Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.
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Artigo de método
In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreender as alterações efêmeras que ocorrem durante o desenvolvimento e amadurecimento cerebral requer imagens detalhadas de alta resolução no espaço e no tempo na resolução celular e subcelular. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter numerosas informações detalhadas sobre os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento cerebral no embrião transparente de zebrafish. Recentemente, os processos de refinamento da conectividade neuronal que ocorrem em estágios larvais posteriores várias semanas após a fertilização, que são, por exemplo, o controle do comportamento social, tomada de decisão ou comportamento motivado por motivação, passaram a se concentrar na pesquisa. Nestas fases, a pigmentação da pele do zebrafish interfere com a penetração da luz no tecido cerebral, e soluções para estágios embrionários, por exemplo, inibição farmacológica da pigmentação, não são mais viáveis.
Portanto, é fornecida uma solução cirúrgica minimamente invasiva para o acesso de microscopia ao cérebro de zebrafish acordado que é derivada de abordagens eletrofisiológicas. Em teleosts, a cartilagem da pele e do crânio macio pode ser cuidadosamente removida micro-descascando essas camadas, expondo neurônios subjacentes e tratos axonais sem danos. Isso permite o registro da morfologia neuronal, incluindo estruturas sinápticas e seus conteúdos moleculares, e a observação de alterações fisiológicas como transitórios Ca2+ ou eventos de transporte intracelular. Além disso, o interrogatório desses processos por meio de inibição farmacológica ou manipulação optogenética é viável. Esta abordagem de exposição cerebral fornece informações sobre mudanças estruturais e fisiológicas nos neurônios, bem como a correlação e interdependência desses eventos no tecido cerebral vivo na faixa de minutos ou horas. A técnica é adequada para imagens cerebrais in vivo de larvas de zebrafish até 30 dias após a fertilização, o último estágio de desenvolvimento testado até agora. Assim, fornece acesso a questões tão importantes como refinamento sináptico e dimensionamento, transporte axonal e dendrático, direcionamento sináptico de carga citoesquelética ou expressão local dependente de atividades. Portanto, um uso amplo para esta abordagem de montagem e imagem pode ser antecipado.
Introdução
Nas últimas décadas, o zebrafish (Danio rerio) evoluiu como um dos organismos modelo vertebrados mais populares para estudos de desenvolvimento embrionário e larval. A grande fecundidade das fêmeas de zebrafish aliada ao rápido desenvolvimento ex utero do embrião e sua transparência durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário são apenas alguns dos fatores-chave que fazem do zebrafish um poderoso organismo modelo para resolver questões de desenvolvimento1. Avanços nas tecnologias genéticas moleculares combinados com estudos de alta resolução in vivo de imagem permitiram abordar mecanismos biológicos cel....
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Protocolo
Todo o trabalho animal descrito aqui está de acordo com as regulamentações legais (Diretiva UE 2010/63). A manutenção e manuseio de peixes foram aprovadas pelas autoridades locais e pelo representante do bem-estar animal da Technische Universität Braunschweig.
1. Preparação de fluido espinhal cerebro artificial (ACSF), agarose de baixo derretimento e agulhas de vidro afiadas
- Prepare o ACSF dissolvendo os produtos químicos listados nas seguintes concentrações em água destilada. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1.2 mM MgCl2 6x H2O (203,3 g/mol), 10 mM ....
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Resultados
Figura 3AC mostrar uma larva dpf de 14 dpf da linha transgênica Tg [-7.5Ca8:GFP]bz12[15] com o crânio ainda intacto. As células pigmentadas na pele sobreposta estão distribuídas por toda a cabeça e estão interferindo com o sinal de fluorescência na região de interesse (aqui, cerebelo). Com a larva nesta condição, não é possível obter imagens de alta resolução do cérebro. Figur.......
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Discussão
O método apresentado fornece uma abordagem alternativa ao isolamento cerebral ou ao tratamento de larvas de zebrafish com fármacos inibindo pigmentação para registro de imagens de alta resolução de neurônios em seu ambiente in vivo. A qualidade das imagens registradas com este método é comparável às imagens de cérebros explantados, mas em condições naturais.
Além disso, evita-se uma perda de intensidade de fluorescência, pois não há necessidade de tratamento com fixativos
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos especialmente a Timo Fritsch pelo excelente cuidado animal e Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti e Barbara Winter pelo apoio útil. Também somos gratos a todos os outros membros do laboratório Köster por seu feedback. O projeto foi financiado em parte pelo projeto da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (para a RWK) e pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projeto 01EW1520 para JCM) é reconhecido.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de cálcio | Roth | A119.1 | |
| Microscópio de varredura a laser confocal | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Capilar de vidro tipo 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Capilar de vidro tipo 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Lamínula de vidro | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Câmara de imagem | Ibidi | 81156 | |
| Cloreto de potássio | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Cloreto de magnésio (hexahidratado) | Roth | A537.4 | |
| Câmera de microscópio | Leica | DFC9000 GTC | |
| Extrator de agulhas tipo 1 | NARISHIGE | Modelo PC-10 | |
| Extrator de agulhas tipo 2 | Instrumentos Sutter | Modelo P-2000 | |
| Pasteur-Pipetas 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Cloreto de sódio | Roth | P029.2 | |
| Hidróxido de sódio | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Banho-maria | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| Placa de Petri de 35 mm | Sarstedt | 833900 | |
| Placa de Petri de 90 mm | Sarstedt | 821473001 |
Referências
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2....
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Reimpressões e permissões
