarga purulenta ou deshiscência da ferida.
      NOTA: Até o momento não observamos sinais clínicos (como infecções) após a recuperação pós-operatória em nenhum dos animais. Apenas um rato teve uma deshicência com suturas, após a qual clipes de ferida foram usados para fechar feridas sem mais problemas.
    7. Administre buprenorfina ou meloxicam em animais que apresentem sinais clínicos de dor em doses publicadas em consulta com um veterinário de animais de laboratório.
    8. Administre antibióticos (ou seja, cefalosporina) a animais que apresentem sinais clínicos de dor em doses publicadas em consulta a um veterinário de animais de laboratório.
      NOTA: Qualquer animal que apresente sinais prolongados de dor ou angústia que não melhorem com analgésicos ou animais que apresentem sinais de infecção que não respondam a antibióticos precisam ser humanamente eutanizados.

6. Imagem com raio-X

  1. Após a implantação do tumor, imagem as tíbias e pulmões não invasivamente para detectar o crescimento do tumor usando raio-X com uma máquina projetada para roedores.
  2. Anestesiar os ratos como feito anteriormente.
  3. Tire imagens em 3x de ampliação para 6 s a 25 kV.
  4. Processe o filme usando o processador de raios-X. As radiografias também podem ser digitalizadas digitalmente.

7. Procedimento de necropsia

  1. Eutanize os ratos com CO2. Confirme a morte por falta de batimentos cardíacos e imediatamente retire sangue de 3 mL do coração para amostras de soro ou plasma.
  2. Abra o tórax e o abdômen para exame.
  3. Isole a traqueia e o cannulate com um cateter (18 G). Para fixar o cateter na traqueia, amarre uma sutura de seda em torno da traqueia com o cateter.
  4. Conecte o cateter de infusão a uma seringa de 3 ou 5 mL. Infundir formalina ou soro fisiológico para inflar suavemente os lóbulos pulmonares para melhores espécimes de histologia. Na infusão, os pulmões soprarão e permitirão uma melhor visualização de metástases pulmonares.
  5. Examine, disseca e pese todos os órgãos torácicos e abdominais selecionados (como fígado, rins).
  6. Fixar os órgãos em formalina para histopatologia ou congelar em gelo seco, 2-metilbutano ou nitrogênio líquido.
  7. Para avaliação da expressão proteica utilizando mancha ocidental, faça lises de tecidos congelados. Anticorpos que reagem com tecidos de ratos são detalhados13.

8. Imunohistoquímica

  1. Processe o tecido operacional primário, incorpore-o em parafina e seque-o para coloração imunohistoquímica.
  2. Recupere o antígeno após a desparafinação usando tampão citrato (pH 6.0). Incubar em 0,3% H2O2 em metanol por 30 min para saciar peroxidase endógena.
  3. Bloqueie as seções de parafina de 5 μm de espessura usando soro normal.
  4. Incubar com anticorpos anti-CD68 e CD3 primários (ver tabela) durante a noite a 4 °C.
  5. Enxágüe as seções em PBS e incuba-as no polímero HRP usando um kit de detecção.
    NOTA: A imunostaining foi desenvolvida com diaminobenzidina como cromogeno.

9. Mancha ocidental

  1. Lyse as células UMR-106 em 200-300 μL de tampão de lise14 para realizar eletroforese de gel padrão e mancha ocidental.
  2. Use 4% a 12% de géis Bis-Tris.
  3. Incubar em anticorpo primário anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actin ou anticorpo primário anti-rato β2-AR (ver tabela) e anticorpo secundário ligado à peroxidase de rabanete.
  4. Adicione o substrato chemiluminescente. Exponha as membranas ao filme de raio-X.
    NOTA: os níveis de β-actin são usados como controles de carregamento.

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Resultados

Ratos de sosseio de ORIGEM imunocompetente são usados para esses estudos de SO, que oferece um modelo animal com um sistema imunológico intacto. Usamos a linha celular UMR106 da ATCC, desenvolvida a partir de células que foram inicialmente isoladas de um SO de um rato SD. Implantamos as células em ratos SD, fornecendo assim um modelo sinténico para as células UMR106 são implantadas na tíbia de ratos SD masculinos e fêmeas de 3 semanas de idade, simulando um modelo de SO pediátrico. Além disso, a implantação ortotópica de...

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Discussão

Ratos com implantes tibiais da OS desenvolvem tumores mensuráveis por 3 semanas após a implantação. Se os membros com tumores forem amputados 3 semanas após a implantação, a incidência de metástase pulmonar é reduzida significativamente. Os OSs são osteolíticos e osteoblásticos. Ratos sem amputação desenvolvem metástases pulmonares de tamanho múltiplo e variado, observadas por radiografia ou necropsia por 7 semanas após a implantação. EGFR, ErbB2 e ErbB4 são expressos em umr106 OS de rato, semelhante ao os humano OS

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Divulgações

Nenhuma divulgação para declarar.

Agradecimentos

Financiamento do NIH através do Instituto Nacional do Câncer, conceder # CA228582. Shun Ishiyama está recebendo uma bolsa da Toray Medical Co., Ltd.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AKTCell Signaling TECHNOLOGY4685S
sutura absorvívelEthiconJ214H
β-actinaSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-47778
β 2-AR anticorpoSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569substituído por β 2-AR (E-3): sc-271322
Bis– Tris géisThermo FisherNP0321PK2
Buprenorfina SR LabZooPharmIZ-70000-201908
CD3 anticorpoDako#A0452
anticorpo CD68eBioscience#14-0688-82
Substrato quimioluminescentecytivaRPN2232
filme CL-XposureThermo Fisher34089
Sistema de anestesia completoEVETEQUIP922120
diaminobenzidinaVECTOR LABORATORIESSK-4100
DoxorrubicinaActavisNDC 45963-733-60
EGFR anticorpoSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-03substituído por EGFR (A-10): sc-373746
ERBB2 anticorpoSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-284substituído por Neu (3B5): sc-33684
anticorpo ERBB4SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-283substituído por ErbB4 (C-7): sc-8050
anticorpo ERKSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-514302
lubrificante ocularPHARMADERMNDC 0462-0211-38
Seringa Hamilton (100 µ L)HamiltonModelo 1710 SN SYR
anticorpo secundário ligado à peroxidase de rábanocytivaNA934
Kit de detecção de polímeroHRP VECTOR LABORATORIESMP-7401
Kit de detecção de polímero HRPVECTOR LABORATORIESMP-7402
isofluranoBUTLER SCHEINNDC 11695-6776-2
isoflurano vaporizadorEVETEQUIP911103
célula UMR-106ATCCCRL-1661
raios-XUltraFocus
Processador de raios-XHope X-Ray Peoducts IncMicroMax Processadores de raios-Xnão estão mais disponíveis nos EUA
clipes de feridaBECTON DICKINSON427631
Fax de

Referências

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Um modelo de rato de osteossarcoma ortotópico sintérico sprague dawley com amputação para controlar a taxa de metástase
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