Citometria de fluxo e análise de imagem confocal de baixa expressão de Wnt em timócitos repórter de Axin2-mTurquoise2

Resumo

Sabe-se que os níveis de sinalização regulam o destino celular, indicando que a regulação da sinalização Wnt constitui um alvo terapêutico interessante. Aqui, descrevemos os métodos de análise de citometria de fluxo e microscopia confocal para um modelo robusto de repórter de sinalização Wnt canônico murino que mede níveis distintos de sinalização Wnt.

Resumo

Medir os níveis de expressão de Wnt é essencial ao tentar identificar ou testar novos alvos terapêuticos de Wnt. Estudos anteriores mostraram que a sinalização canônica de Wnt opera por meio de um mecanismo acionado por dosagem, motivando a necessidade de estudar e medir a sinalização de Wnt em vários tipos de células. Embora vários modelos repórter tenham sido propostos para representar a expressão fisiológica de Wnt, tanto o contexto genético quanto a proteína repórter influenciaram muito a validade, precisão e flexibilidade dessas ferramentas. Este artigo descreve métodos para adquirir e analisar dados obtidos com o modelo repórter Wnt de camundongo Axin2-mTurquoise2, que contém um alelo Axin2^em1Fstl mutado. Este modelo facilita o estudo da sinalização Wnt canônica endógena em células individuais em uma ampla gama de atividade Wnt.

Este protocolo descreve como apreciar totalmente a atividade repórter Axin2-mTurquoise2 usando a análise da população celular do sistema hematopoiético, combinada com marcadores de superfície celular ou coloração intracelular de β-catenina . Esses procedimentos servem como base para implementação e reprodução em outros tecidos ou células de interesse. Ao combinar a classificação de células ativadas por fluorescência e imagens confocais, níveis distintos de expressão canônica de Wnt podem ser visualizados. As estratégias de medição e análise recomendadas fornecem dados quantitativos sobre os níveis de expressão fluorescente para avaliação precisa da sinalização Wnt canônica. Esses métodos serão úteis para pesquisadores que desejam usar o modelo Axin2-mTurquise2 para padrões de expressão Wnt canônicos.

Introdução

A sinalização Wnt canônica é uma via de sinalização conservada implicada na homeostase do tecido saudável, bem como na doença. A regulação precisa dos níveis de sinalização Wnt tem se mostrado importante no desenvolvimento embrionário, mas também é de grande importância em tecidos adultos. Descobriu-se que a sinalização Wnt canônica desempenha um papel importante na regeneração tecidual de vários órgãos, como o intestino, a pele e o sistema hematopoiético. Assim, quando a sinalização Wnt é desregulada, surgem patologias graves. Câncer colorretal, hepático e de pele, doenças neurológicas, bem como certas malignidades hematológicas são patologias exemplares em que a sinalização Wnt desregulada é o fator causador ou contribuinte¹. Portanto, vários inibidores para diferentes alvos de Wnt estão sendo testados em ensaios clínicos como terapêutica de câncer associada a Wnt².

Além disso, avanços interessantes estão ocorrendo no potencial terapêutico Wnt para recuperação neurológica, distúrbios neurológicos relacionados à idade e transtornos congênitos do espectro do autismo ^3,4,5. Os sinais Wnt foram explorados para expansão ex vivo de células-tronco para transplante subsequente⁶. No entanto, o direcionamento terapêutico da sinalização canônica de Wnt é um empreendimento difícil devido à sua importância em muitas funções celulares básicas e cross-talk com outras vias ^7,8,9, resultando na necessidade de medir com precisão os efeitos desses agentes terapêuticos Wnt em um modelo de fácil interpretação. A sinalização canônica de Wnt é impulsionada por ligantes Wnt solúveis de curto alcance, que são secretados por células vizinhas ou como excreção autócrina, conforme relatado em vários tipos de células-tronco responsivas a Wnt.

Os co-receptores Wnt Frizzled e lipoprotein (LRP) são responsivos a esses ligantes, o que desencadeia uma cascata de sinalização intracelular. Quando a sinalização Wnt está desligada, um complexo de destruição composto por Inibidor de Eixo (Axin), produto do gene supressor de tumor, Polipose Adenomatosa Coli (APC), Caseína Quinase1 (CK1α) e Glicogênio Sintase Quinase (GSK-3β), impede o acúmulo de β-catenina (CTNNB1) por degradação proteassômica. Após a ligação ligante-receptor Wnt, o complexo de destruição é inativado, levando ao acúmulo e estabilização da β-catenina no citoplasma. A β-catenina ativa pode migrar para o núcleo, onde se liga aos fatores de transcrição do fator de transcrição/fator de ligação ao intensificador linfóide (TCF/LEF) para iniciar a transcrição dos genes-alvo Wnt. A axin2 é considerada um gene alvo, pois é um alvo direto da via Wnt¹⁰. Além disso, a Axin2 serve como um regulador negativo, bem como um gene repórter para sinalização Wnt canônica ativa ^11,12.

Vários repórteres canônicos de sinalização Wnt foram descritos na literatura e têm sido de grande utilidade na compreensão do papel da sinalização Wnt no desenvolvimento embrionário. A maioria desses repórteres faz uso de sítios de ligação TCF / LEF inseridos sinteticamente, que não usam um gene alvo endógeno^{13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} . Além disso, foram utilizadas estratégias knock-in de Axin2 que respeitam a localização natural do gene 11,20,21,22,23, do qual Axin2-LacZ é geralmente aceito como o repórter Wnt canônico mais robusto¹¹. No entanto, a proteína repórter LacZ, embora fácil de usar na maioria dos tecidos, requer um substrato de β-galactosidase, que é reconhecido como agressivo para células vivas²⁴. Especialmente para células-tronco e timócitos, as duras condições de detecção de LacZ aumentam a morte celular (dados próprios não relatados) ao manusear suspensões celulares.

Embora a amplificação do sinal causada pela coloração LacZ seja conveniente para detectar sinais baixos, ela torna a quantificação menos direta e, portanto, indiscutivelmente menos confiável. Portanto, um modelo repórter murino foi projetado para mimetizar a estratégia genética Axin2-LacZ , mas com uma proteína repórter mTurquoise2²¹, para fornecer uma leitura mais direta e mais próxima dos níveis de expressão fisiológica. A proteína fluorescente mTurquoise2 é um excelente substituto para LacZ devido ao seu alto brilho (rendimento quântico (QY) = 0,93), flexibilidade em combinação com outras proteínas fluorescentes para caracterização extensa da superfície celular e sua falta de necessidade de um substrato exógeno. Além disso, sua estreita relação genética com a proteína fluorescente verde (GFP) oferece a possibilidade de usar a maioria dos anticorpos fluorescentes que reconhecem GFP para detecção de sinal mais forte, se necessário, em células extremamente sensíveis ao Wnt²⁵.

O modelo Axin2-mTurquoise2 não é apenas um repórter Wnt canônico, mas também oferece a possibilidade de estudar os fenótipos heterozigotos e homozigotos Axin2 (Axin2 knock-out). A inserção direcionada de mTurquoise2 no local inicial de Axin2 resulta em uma proteína Axin2²¹ interrompida. Como Axin2, também conhecido como Conductin, faz parte do complexo de destruição Wnt, e o complexo de destruição regula rigidamente a transcrição mediada por β-catenina, sua ausência parcial ou completa pode ser de interesse para estudar diversas patologias. Por exemplo, no câncer colorretal, os níveis de Axin2 são relativamente altos devido à hiperativação de Wnt¹¹; no entanto, seu papel em outras patologias ainda é amplamente desconhecido. Embora a Axin2 seja considerada como desempenhando um papel limitado na degradação da β-catenina, seu papel na regulação do Wnt pode ser reforçado pela adição de um pequeno peptídeo, que bloqueia o crescimento do câncer colorretal mediado por Wnt²⁶.

Em conjunto, a regulação cuidadosa do Wnt por meio de alvos terapêuticos do Wnt pode abrir oportunidades para alterar o início ou o desenvolvimento de patologias graves e deve ser mais investigada em modelos com capacidade repórter. Neste relatório, explicamos nosso método de análise de melhores práticas do modelo murino Axin2-mTurquoise2 para citometria de fluxo e imagens confocais. No contexto dos níveis de dosagem de Wnt, níveis de sinalização Wnt canônicos muito baixos são difíceis de detectar, para os quais as habilidades avançadas de detecção e análise fornecem uma vantagem para obter totalmente os benefícios desse modelo. Os timócitos são usados como um sistema modelo devido à sua frágil viabilidade celular, baixa expressão de sinalização Wnt canônica e área de citoplasma condensada para representar a sensibilidade de detecção do modelo Axin2-mTurquoise2. Além disso, um procedimento histológico de coloração total de β-catenina para suspensões de células de timócitos é explicado para medir os níveis citoplasmáticos de β-catenina e verificar a sinalização Wnt canônica ativa nuclear em combinação com o repórter.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos em camundongos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética em Experimentos com Animais do Centro Médico da Universidade de Leiden (LUMC). Macho e fêmea, 6-12 semanas de idade, do tipo selvagem (wt), que não têm inserção do construto repórter Axin2-mTurquoise2, heterozigoto (Tg/0) com uma inserção do construto repórter Axin2-murquoise2 e, portanto, um gene Axin2 interrompido, e homozigoto (Tg/Tg) com a inserção do construto repórter Axin2-mTurquoise2 em ambos os alelos e, portanto, dois genes Axin2 interrompidos; Camundongos Axin2-mTurquoise2 (B6; CBA-Axin2^em1Fstl/J) foram utilizados nos experimentos. Os animais foram sacrificados por eutanásia de CO₂ antes do isolamento do órgão. Durante todo o procedimento, minimizar a exposição das amostras à luz e manter sempre em gelo ou a 4 °C, salvo indicação em contrário. Cubra as amostras com papel alumínio. Todas as etapas devem ser realizadas em um laboratório padrão com cabine de biossegurança.

1. Preparação da suspensão de células timócitas

1. Colha o timo dos camundongos com cuidado, sem contaminação do sangue, cortando o abdômen dos camundongos e extraindo o timo com uma pinça. Armazene/transporte temporariamente em meio de Dulbecco modificado de Iscove gelado (IMDM) contendo 2,5% de soro fetal de bezerro (FCS).
   NOTA: Para evitar derramamento de sangue e possíveis danos ao timo, não sacrifique os camundongos por luxação cervical.
2. Prepare um tubo de 50 mL com um filtro de célula de 70 μm e molhe o filtro com 1 mL de meio IMDM frio / 2.5% FCS.
3. Amasse o órgão com a ponta traseira de um êmbolo de seringa de 1 mL enquanto lava duas vezes com meio IMDM / 2.5% FCS frio (Figura 1A). Se desejar, adicione uma concentração final de 50 U / mL de DNAse I ao meio IMDM / 2,5% FCS para evitar a aglomeração de células mortas. Enxágue o filtro 2x com meio IMDM / 2.5% FCS frio e ressuspenda suavemente no tubo de 50 mL.
   NOTA: Não exceda um volume final total de 10 mL. Mantenha as células no gelo e no escuro para as etapas subsequentes e quando não estiver manuseando.
4. Centrifugue a 330 × g durante 5 min a 4 °C e aspire suavemente o sobrenadante do sedimento celular. Ressuspenda o pellet celular suavemente em meio IMDM incompleto frio / 2,5% FCS e prepare-se para a contagem de células.
   NOTA: Se necessário, congele e armazene os timócitos em nitrogênio líquido em FCS-10% de dimetilsulfóxido para experimentação posterior. O congelamento e descongelamento celular adequados reduzirão a morte celular excessiva. Em média, metade dos timócitos pode ser apoptótica após o descongelamento devido à seleção natural de células T no timo, que deve ser considerada ao decidir quantos timócitos congelar por frasco criogênico. Pelo menos 2,5 × 10⁶ timócitos devem ser congelados por frasco.

2. Preparação da citometria de fluxo de timócitos

1. Prepare os timócitos para o procedimento de coloração da superfície celular preparando 2,5 × 10⁶ timócitos por amostra de coloração em solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS, pH 7,4) (Figura 1B). Reconte o número de células vivas após o descongelamento, se os timócitos tiverem sido previamente congelados. Se necessário, adicione uma concentração final de 50 U/mL de DNAse I para evitar a aglomeração de células mortas.
2. Use os painéis de coloração de anticorpos para caracterização da superfície celular de um subconjunto completo de timócitos.
   NOTA: Outras combinações de fluorocromos podem ser selecionadas. Selecione marcadores populacionais raros para fluorocromos fluorescentes brilhantes e, se possível, adicione um marcador de mortos-vivos. Nem os fluorocromos V450 nem V500 devem ser usados em combinação com o repórter fluorescente mTurquoise2 devido à sobreposição espectral. Sempre verifique os espectros de fluorescência de mTurquoise2 em combinação com fluorocromos azuis e verdes (Figura Suplementar 1A).
   1. Misture os anticorpos em proporções previamente definidas dos painéis de linhagem negativa (Lin-) separadamente em tampão PBS / 0,2% de albumina sérica bovina (BSA) / 0,1% NaN₃ (azida de sódio).
      NOTA: Todas as células indesejadas (não timócitos presentes no timo) são coradas em um processo de 2 etapas com um anticorpo secundário de estreptavidina (neste exemplo, ficoeritrina (Pe)-Cy7 e aloficocianina (APC)-Cy7) e podem ser excluídas usando uma "porta de despejo" na análise de citometria de fluxo.
   2. Misture os anticorpos em proporções previamente definidas do painel de coloração Double Negative (DN) com o anticorpo secundário de estreptavidina Pe-Cy7 em tampão PBS / 0,2% BSA / 0,1% NaN₃ . Exclua o painel Lin- dessa mistura (Tabela 1).
   3. Misture os anticorpos em proporções previamente definidas do painel de coloração Imaturo Único Positivo (ISP), Duplo Positivo (DP) e Único Positivo (SP) com o anticorpo secundário estreptavidina APC-Cy7 em tampão PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Exclua o painel Lin- dessa mistura (Tabela 1).
   4. Primeiro, core os timócitos com as populações indesejadas de células não-T usando as misturas de anticorpos primários de biotina dos painéis de Lin- por 30 min em gelo no escuro.
      NOTA: Cada painel de linha é um conjunto diferente de células e, portanto, não deve ser corado em uma amostra.
   5. Centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 min e retirar o sobrenadante. Lave os timócitos com 150 μL de tampão PBS / 0,2% BSA / 0,1% NaN₃ gelado e gire a 300 × g, 4 ° C por 5 min.
   6. Manchar com o painel DN e o painel ISP/DP/SP da coloração de Lin- correspondente por 30 min no gelo no escuro. Centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 min, e retirar o sobrenadante. Lave os timócitos com 150 μL de tampão PBS / 0,2% BSA / 0,1% NaN₃ gelado e gire a 300 × g, 4 ° C por 5 min.
3. Preparar as células para a medição por citometria de fluxo homogeneizando com um tubo de filtro de células de 35 μm e retirando as células em tampão PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Proteja as células da luz e mantenha-as congeladas até e durante a medição do citômetro de fluxo.
   NOTA: NaN₃ (azida sódica) é altamente tóxico e fatal. Cuidados especiais devem ser tomados ao trabalhar com esta substância. Lave bem as mãos após o manuseio e ligue imediatamente para um centro de controle de intoxicações ou médico / médico se o NaN₃ for ingerido.

3. Medição do citômetro de fluxo

NOTA: Usuários inexperientes devem primeiro fazer o treinamento do citômetro de fluxo, pois a medição do sinal mTurquoise2 em combinação com vários outros fluorocromos requer experiência e planejamento experiente do experimento. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o citômetro de fluxo.

1. Inicie o citômetro de fluxo de acordo com o manual do usuário ou outro protocolo estabelecido. Verifique e, se necessário, ajuste os conjuntos de filtros passa-banda no citômetro de fluxo para uma estratégia ideal de detecção de fluorescência.
   NOTA: Um filtro recomendado para mTurquoise2 é 470/20 nm na linha de laser ultravioleta de 405 nm, 407 nm ou a linha de laser menos comum de 440 nm.
2. Calibre o citômetro de fluxo estabelecendo configurações de compensação com grânulos de compensação disponíveis comercialmente e células 293T com expressão de mTurquoise2 transfectadas de forma estável.
   NOTA: Timócitos wt de coloração simples podem ser usados em vez de contas de compensação. Nesse caso, a compensação com contas foi igualmente eficiente e mais conveniente do que o uso de células.
   1. Rotule as contas com cada fluorocromo individual usado no experimento e inclua contas não coradas. Meça as contas para configurar um painel de configuração de compensação e meça as células 293T que expressam mTurquoise2, pois não há fluorocromo correspondente para mTurquoise2, que pode ser usado nas contas. Salve as configurações de compensação para uso no experimento real.
      NOTA: As células que expressam mTurquoise2 usadas para a configuração de compensação devem ser tão brilhantes ou mais brilhantes do que os timócitos que expressam mTurquoise2 do experimento real. Certifique-se de que também haja células 293T negativas para mTurquoise2 presentes.
   2. Para o experimento, inclua timócitos corados com fluorescência menos um (FMO) Tg/Tg, incluindo uma amostra de peso para o mTurquoise2 FMO e uma amostra não corada de timócitos de cada genótipo de camundongo como controles positivos para a parte de análise.
      NOTA: Esses controles são importantes para definir corretamente as portas para células positivas. O restante das amostras experimentais são coradas com o painel de coloração completo (Tabela 1).
      1. Crie um experimento, adicione e nomeie o número de tubos no software do citômetro de fluxo e crie gráficos de dispersão para visualizar as células coradas para o conjunto completo de fluorocromos.
      2. Aplique as configurações de compensação estabelecidas anteriormente ao experimento. Ajuste a dispersão direta (FSC) e a dispersão lateral (SSC) com timócitos wt não corados até que a população completa de células seja visível no gráfico de dispersão. Meça primeiro os timócitos que expressam mTurquoise2 Tg/Tg não corados para garantir que a população positiva seja visível.
      3. Meça uma amostra de timócito totalmente corada Tg/Tg e verifique se há todas as combinações de fluorocromo. Se necessário, ajuste os valores de compensação previamente estabelecidos para os fluorocromos que apresentam compensação incorreta. Meça o restante das amostras experimentais e não ajuste nenhuma configuração durante a medição das amostras.
         NOTA: O ajuste de compensação subsequente também pode ser realizado no pacote de software de análise. Embora o número de células disponíveis possa ser um fator limitante, é aconselhável realizar esta etapa durante a medição. Mantenha as configurações iguais entre todas as amostras para comparação dos valores de intensidade mTurquoise2.

4. Análise por citometria de fluxo

NOTA: A análise por citometria de fluxo foi realizada por meio de software específico mencionado na Tabela de Materiais; no entanto, outros programas de análise de citometria de fluxo também estão disponíveis.

1. Células vivas de portão e subconjuntos de timócitos de acordo com os valores de FSC e SSC.
2. Verifique as configurações de compensação na caixa de diálogo da matriz de compensação localizada à esquerda da amostra para garantir que não haja interferência de fluorocromo e que a compensação adequada tenha ocorrido para evitar transbordamento ou sangramento.
   1. Se a matriz definida por aquisição precisar ser ajustada, altere os valores na matriz de compensação simplesmente aumentando ou diminuindo o valor de compensação de cada combinação de fluorocromo para que a população não mostre uma linha horizontal ou vertical quase perfeita (Figura Suplementar 1B).
3. Para espalhar visualmente a intensidade do mTurquoise2 para um gating positivo adequado, altere a exibição do eixo X do mTurquoise2 para linear (Figura Suplementar 2).
   1. Use o controle mTurquoise2 FMO como controle negativo para o gating de sinal positivo mTurquoise2. Revise o limite correto por população de células (Figura 2).
      NOTA: As células de controle mTurquoise2 FMO (wt) não possuem o marcador mTurquoise2 e, portanto, podem ser usadas como um limite de fundo para a atividade do repórter Axin2.
4. Gate células positivas para mTurquoise2 com o canal de detecção apropriado para definir quantas células são positivas para Wnt.
5. Calcule a média geométrica e a mediana para definir a quantidade de intensidade fluorescente nas células de interesse.
   1. Clique em Estatísticas | Adicione estatística dentro do painel mostrando células mTurquoise2-positivas.
   2. Defina o método estatístico, a população de interesse e o canal de detecção de mTurquoise2 e clique em Adicionar. Represente a média geométrica e a intensidade fluorescente mediana em Unidades Arbitrárias (UA) para plotar gráficos.
      NOTA: A mediana representa o valor médio da intensidade fluorescente e, portanto, fornece informações sobre a mudança da população de intensidade fluorescente. Se necessário, uma correção de fundo pode ajudar a obter uma visualização mais clara da faixa dinâmica da atividade do repórter mTurquoise2. Isso pode ser feito subtraindo as frequências de coloração de fundo wt da frequência total de células mTurquoise2-positivas do tipo de célula específico que é fechado.

5. Preparação de citospins de timócitos para imagens confocais

NOTA: As citospinas de timócitos são recomendadas ao trabalhar com suspensões celulares de células não aderentes. Como a expressão de Axin2-mTurquoise2 nos timócitos é menor do que nas células epiteliais do timo, suspensões de células de timócitos filtradas foram usadas para imagem.

1. Comece com uma suspensão celular de timócitos recém-colhidos ou congelados. Suspenda ~ 20.000 timócitos em 100 μL de PBS frio / 0,5% BSA / 10% FCS por genótipo de timócito.
   NOTA: Se necessário, descongele as células suavemente para preservar a viabilidade celular máxima ao trabalhar com timócitos previamente congelados. Isso ajudará em menos autofluorescência ao obter imagens das células. Verifique a viabilidade celular para garantir a qualidade da amostra. O procedimento de citospina emprega uma força mecânica que foi adaptada ao frágil timócito; no entanto, requer uma população inicial altamente viável. Para garantir maior viabilidade, é aconselhável começar com timócitos recém-colhidos em vez de congelados.
2. Umedeça previamente a área ao redor da abertura das placas de filtro com PBS. Monte o suporte da câmara de amostra do cytospin de acordo com o manual (Figura 1C).
   1. Coloque o cartão do filtro na lâmina de gelo (lado liso contra a lâmina de vidro). Coloque os dois itens no suporte da câmara de amostras. Tome cuidado ao colocar o cartão do filtro exatamente no orifício do suporte da câmara de amostra e coloque o suporte completo da câmara de amostra no rotor.
3. Ressuspender cuidadosamente os timócitos e adicionar 100 μL da suspensão celular nas câmaras de amostra. Gire a suspensão de timócitos por 4 min a ~ 350 × g nas lâminas de gelo. Remova o cartão do filtro cuidadosamente da lâmina de gelo sem tocar nas células. Seque as citospinas ao ar por um período que varia de 1 h até a noite em temperatura ambiente.
   NOTA: Ao trabalhar com outros tipos de células, teste diferentes densidades de células para obter os melhores resultados. As citospinas podem ser congeladas a -20 °C em uma caixa lacrada para experimentação posterior. Descongele as citospinas para manuseio posterior por 1 h em temperatura ambiente.

6. Imunomarcação de citospina com β-catenina total

1. Fixe as citospinas por 15 min em temperatura ambiente em 100% de metanol. Seque as lâminas ao ar por 10 min em temperatura ambiente. Desenhe um círculo ao redor da população de timócitos na lâmina de vidro com uma caneta hidrofóbica.
   NOTA: Esta etapa de fixação é otimizada especificamente para coloração com β-catenina.
2. Coloque as lâminas em PBS/0,05% Tween-20 por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida, transfira-as para uma caixa escura e úmida durante as etapas de bloqueio e incubação. Adicione 100 μL de PBS / 10% de soro normal de camundongo (NMS) por lâmina e deixe na caixa úmida por 10 min em temperatura ambiente. Bata na lâmina para remover o NMS de 10%, adicione 100 μL de PBS / 10% de soro de cabra normal (NGS) por lâmina e deixe na caixa úmida por 30 min em temperatura ambiente.
   NOTA: A incubação com PBS / 10% NMS bloqueia a ligação de anticorpos primários não específicos (Figura 1D), enquanto PBS / 10% NGS bloqueia a ligação de anticorpos secundários não específicos.
3. Prepare anticorpos adicionais para coloração celular. Misture 0,5 μg do anticorpo total de β-catenina com os fragmentos marcados com AF568.
   NOTA: Neste cenário, um kit de rotulagem disponível comercialmente foi usado para pré-rotulagem da β-catenina total primária anti-camundongo com fragmentos secundários de IgG1 Fab anti-camundongo de cabra com marcação de fluorocromo Alexa Fluor 568 (AF568) antes de adicioná-lo aos timócitos. Realize a rotulagem de acordo com o protocolo do fabricante, pois várias concentrações podem precisar ser testadas. Use o anticorpo total marcado com β-catenina-AF568 dentro de 30 minutos.
4. Adicione 50 μL (0,5 μg) do anticorpo total marcado com β-catenina-AF568 por lâmina de citospin durante a noite a 4 ° C em uma caixa úmida. Inclua um controle de coloração negativo de acordo com o protocolo do fabricante ou um controle de isotipo no caso de um protocolo de marcação direta.
5. Lave por 20 min com PBS / 0,05% Tween-20 em temperatura ambiente. Em seguida, lave por 20 min com PBS em temperatura ambiente em uma jarra com agitação. Execute uma segunda etapa de fixação para garantir a ligação do anticorpo ao antígeno: 10 min em temperatura ambiente com 100 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS em uma caixa úmida.
   NOTA: Mantenha os slides no escuro. Nem a fixação de metanol nem PFA afetarão significativamente a expressão de mTurquoise2²⁷.
6. Mergulhe os slides em PBS. Realize a coloração nuclear com 50 μL de TO-PRO-3 (1:1500) por 10 min em temperatura ambiente na caixa úmida. Lave as lâminas por 20 min com PBS em temperatura ambiente em uma jarra com agitação.
   NOTA: A concentração de TO-PRO3 pode ser titulada dependendo do uso de outros fluorocromos com espectros fluorescentes próximos.
7. Incorpore as amostras com um reagente antidesbotamento de acordo com o protocolo do fabricante e cubra com uma lamínula. Seque ao ar por 24 h em temperatura ambiente. Visualize as lâminas diretamente sob um microscópio fluorescente ou confocal ou armazene a -20 °C para obter imagens posteriores.

7. Medição microscópica confocal

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o microscópio confocal.

1. Ligue o microscópio confocal de acordo com o manual ou protocolo estabelecido. Use controles de linha celular mTurquoise2 293T transfectados de forma estável negativa e positiva para ajuste primário das configurações confocais. Posteriormente, use os timócitos wt Axin2-mTurquoise2 e Tg/Tg (knock-out) Axin2-mTurquoise2 como controles negativos e positivos, respectivamente, para garantir que não haja subexposição do sinal mTurquoise2.
2. Prepare o software para varredura sequencial programando os lasers e as larguras dos filtros. Comece com a linha de laser de comprimento de onda mais alto primeiro e trabalhe em direção ao comprimento de onda mais baixo. Quando todas as etapas de varredura sequencial estiverem instaladas, carregue a amostra no estágio do microscópio, foque a amostra e pressione Live para otimizar a potência do laser e o Smart Gain usando os respectivos botões no software confocal ou no painel manual opcional.
   NOTA: A seção da amostra da lâmina não deve ser visualizada para quantificação do sinal, pois pode ocorrer fotobranqueamento potencial. No entanto, mTurquoise2 tem alta fotoestabilidade²⁵.
3. Em caso de expressão de mTurquoise2 muito baixa, aumente a potência do laser e o Smart Gain até que um sinal fluorescente seja observado e verifique com a amostra de controle negativo para garantir um sinal positivo verdadeiro. Visualize os timócitos com uma lente de óleo 40x 1,4, lente de óleo 63x 1,4 ou lente de óleo 100x 1,4.
   NOTA: Um microscópio Leica SP5 foi usado para este estudo.
4. Use essas configurações de imagem confocal no microscópio antes de medir a amostra.
   1. Ajuste a faixa de valores de intensidade para uma imagem de 12 bits clicando em Configuração | Configurações | mude para 12 bits na opção Profundidade de bits para criar uma escala mais ampla de intensidade e, portanto, mais distinção entre sinais fluorescentes baixos e altos.
   2. Ajuste a resolução da imagem clicando em XY e aumente o Formato para 1024 x 1024, o que também dobrará o tempo de digitalização. Ajuste a velocidade de digitalização para 400-600 Hz clicando em Velocidade | Mais para alterar manualmente as configurações. Além disso, ative a opção Digitalização bidirecional .
   3. Ajuste o controle deslizante de sensibilidade para reduzir o sinal de fundo. Otimize a potência correta do laser e o ganho inteligente com a opção Quick LUT (Look-Up Table).
      NOTA: Na imagem de 12 bits, o controle deslizante tem um valor de intensidade de escala de cinza de 0 a 4095. Isso também pode ser feito posteriormente com o software Las X offline gratuito. A cor verde mostrará o fundo preto e a cor azul mostra pixels saturados da amostra.
5. Quando todas as configurações de imagem estiverem otimizadas, meça a amostra clicando em Iniciar, que iniciará a imagem sequencial de todos os três canais.
   1. Meça o sinal fluorescente nuclear TO-PRO-3. Detecte o TO-PRO-3 com o laser de 633 nm e o HyD 640-750 nm.
      NOTA: Nesta configuração, 6% da potência do laser foi usada com 15% de ganho inteligente. Essa configuração pode mudar dependendo da intensidade da coloração TO-PRO-3. Se muito brilhante, pode influenciar fluorocromos de baixa intensidade quando superexcitado. Nesse caso, reduza a concentração de coloração.
   2. Meça os sinais fluorescentes nucleares e citoplasmáticos de β-catenina. Detecte β-catenina com o laser de 561 nm e HyD 580-605 nm. Acumule até 2 digitalizações para uma imagem ajustando a configuração na caixa XY no software com média de linha 2 no caso de um sinal AF568 baixo.
      NOTA: Nesta configuração, 85% da potência do laser foi usada com 87% de ganho inteligente.
   3. Meça o sinal fluorescente citoplasmático mTurquoise2. Detecte mTurquoise2 com o laser de 458 nm e HyD 490-600 nm. Acumule até 4 varreduras para uma imagem ajustando a configuração na caixa XY no software com média de linha 4 no caso de um sinal mTurquoise2 baixo.
      NOTA: Devido aos lasers antigos no microscópio confocal usado para este protocolo e ao baixo sinal mTurquoise2, 405 nm foi usado com 90% de potência do laser, juntamente com os lasers de 458 nm e 476 nm com 100% de potência do laser com HyD 490-550 nm com 100% de ganho inteligente. Um laser de 440 nm é o ideal, embora menos comumente presente em um microscópio confocal. A alta potência do laser deve ser manuseada com cuidado e realizada apenas com imagens sequenciais. Certifique-se de que as configurações de emergência estejam em vigor para evitar a superexposição do detector. A potência do laser em outros microscópios confocais pode ser inferior aos propostos neste protocolo devido a lasers mais potentes ou mais novos. Um teste de branqueamento pode ser realizado para garantir que nenhum sinal fluorescente seja perdido antes da imagem. Na configuração proposta, o fotobranqueamento de mTurquoise2 foi aceitável.
   4. Realize imagens de campo claro para visualização total da célula. Detecte timócitos com o laser de 488 nm e PMT Scan-DIC. Exporte os arquivos Lif para análise de imagem.
      NOTA: Nesta configuração, 59% da potência do laser foi usada com um ganho de 212 V e deslocamento de dados de -4.3%. Os arquivos Lif podem ser lidos no software LAS x offline para correção de imagem.

8. Análise de microscopia confocal

1. Analise as imagens usando um software de processamento de imagem²⁸ (Figura Suplementar 3). Carregue as imagens no software.
   NOTA: Vários formatos são aceitos, mas arquivos TIFF com LUT ou importação direta de arquivos Lif para o software de processamento de imagem são recomendados.
2. Meça o sinal ativo de β-catenina nos núcleos dos timócitos.
   1. Selecione os núcleos dos timócitos corados com TO-PRO-3 na imagem do valor cinza vermelho para a análise da β-catenina ativa. Faça isso manualmente ou use a seleção automatizada de células no software.
      NOTA: A seleção automatizada de células pode precisar de processamento de imagem para limite adequado e análise de partículas. A seleção manual de células pode ser trabalhosa, mas geralmente não requer nenhum processamento de imagem e é recomendada neste protocolo.
   2. Ative a seleção manual com qualquer uma das ferramentas de seleção na barra de trabalho.
      1. Selecione o contorno do núcleo e adicione-o ao gerenciador de ROI (Região de Interesse). Ative o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | ROI Manager, e quando uma nova janela do ROI manager for aberta, clique na primeira opção Adicionar (t) ou use o atalho de teclado t. Repita a etapa anterior até que todos os núcleos sejam definidos e adicionados ao gerenciador de ROI. Use a opção Mostrar tudo no gerenciador de ROI para visualizar as células selecionadas.
   3. Selecione >3 áreas de fundo onde não há células presentes e adicione-as ao gerenciador de ROI.
      NOTA: Tamanho e forma não são importantes neste caso. Essas regiões servirão como medições de ruído de fundo para o cálculo final.
      1. Defina a medida na imagem clicando em Analisar | Definir medidas. Na nova janela que se abre com diferentes opções de medição, ative Área, Densidade integrada e Valor médio de cinza | clique em OK.
      2. Ative a imagem do valor cinza da β-catenina clicando nela e visualize os núcleos selecionados e as áreas de fundo clicando em Mostrar tudo no gerenciador de ROI. Observe todas as áreas selecionadas que agora estão visíveis na imagem de β-catenina.
      3. Clique em Medir no Gerenciador de ROI ou clique em Analisar | Medir. Observe a nova janela Resultados que se abre, mostrando os resultados do sinal de β-catenina dentro das ROIs.
      4. Transfira os resultados para um programa de cálculo de planilha clicando em Editar | Selecionar tudo; e copie/cole a lista na planilha para cálculos posteriores. Salve o gerenciador de ROI para referência futura sem precisar repetir a seleção de núcleos clicando em Mais | Salvar....
   4. Para seleção automatizada de células, faça Duplicatas (Teclado Ctrl D) da imagem a ser processada, pois muitas configurações de processamento de imagem não podem ser desfeitas.
      NOTA: A marcação nuclear automatizada requer processamento de imagem, na maioria dos casos, para definir os núcleos de forma automática e precisa. O processamento de imagens deve ser feito apenas para fins de seleção de área. As imagens processadas não são úteis para medição de intensidade fluorescente porque os valores de pixel são alterados.
      1. Execute um filtro gaussiano clicando em Processo | Filtros | Desfoque gaussiano para suavizar a imagem. Teste vários valores Sigma (Raio) e ative a opção Visualizar para visualizar o efeito antes de clicar em OK.
      2. Inverta a imagem clicando em Editar | Inverter. Verifique o brilho e o contraste clicando na imagem | Ajustar | Brilho/Contraste. Use a opção Automático ou, de preferência, altere manualmente os valores.
         NOTA: Não aplique as alterações, pois isso alteraria as propriedades da imagem. Basta fechar a janela B&C quando a imagem desejada for obtida.
      3. Crie um limite clicando em Imagem | Ajustar | Limite e defina as melhores configurações de Limite em que todas as células são mais visíveis. Clique em Aplicar para aplicar as configurações de limite.
         NOTA: Se um limite não tiver sido aplicado às células, que mostram furos, clique em Processar | Binário | Preencha os buracos para preencher as lacunas dentro das células. Se as células estiverem fundidas com as configurações de limite, clique em Processo | Binário | Bacia hidrográfica para separar essas células. Uma linha fina de 1 pixel separará qualquer célula que o programa interprete como fundida.
      4. Defina o menor e o maior núcleo na imagem selecionando manualmente um núcleo de sua escolha com a ferramenta de seleção à mão livre , adicione-o ao gerenciador de ROI e meça a área.
      5. Analise as partículas (núcleos) clicando em Analisar | Analise as partículas e insira a menor área e a maior área na caixa Tamanho (^2) com um hífen (-) no meio. Ative as caixas Exibir resultados, Adicionar ao gerenciador e Excluir nas bordas antes de clicar em OK. Continue com a etapa 8.2.3 para concluir o protocolo.
3. Meça os sinais citoplasmáticos de mTurquoise2 e β-catenina nos timócitos.
   1. Selecione o contorno de timócitos inteiros na imagem de campo claro seguindo as mesmas etapas acima.
   2. Selecione >3 áreas de fundo onde não há células presentes e adicione-as ao gerenciador de ROI.
      NOTA: Tamanho e forma não são essenciais neste caso. Essas regiões servirão como medições de ruído de fundo para o cálculo final.
      1. Ative a imagem do valor cinza mTurquoise2 clicando nela e visualize o total de ROIs da célula selecionada e as áreas de fundo clicando em Mostrar tudo no gerenciador de ROI. Observe todas as áreas selecionadas que são visíveis na imagem mTurquoise2.
      2. Clique em Medir no ROI Manager ou clique em Analyze | Medir. Observe a nova janela Resultados que se abre com os resultados da medição do sinal mTurquoise2.
      3. Transfira os resultados para um programa de cálculo de planilha clicando em Editar | Selecione tudo e copie/cole a lista na planilha para cálculo posterior.
      4. Ative a imagem do valor de cinza da β-catenina clicando nela e visualize as ROIs totais da célula selecionadas e as áreas de fundo clicando em Mostrar tudo no gerenciador de ROI. Observe todas as áreas selecionadas que são visíveis na imagem de β-catenina.
      5. Clique em Medir no ROI Manager ou clique em Analyze | Medir. Observe a nova janela Resultados que se abre com os resultados da medição do sinal total de β-catenina celular.
      6. Transfira os resultados para um programa de cálculo de planilha clicando em Editar | Selecione tudo e copie/cole a lista na planilha para cálculo posterior. Salve o gerenciador de ROI para referência futura sem ter que repetir a seleção de célula clicando em Mais | Salvar....
4. Calcule a fluorescência nuclear total corrigida (CTNF) para β-catenina ativa usando a equação 1.
   CTNF = Densidade integrada - (Área × média das áreas médias de fundo) (1)
5. Calcule a fluorescência celular total corrigida (CTCF) para mTurquoise2 usando a equação 2.
   CTCF = Densidade integrada - (Área × média das áreas médias de fundo) (2)
6. Diferencie entre β-catenina nuclear ativa e β-catenina citoplasmática subtraindo os valores de β-catenina nuclear obtidos na etapa 8.2.3.3. a partir dos valores de β-catenina celular total obtidos na etapa 8.3.2.5 para obter a β-catenina inativa citoplasmática.
   NOTA: Certifique-se de que as medições sejam feitas dentro da mesma célula.
   1. Calcule a média da intensidade média das áreas de fundo. Calcule CTNF e CTCF usando as equações 1 e 2. Considere IntDen (a soma de todos os pixels dentro da área selecionada) como a densidade integrada e não o RawIntDen.
   2. Se necessário, calcule o desvio padrão dos valores IntDen para plotar gráficos. Considere até 200 células separadas para análise estatística usando o teste U de Mann-Whitney.
7. Plote os resultados em um gráfico de ponto de dados individual e rotule o eixo y com os valores CTNF ou CTCF como Unidades Fluorescentes Relativas (RFU).

Resultados

Para investigar o papel da sinalização Wnt canônica, um modelo de repórter Wnt canônico Axin2-mTurquoise2 foi testado em combinação com a expressão da proteína β-catenina. Os timócitos são conhecidos por serem frágeis, apresentam baixa sinalização Wnt canônica em vários estágios do processo de maturação dos timócitos e têm uma baixa proporção citoplasmática para nuclear; todos esses fatores dificultam a detecção de mTurquoise2 citoplasmática ou β-catenina. Seguindo o protocolo, timócitos murinos de Axin2-mTurquoise2 fora...

Discussão

Vários repórteres Wnt canônicos estão disponíveis com diferentes sensibilidades de repórter e proteínas reais do repórter. Modelos repórter usando sítios de ligação TCF/LEF multimerizados introduzidos sinteticamente estão disponíveis com proteínas repórter fluorescentes; no entanto, essas repetições de transgenes podem ser perdidas durante a reprodução ou longos experimentos in vivo e podem ser sensíveis a sinais não-Wnt de sequências genômicas circundantes que influenciam a exp...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BD FACScitômetro de fluxo CantoII	BD Biosciences	não aplicável	Número de série V96300710. A configuração do citômetro de fluxo neste protocolo contém uma linha de laser de 405 nm com filtro passa-longo 505 e filtro passa-banda 530/30 nm e filtro passa-banda 470/20 nm; um laser de 488 nm com filtro passa-longa de 735 nm e filtro passa-banda de 780/60 nm, filtro passa-longa de 670 nm e filtro passa-longa de 655 nm, filtro passa-longo de 610 nm, filtro passa-longo de 550 nm e filtro passa-banda de 575/26 nm, filtro passa-longa de 505 nm e filtro passa-banda de 530/30 nm e filtro passa-banda de 488/10 nm; e uma linha de laser de 633 nm com filtro passa-longa de 735 nm e filtro passa-banda de 780/60 nm, filtro passa-longa de 685 nm e filtro passa-banda de 660/20 nm.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μ Filtro de célula M	Falcon/Corning	352350
Cytospin 4 Tipo A78300101	Thermo Scientific	não aplicável
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cônicos	Greiner bio-one	227261
Falcon tubos de teste de poliestireno de fundo redondo com tampa de pressão do filtro de células	Fisher Scientific
Soro Fetal de Bezerro (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	não aplicável	Depende da origem
Software Fiji	ImageJ	não aplicável	Versão 1.53
Cartão de filtro branco (para cytospin)	VWR	SHAN5991022
software FlowJo 10	Treestar	não aplicável	Versão 10.5.3
Deslizamentos de gelo	Klinipath
Gibco IMDM medium	Fisher Scientific
HCX PL APLO 40x 1.4 Lente a ÓLEO	Leica microsystems	não aplicável
Caneta hidrofóbica: Caneta Omm Edge	Vetor	não aplicável
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	não aplicável	A configuração do microscópio neste protocolo consistia em uma objetiva de imersão em óleo HCX PL APO 40x/1.2 com resolução de 8 bits, 1024 pixels x 1024 pixels, velocidade de 400 Hz, pinhole 68 e micro; m, e fator de zoom de 1,5 à temperatura ambiente. Este sistema contém um laser de diodo 405, laser de argônio, laser DPSS 561, laser HeNe 594 e laser HeNe 633 com 4 detectores híbridos (HyDs) e 5 tubos fotomultiplicadores (PMTs).
Metanol	VWR	1060091000
NaN3/azida de sódio	Farmácia hospitalar	não aplicável
Soro de camundongo normal	Camundongos próprios	não aplicáveis
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36965
Camundongo purificado anti-β-catenina (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Iodeto	Thermofisher	T3605
Esmalte transparente	em qualquer farmácia	não aplicável
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 kit de rotulagem	Thermofisher	Z25006