Este protocolo ilustra um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados na cromatina. Demonstra-se a formação de corpo nuclear de leucemia promielolítica (PML) em telômeros com dimerizadores químicos. O crescimento, a dissolução, a localização e a composição são monitoradas com imagem de células vivas, imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).
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Artigo de método
Condensados de proteína induzidas por dimerização química em telômeros
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os condensados associados à cromatina estão implicados em muitos processos nucleares, mas os mecanismos subjacentes permanecem evasivos. Este protocolo descreve um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados em telômeros. O dimerizer químico consiste em dois ligantes ligados que cada um pode se ligar a uma proteína: ligante halo à enzima halo e trimetoprim (TMP) a E. coli dihidrofolate reductase (eDHFR), respectivamente. Fusão da enzima Halo a uma proteína de telômero ancora dimerizers aos telômeros através da ligação entre ligand ligand-enzima halo covalente. A vinculação do TMP ao eDHFR recruta a fase fundida pelo eDHFR que separa proteínas aos telômeros e induz a formação de condensados. Como a interação TMP-eDHFR não é covalente, a condensação pode ser revertida usando TMP livre em excesso para competir com o dimerizer para a ligação eDHFR. Um exemplo de indução da formação nuclear da leucemia promicocítica (PML) nos telômeros e na determinação do crescimento, dissolução, localização e composição da condensação. Este método pode ser facilmente adaptado para induzir condensados em outros locais genômicos, fundindo halo a uma proteína que se liga diretamente à cromatina local ou ao dCas9 que é direcionado ao lócus genômico com um RNA guia. Ao oferecer a resolução temporal necessária para imagens vivas de células únicas, mantendo a separação de fase em uma população de células para ensaios bioquímicos, este método é adequado para sondar tanto a formação quanto a função de condensados associados à cromatina.
Introdução
Muitas proteínas e ácidos nucleicos sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) e se auto-montam em condensados biomoleculares para organizar a bioquímica nas células1,2. LLPS de proteínas de ligação de cromatina leva à formação de condensados que estão associados a loci genômicos específicos e estão implicados em várias funções locais de cromatina3. Por exemplo, LLPS de proteína HP1 está por trás da formação de domínios heterocromatinas para organizar o genoma4,5, LLPS de fatores de transcrição forma centros de transcrição ....
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Protocolo
1. Produção de linhas celulares transitórias
- Cultura U2OS células aceitadoras em tampas de vidro de 22 x 22 mm (para imagem ao vivo) ou tampas circulares de 12 mm de diâmetro (para IF ou FISH) revestidas com poli-D-lisina em 1 Placa de 6 poços com meio de crescimento (10% soro bovino fetal e 1% solução de penicilina-estreptomicina no DMEM) até atingirem 60-70% de confluência.
- Substitua o meio de crescimento por meio de transfecção de 1 mL (meio de crescimento sem solução penicilina-estreptomicina) antes da transfecção.
- Para cada poço de transfecção, adicione 4 reagentes de transfecção μL a 150 μL de mídia súmada reduzida,....
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Resultados
Imagens representativas da localização telômica do SUMM identificado pelo DNA de telômero FISH e pela proteína SUME são mostradas na Figura 2. Células com recrutamento de SIM enriqueceram o SUMO1 e o SUMÔ 2/3 nos telômeros em comparação com células com recrutamento mutante SIM. Isso indica que o enriquecimento de SUM induzido por dimerização do SIM nos telômeros depende das interações SUMO-SIM.
Um filme de lapso de tempo representativo do TRF1 e DO SIM após a dime.......
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Discussão
Este protocolo demonstrou a formação e dissolução de condensados em telômeros com um sistema de dimerização química. Cinéticas de separação de fase e agrupamento de telômeros induzidos por gotículas são monitorados com imagens ao vivo. A localização e a composição do condensado são determinadas com DNA FISH e proteína IF.
Há dois passos críticos neste protocolo. A primeira é determinar a concentração de proteínas e dimerizer. O sucesso em induzir a separação de fase local em um lócus genômico .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e fundação Charles E. Kaufman para h.Z. Os autores gostariam de agradecer jason Tones por revisar o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina, 0,1% de EDTA em HBSS sem cálcio, magnésio e bicarbonato de sódio | Corning | MT25053CI | |
| 16% de formaldeído (p/v), sem metanol | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% em 1x PBS |
| 6 Placa de cultura de poços | VWR | 10861-554 | |
| Folha de alumínio | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry anticorpo | Abcam | Ab183628 | |
| Anticorpo anti-PML | Santa Cruz | sc966 | |
| Anticorpo anti-SUMO1 | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 anticorpo | Citoesqueleto | Asm23 | |
| Reagente bloqueador | Roche | 11096176001 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Tubo BTX micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Lamelas de Cobertura Circular | Thermo Scientific | 3350 | |
| Microscópio confocal | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI Fisher | Scientific | D1306 | |
| Dimetil Sulfóxido | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM com L-Glutamina, 4.5g/L Glicose e Piruvato de Sódio | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Etanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Soro Fetal Bovino, Qualificado, Regiões Aprovadas pelo USDA | Gibco | A4766801 | |
| Formamida, Millipore DeionizadoSigma | 46-101-00ML | ||
| IgG anti-rato de cabra (H + L), Anticorpo secundário recombinante, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| IgG anti-coelho de cabra (H+L), anticorpo secundário recombinante, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Fisher Scientific | 12-000-122 | ||
| Módulo de fusão a laser | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Software de plotagem de figuras, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscópio Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Esmalte | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Software de imagem, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Mídia de Soro Reduzida | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| , 100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pontas de pipeta | VWR | 10017 | |
| Lâminas de microscópio de canto cortadas lisas e foscos | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Sigma-Aldrich | A-003-E | ||
| Azida de sódio | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Disco giratório | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Lamínulas Quadradas | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solução | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Sintetizado pelo laboratório | Disponível mediante solicitação | |
| TNH | Sintetizado pelo laboratório | Disponível mediante solicitação | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solução | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0,5% em 1x linha celular PBS |
| U2Os | Do laboratório E.V. Makayev (Universidade Tecnológica de Nanyang, Cingapura) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Montagem Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
Referências
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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Reimpressões e permissões
