Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

A língua dos mamíferos é um órgão complexo crítico para o sabor, fala e processamento de alimentos. É composta por vários tipos de tecidos altamente organizados compartimentados por mesenchyme/tecido conjuntivo e cobertos por uma folha epitelial estratificada contendo papilas gustativas e papilas gustativas. Populações celulares em epitélio de língua e tecido mesenquime/conjuntivo são heterogêneas. Para entender melhor as funções e distribuição de um determinado tipo de células na língua, são necessários estudos com células dissociadas. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de célula única é um método poderoso e de alto rendimento para o perfil transcriômico em células individuais, que é projetado para entender o transcriptome de tecido complexo em uma resolução unicelular^1,2,3,4. A cultura celular primária tem sido comprovadamente uma ferramenta útil para estudar a função e diferenciação de células-tronco/progenitoras para as papilas gustativas^5,6. Esses estudos requerem uma grande quantidade de populações de células isoladas de alta qualidade (por exemplo, número celular total suficiente com concentração adequada e alta viabilidade).

Assim, é necessário isolar células de diferentes regiões dos tecidos linguais e em diferentes estágios de desenvolvimento. Atualmente, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e tecido mesenquime/conjuntivo subjacente. Aqui, relatamos um método otimizado de dissociação celular para preparar células para experimentos que requerem uma alta qualidade de células vivas, como para sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Descobrimos que a seleção de tampão de digestão enzimática, pipetação suave, seleção de meio de resuspensão e tempo e velocidade de centrifugação ideais são cruciais para gerar essas grandes quantidades de células de alta qualidade.

O uso de animais (C57BL/6 camundongos ao longo do estudo) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia e esteve de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para cuidados e uso de animais para pesquisa.

1. Uso de animais

NOTA: Os camundongos foram criados e mantidos na instalação animal do departamento de Ciência Animal e Leite na Universidade da Geórgia a 22 °C sob ciclos de dia/noite de 12h.

1. Designe meio-dia do dia da detecção de plugue vaginal em camundongos como embrionário (E) dia 0,5. Use embriões em E12,5 e camundongos pós-natais com 8 semanas de idade para os seguintes experimentos.

2. Preparação antes do experimento

NOTA: Os instrumentos necessários para este protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Instrumentos autoclave antes do experimento. Esterilizar instrumentos usando um esterilizador de contas durante o experimento.
2. Limpe a área cirúrgica, o microscópio de dissecação e o armário de biossegurança usando 70% de lenços de etanol. Ligue a luz UV do armário de biossegurança e mantenha-a acesa por 20 minutos antes do procedimento experimental.
3. Prepare uma mistura enzimática de 1:1 dispase (5.0 mg/mL) e colagenase (2,0 mg/mL) para uma concentração final de 2,5 e 1,0 mg/mL, respectivamente, e filtre a solução usando filtro de seringa 0,22 μm⁷.
   1. Prepare 1 mL de mistura enzimápica para uma língua adulta ou 0,5 mL para uma região específica da língua (por exemplo, posterior ou língua anterior).
   2. Prepare 2 mL de mistura enzimápica para línguas embrionárias.
4. Faça 10 mL de 2,5% BSA em 0,1 M PBS e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.
5. Faça 500 μL de 5% de FBS em DMEM/F12.
6. Faça 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.

3. Separação do epitélio da língua do mesenquime/tecido conjuntivo subjacente

1. Separação do epitélio do mesenquime de uma língua de rato E12.5
   1. Eutanize camundongos gestantes cronometrado carregando embriões E12,5 colocando-o em uma câmara de CO₂ seguido de luxação cervical.
      NOTA: Os embriões de camundongos no E12.5 são coletados após as 12:00 (tarde) no 12º dia após a detecção do plugue vaginal nos camundongos gestantes.
   2. Transfira ratos para a área cirúrgica. Molhe o abdômen do rato usando 70% de etanol para evitar que a pele entre no local de operação.
   3. Abra o abdômen usando uma tesoura dissecando para expor os chifres uterinos que carregam embriões. Disseque os chifres uterinos usando tesouras dissecando e transfira para 15 mL de solução fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
   4. Dissecar os embriões (Figura 1A₁) a partir de chifres uterinos sob um microscópio dissecando usando mini-tesouras e fórceps finos.
   5. Abra cuidadosamente a cavidade da boca, usando fórceps finos e dissecando a língua fora da mandíbula usando mini-tesoura(Figura 1A₂).
   6. Lave as línguas usando 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
   7. Transfira os tecidos para 2 mL de mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) em um prato de cultura de 35 mm com espátula e fórceps finos em um armário de biossegurança. Incubar por 20 min a 37 °C.
   8. Transfira as línguas para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm e remova suavemente o mesenquime do epitélio do lado ventral usando fórceps finos.
      NOTA: As folhas epiteliais podem ser separadas sem força mecânica durante a incubação.
   9. Lave a epitélio separada e mesenquime duas vezes em 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
      NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).
2. Separação do epitélio da língua do tecido conjuntivo subjacente de camundongos adultos
   1. Eutanize o rato com 8 semanas de idade colocando-o em uma câmara de CO_2. Confirme se o mouse é eutanizado sem respiração e resposta de pressão dianteira.
   2. Transfira os ratos para a área cirúrgica. Molhe a cabeça do rato usando 70% de etanol para evitar que os peles entrem na cavidade oral.
   3. Corte os cantos da boca ao longo da bochecha usando uma tesoura dissecando para abrir a cavidade oral. Dissecar a língua com mandíbula(Figura 1B₁) e coloque-a em um prato plástico com uma camada de plástico.
   4. Utilizando fórceps cirúrgicos para segurar a língua sob um microscópio dissecando, injete a mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) no espaço sub-epitelial da língua através da borda de corte(Figura 1B₁, setas) da língua posterior.
      1. Injete 1 mL de mistura enzimada uniformemente na língua inteira para coleta de tecido tanto da língua anterior quanto posterior.
      2. Injete 0,5 mL de mistura de enzima localmente à língua anterior para coleta de tecido da ponta da língua ou para a língua posterior para a coleta de tecido de papila circunvaltada.
         NOTA: A língua vai inchar à medida que a enzima se acumula(Figura 1B₂). A injeção suave da enzima pode evitar que a pressão danifique o epitélio e mantenha o máximo de enzimas possível na língua.
   5. Enrole a língua com plástico e incubar a língua por 30 min a 37 °C.
   6. Use mini-tesoura para dissecar a ponta da língua e/ou papila circunvaltada, e use espátula e fórceps finos para transferir tecido para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.
   7. Separe o epitélio do tecido conjuntivo subjacente no espaço sub-epitelial digerido pela enzima usando mini-tesouras. Corte os tecidos em um tamanho adequado de acordo com a exigência de experimentos a jusante.
   8. Lave o epitélio separado e o tecido conjuntivo subjacente duas vezes em 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.
      NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).

4. Dissociação celular

NOTA: O protocolo de dissociação celular descrito aqui pode ser aplicado ao epitélio da língua e ao tecido mesenquime/conjuntivo em camundongos embrionários E12,5 e 8 semanas de idade. Para reduzir a perda de celular durante a agitação e transferência de suspensão celular, use dicas comerciais de pipeta de baixa retenção ou pontas de pipeta pré-revestidas com 2,5% de BSA em 0,1 M PBS no pH 7.4⁸.

1. Transfira os tecidos usando espátula e fórceps finos para 3 mL de 0,25% trypsin-EDTA em um novo prato de cultura de 35 mm por 30 min a 37 °C. Agitar suavemente tecidos a cada 5 minutos com pontas de pipeta de 1 mL.
   NOTA: Não corte a ponta da pipeta, pois a borda de corte pode danificar fisicamente as células dissociadas.
2. Adicione 500 μL de 5% de FBS no DMEM/F12 para parar a reação e transfira o meio para um tubo de centrífuga de baixa ligação de 5 mL.
3. Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente e remova o supernasce.
4. Suspenda suavemente as células em 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA usando pontas de pipeta de 1 mL e filtre as células usando um coador de células de 70 μm, seguido por um coador de células de 35 μm.
5. Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente. Remova a maior parte do meio e deixe 50-300 μL como o volume final para re-suspender as células.
   NOTA: Ajuste a concentração das células de acordo com os requisitos dos experimentos a jusante alterando o volume final de suspensão de célula única.

5. Teste de contagem de células e viabilidade usando hemótmetro

NOTA: Para melhorar a precisão da medição, são recomendadas 3 réplicas técnicas para cada amostra.

1. Misture suavemente 5-10 μL da suspensão de célula única com um volume igual de azul Trypan e adicione ao hemócito.
   NOTA: Limpe bem o hemótmetro usando 70% de etanol antes de usar. As partículas de poeira no hemócito ficarão manchadas em azul escuro e afetarão a precisão do teste de viabilidade. Verifique o hemótmetro sob um microscópio.
2. Conte o número total de células, o número de células vivas (brancas) e o número de células mortas (azul escuro) manchadas pelo azul Trypan(Figura 2, setas) respectivamente em 4 quadrados com 16 grades(Figura 2) usando microscópio invertido com sistema de imagem.
3. Calcule a concentração celular:
   Concentração celular =
   1. Calcule a viabilidade:
      Viabilidade =

Separação do epitélio da língua do tecido mesenquime/conjuntivo subjacente
Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível após a digestão adequada da enzima. Folhas epiteliais de algumas línguas são separadas sem força mecânica durante a incubação.

Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas (Figura 1B2), o que sugere que a enzima pode ser mantida pela língua. A inserção insuficiente da enzima e/ou da agulha profunda na mesenquime e/ou na penetração epitelial da língua pela agulha induzirá um inchaço parcial da área de injeção ou nenhum inchaço. Após a digestão da enzima, os tecidos conjuntivos subjacentes com digestão enzimada adequada ficam soltos e pegajosos. Uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível ao levantar suavemente a borda da folha epitelial.

Efeito da dissociação celular no número total do celular e viabilidade
Com o passo 4, línguas E12,5, as folhas epiteliais e finas camadas de mesenquime imediatamente sob o epitélio das línguas foram agrupadas, respectivamente. A contagem manual de células utilizando um hemócito (Figura 2) demonstrou que o protocolo produziu 63.917 células no total com uma viabilidade de 95,2% das folhas epiteliais (cerca de 0,3 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1A3), e 294.333 células no total com viabilidade de 96,3% do mesenquime (cerca de 0,3 mm2 de tamanho por língua) (Figura 1A4).

Usando 10 línguas adultas com 8 semanas de idade, foram agrupadas as camadas de tecido contélio da ponta da língua (onde as papilas gustativas são densamente distribuídas), folhas epiteliais de papilas circunvalladas e finas camadas de tecido conjuntivo imediatamente sob o epitélio das papilas circunvaloladas, respectivamente. Uma contagem manual de células utilizando o hemocitômetro (Figura 2) demonstrou que o protocolo produziu 187.333 células no total com uma viabilidade de 95,4% de folhas epiteliais de ponta da língua (cerca de 0,075 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1B3), 544.000 células no total com uma viabilidade de 96,3% de folhas epiteliais de papilas circunvaloladas (cerca de 0,1 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1B5), e 150.500 células no total com uma viabilidade de 93% de tecidos conjuntivos (cerca de 0,1 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1B6).

Figura 1. Preparação tecidual para dissociação celular. A) Imagens representativas de um embrião inteiro E12,5 (A1),visão dorsal da língua dissecada (A2),e folhas epiteliais (A3) e mesenquime (A4) separadas das línguas. B) Imagens representativas de uma língua adulta antes (B1) e após injeção de enzima (B2). Vista dorsal de uma folha epitelial (B3) e mesenquime (B4) de ponta de língua, e uma folha epitelial (B5) e tecido conjuntivo subjacente (B6) de papila circunvallada. Barras de escala: 1 mm em A1, A3, A4, B1, B2; 200 μm em A2; 100 μm em B3,B4, B5 e B6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagens representativas de células isoladas visualizadas no hemócito. A) Células isoladas de folhas epiteliais (A1) e mesenquime (A2) de embriões em E12,5. B) Células isoladas de folhas epiteliais (B1) e núcleos de tecido conjuntivo subjacente (B2) de papilas circunvaloladoras aos 8 semanas de idade. As linhas tracejadas circundam as grades amplificadas no canto superior direito. Flechas apontam para células mortas manchadas pelo azul Trypan. Barras de escala: 100 μm para B1, B2,B3e B4; 25 μm para imagens de alta potência no canto superior direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nenhum conflito de interesses declarado.