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Artigo de método

Condensados de proteína induzidas por dimerização química em telômeros

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DOI:

10.3791/62173

⸱

12 de abril de 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Este protocolo ilustra um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados na cromatina.  Demonstra-se a formação de corpo nuclear de leucemia promielolítica (PML) em telômeros com dimerizadores químicos. O crescimento, a dissolução, a localização e a composição são monitoradas com imagem de células vivas, imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).

Resumo

Os condensados associados à cromatina estão implicados em muitos processos nucleares, mas os mecanismos subjacentes permanecem evasivos. Este protocolo descreve um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados em telômeros. O dimerizer químico consiste em dois ligantes ligados que cada um pode se ligar a uma proteína: ligante halo à enzima halo e trimetoprim (TMP) a E. coli dihidrofolate reductase (eDHFR), respectivamente. Fusão da enzima Halo a uma proteína de telômero ancora dimerizers aos telômeros através da ligação entre ligand ligand-enzima halo covalente. A vinculação do TMP ao eDHFR recruta a fase fundida pelo eDHFR que separa proteínas aos telômeros e induz a formação de condensados. Como a interação TMP-eDHFR não é covalente, a condensação pode ser revertida usando TMP livre em excesso para competir com o dimerizer para a ligação eDHFR. Um exemplo de indução da formação nuclear da leucemia promicocítica (PML) nos telômeros e na determinação do crescimento, dissolução, localização e composição da condensação. Este método pode ser facilmente adaptado para induzir condensados em outros locais genômicos, fundindo halo a uma proteína que se liga diretamente à cromatina local ou ao dCas9 que é direcionado ao lócus genômico com um RNA guia. Ao oferecer a resolução temporal necessária para imagens vivas de células únicas, mantendo a separação de fase em uma população de células para ensaios bioquímicos, este método é adequado para sondar tanto a formação quanto a função de condensados associados à cromatina.

Introdução

Muitas proteínas e ácidos nucleicos sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) e se auto-montam em condensados biomoleculares para organizar a bioquímica nas células1,2. LLPS de proteínas de ligação de cromatina leva à formação de condensados que estão associados a loci genômicos específicos e estão implicados em várias funções locais de cromatina3. Por exemplo, LLPS de proteína HP1 está por trás da formação de domínios heterocromatinas para organizar o genoma4,5, LLPS de fatores de transcrição forma centros de transcrição para regular transcrição6, LLPS de mRNAs nascentes e proteína de combs multi-sexo gera corpos histonas locus para regular a transcrição e processamento de histone mRNAs7.  No entanto, apesar de muitos exemplos de condensados associados à cromatina serem descobertos, os mecanismos subjacentes de formação, regulação e função de condensado permanecem mal compreendidos. Em particular, nem todos os condensados associados à cromatina são formados através de LLPS e avaliações cuidadosas da formação de condensados em células vivas ainda são necessárias8,9. Por exemplo, a proteína HP1 no camundongo é mostrada ter apenas uma capacidade fraca de formar gotículas líquidas em células vivas e os focos de heterocromatina se comportam como glóbulos polímeros colados10. Portanto, são desejáveis ferramentas para induzir novos condensados na cromatina em células vivas, particularmente aquelas que permitem o uso de imagens vivas e ensaios bioquímicos para monitorar a cinética da formação de condensados, as propriedades físicas e químicas dos condensados resultantes e as consequências celulares da formação de condensados.

Este protocolo relata um sistema de dimerização química para induzir condensados proteicos na cromatina11 (Figura 1A). O dimerizer consiste em dois ligantes interligadores de proteínas ligados: trimetoprim (TMP) e ligante halo e pode escurecer proteínas fundidas aos receptores cognatos: Escherichia coli dihidrofolate reductase (eDHFR) e uma enzima de alkyldehalogenase bacteriana (enzima halo),respectivamente 12. A interação entre ligante halo e enzima halo é covalente, permitindo que a enzima Halo seja usada como uma âncora, fundindo-a a uma proteína de ligação de cromatina para recrutar uma proteína de separação de fase fundida ao eDHFR à cromatina. Após o recrutamento inicial, o aumento da concentração local da fase de separação da proteína passa pela concentração crítica necessária para a separação de fases e, assim, nuclea um condensado na âncora(Figura 1B). Ao fundir proteínas fluorescentes (por exemplo, mCherry e eGFP) para eDHFR e Halo, a nucleação e o crescimento de condensados podem ser visualizados em tempo real com microscopia de fluorescência. Como a interação entre eDHFR e TMP não é covalente, o TMP livre em excesso pode ser adicionado para competir com o dimerizer para a vinculação eDHFR. Isso liberará então a proteína de separação de fase da âncora e dissolverá o condensado associado à cromatina.

Utilizamos esta ferramenta para induzir a formação nuclear de leucemia promyelocítica (PML) em telômeros em células cancerígenas telomerase-negativas que utilizam um alongamento alternativo de telômeros (ALT) caminho para manutenção de telômeros13,14.  Os corpos nucleares pml são compartimentos sem membrana envolvidos em muitos processos nucleares15,16 e são exclusivamente localizados aos telômeros ALT para formar APBs, para os corpos PML associados ao telômero ALT17,18. Os telômeros agrupam-se dentro dos APBs, presumivelmente para fornecer modelos de reparo para síntese de DNA de telômero direcionada à ímologia em ALT19. De fato, a síntese de DNA de telômero foi detectada em APBs e APBs desempenham papéis essenciais no enriquecimento de fatores de reparação de DNA nos telômeros20,21. No entanto, os mecanismos subjacentes à montagem de APB e ao agrupamento de telômeros dentro das APBs eram desconhecidos. Uma vez que as proteínas de telômero em células ALT são modificadas exclusivamente por pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina (SUMOs)22,muitos componentes APB contêm sítios de sumô 22,23,24,25 e/ou25 Os motivos que interagem pelo SUMSUMO (SIMs)26,27 e as interações SUMO-SIM impulsionam a separação de fase28,hipótesemos que o sumô em telômeros leva ao enriquecimento do SUMO/SIM contendo proteínas e As interações SUM-SIM entre essas proteínas levam à separação de fases.  A proteína PML, que tem três locais de sumô e um site sim, pode ser recrutada para telômeros sumôs para formar APBs e coalescência de APBs líquidos leva ao agrupamento de telômeros. Para testar essa hipótese, utilizamos o sistema de dimerização química para imitar a formação de APB induzida por sumô, recrutando SIM para telômeros(Figura 2A)11. O GFP é fundido à Haloenzyme para visualização e à proteína de ligação de telômeros TRF1 para ancorar o dimerizer aos telômeros. O SIM é fundido para eDHFR e mCherry. Cinéticas da formação de condensado e agrupamento de telômeros induzidos por fusão de gotículas são seguidos com imagens de células vivas.  A separação de fase é revertida adicionando TMP livre de excesso para competir com a vinculação eDHFR. A imunofluorescência (IF) e a fluorescência na hibridização situ (FISH) são utilizadas para determinar a composição do condensado e a associação telômérica. O recrutamento do SIM enriquece o SUM nos telômeros e os condensados induzidos contêm PML e, portanto, são APBs. Recrutar um mutante SIM que não pode interagir com o SUMH não enriquece o SUMô em telômeros ou induz a separação de fases, indicando que a força motriz fundamental para a condensação de APB é a interação SUMO-SIM. Concordando com essa observação, polímeros poliSUMO-polySIM que fundiram-se a um fator de ligação TRF2 RAP1 também podem induzir a formação de APB29. Em comparação com o sistema de fusão polySUMO-polySIM, onde a separação de fase ocorre enquanto proteínas suficientes forem produzidas, a abordagem de dimerização química aqui apresentada induz a separação de fases sob demanda e, portanto, oferece melhor resolução temporal para monitorar a cinética da separação de fases e do processo de agrupamento de telômeros. Além disso, este sistema de dimerização química permite o recrutamento de outras proteínas para avaliar sua capacidade em induzir a separação de fases e agrupamento de telômeros. Por exemplo, uma proteína desordenada recrutada para telômeros também pode formar gotículas e telômeros sem induzir a formação de APB, sugerindo que o agrupamento de telômeros é independente da química apb e depende apenas da propriedade líquida APB11.

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Protocolo

1. Produção de linhas celulares transitórias

  1. Cultura U2OS células aceitadoras em tampas de vidro de 22 x 22 mm (para imagem ao vivo) ou tampas circulares de 12 mm de diâmetro (para IF ou FISH) revestidas com poli-D-lisina em 1 Placa de 6 poços com meio de crescimento (10% soro bovino fetal e 1% solução de penicilina-estreptomicina no DMEM) até atingirem 60-70% de confluência.
  2. Substitua o meio de crescimento por meio de transfecção de 1 mL (meio de crescimento sem solução penicilina-estreptomicina) antes da transfecção.
  3. Para cada poço de transfecção, adicione 4 reagentes de transfecção μL a 150 μL de mídia súmada reduzida, vórtice por 10 segundos e, em seguida, incubar por 5 minutos.
  4. Para cada poço, adicione halo construto plasmídeo (Halo-GFP-TRF1 ou Halo-TRF1) e eDHFR construa plasmídeo (mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM mutante) a uma proporção de massa de 1:1 (0,5 μg Halo constrói plasmídeo com 0,5 μg eDHFR construção plasmid) para 150 μL mídia de soro reduzido, dropwise, mistura por pipetação.
    NOTA: As tags são relativamente pequenas (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) e nenhum efeito na separação de fase foi observado. No entanto, o uso de mutantes como o mutante SIM usado aqui para garantir que o comportamento de fase seja sensível às mutações e não às tags é aconselhado. SIM é de PIASx28,30. Sequência sim é AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGACGAATCTAGCAGCGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Sim mutante é gerado por aminoácidos SIM mutantes VIDL para VADA28, e a sequência é AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGACGACGACTAGCAGAGAGAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Depositamos nossos plasmídeos para addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutante.
  5. Adicione 150 μL de reagente de transfecção -mistura de mídia sérico reduzida a 150 μL de mídia sérico reduzida com DNA, dropwise, misture por pipetação, incubar por 5 minutos.
  6. Adicione os 300 μL de mistura reagente-DNA de transfecção às células, dropwise e, em seguida, coloque as células de volta à incubadora.
  7. Aguarde 24-48 horas antes da imagem ao vivo, imunofluorescência (IF) ou fluorescência na hibridização situ (FISH).

2. Dimerização em telômeros

  1. Dissolva os dimerizadores em sulfoxida de dimetila a 10 mM e armazene em tubos de microcentrifusagem de plástico a −80 °C para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: Em vez de usar o dimerizer com TMP diretamente ligado ao Halo (TMP-Halo, TH), o dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) que tem um linker fotossensível, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), entre TMP e Haloligand é usado31. Isso porque leva menos tempo para o TNH (~5 minutos) se difundir na célula do que o TH (~20 minutos). Os resultados aqui mostrados também podem ser obtidos usando TH. Ao usar tnh, tenha cuidado para não expor o dimerizer à luz para evitar o decote NOVC. Manuseie o TNH em uma sala escura com uma lâmpada de luz vermelha fraca, armazene o dimerizer em tubos de plástico âmbar e enrole o recipiente contendo TNH ou células tratadas com papel alumínio. A imagem TNH com DIC é segura.
  2. Pegue uma alíquota de dimerizer de 10 mM de −80 °C e dilue em meio de imagem para uma concentração de estoque de 10 μM e armazene a −20 °C.
  3. Quando estiver pronto para usar, diluir os dimerizers da solução de estoque de 10 μM para uma concentração final de trabalho de 100 nM em meio de crescimento (para imagem fixa) ou meio de imagem. Trate as células com dimerizers de 100 nM (concentração final) no palco para imagens ao vivo ou incubar por 4-5 horas para imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).
    NOTA: A concentração de dimerizadores utilizados afeta a eficiência da dimerização e, portanto, a separação de fases. A concentração de dimerizer que permite a máxima eficiência de dimerização depende do tipo celular e da concentração de proteína âncora, por isso precisará ser determinada para diferentes experimentos. Uma maneira simples é incubar células expressando a proteína âncora e mCherry-eDHFR (sem fundir a fase que separa proteínas ou fundida a um mutante de separação não-fase) e identificar a concentração de dimerizer na qual a maior intensidade mCherry na âncora é alcançada. Uma abordagem mais sistemática é incubar células expressando a âncora apenas com diferentes concentrações de dimerizadores e, em seguida, com um corante de ligação halo para ajudar a determinar a concentração de dimerizador em que a intensidade de corante de ligação halo começa a planar (ou seja, todas as âncoras com halo-fundido são ocupadas pelo dimerizador e não restam mais para o corante de ligação halo)32.
  4. Para reverter a dimerização, incubar células com dimerizers por 2-5 horas (com ou sem imagem viva) ou até que o tamanho da gotícula desejada seja alcançado e adicione 100 μM livre de TMP (concentração final) diluído em imagens médias para células.

3. Imunofluorescência (IF)

  1. Semente 105 células em óculos de cobertura circular de 12 mm de diâmetro revestidos com poli-D-lysine em placa de 6 poços. Em seguida, transfeme os dois plasmídeos (Halo-GFP-TRF1 com mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM mutante) e espere 24-48 horas antes de prosseguir para a imunofluorescência.
    NOTA: Aguarde mais de um dia após a transfecção obter maior expressão.
  2. Dimerizers diluídos com meio de crescimento para atingir uma concentração final de 100 nM, adicione dimerizers diluídos às células e incubar a 37 °C por 4-5 horas.
    NOTA: A separação de fase é rapidamente induzida após a adição de dimerizers (< 30 minutos). A incubação mais longa ajuda gotículas grosseiras em tamanhos maiores. Seguir o crescimento de gotículas com imagens vivas pode ser usado para determinar o tempo que as gotículas levam para atingir um estado desejado.
  3. Fixar células em solução PBS contendo 4% de formaldeído e 0,1% Triton X-100 por 10 minutos à temperatura ambiente para células permeabilizes. Lave as células 3 vezes com PBS.
    NOTA: Após esta etapa, pode ser pausada e as células podem ser armazenadas a 4 °C por até uma semana.
    Atenção: O formaldeído é prejudicial pela inalação e, se engolido, também irrita os olhos, o sistema respiratório e a pele e é um possível risco de câncer. Precisa usar equipamento de proteção individual, usar apenas em um capuz de fumaça química. Coloque-o também em um recipiente de resíduos após o uso, não o descarte na pia.
  4. A lavagem cobre deslizamentos duas vezes com 50 μL TBS-Tx e uma vez com tampão de diluição de anticorpos de 50 μL (AbDil). TBS-Tx foi feito pela TBS, 0,1% Triton X-100 e 0,05% Na-azide. A AbDil foi feita pela TBS-Tx, 2% BSA e 0,05% Na-azide.
  5. Incubar cada deslizamento com 50 μL anti-PML primário (diluição 1:50 em AbDil) / anti-SUMO1 (diluição de 1:200 em AbDil) / anticorpo anti-SUMO2/3 (diluição 1:200 em AbDil) a 4 °C em uma câmara umidificada durante a noite. Anticorpo mCherry também pode ser usado (diluição de 1:200 em AbDil) para ajudar a detectar o sinal mCherry para FISH.
    NOTA: O PEIXE sacia o sinal fluorescente mCherry, o que dificulta a diferenciação de células transfeinadas com plasmídeos mCherry daqueles que não são transfectados em experimentos de PEIXE. O uso de anticorpos mCherry é aconselhável. Alternativamente, pode-se fazer uma linha celular estável expressando eDHFR contendo proteína.
  6. Lavar tampas 3 vezes com AbDil para remover anticorpo primário desvinculado.
  7. Incubar células com anticorpo secundário [anticorpo secundário IgG (H+L) de anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 647 para PML e SUMO, anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) conjugado com Alexa Fluor 555 para mCherry, ambos a 1:1000 diluição em AbDil] por 1 hora em caixa escura à temperatura ambiente.
  8. As tampas de lavagem são 3 vezes com TBS-Tx.
  9. Slides de etiqueta, diluir DAPI na mídia de montagem para alcançar a concentração final da DAPI de 1 μg/mL. Em seguida, coloque 2 DAPI diluídos de 2 μL no slide. Vire as tampas e coloque-as na gota DAPI, aspirar fluido extra da borda do deslizamento de tampas.
  10. Sele com esmalte, deixe secar e enxágue do topo da tampa com água. Guarde no congelador para imagens.

4. Fluorescência na hibridização situ (FISH)

  1. Semente 105 células em óculos de cobertura circular de 12 mm de diâmetro revestidos com poli-D-lysine em placa de 6 poços. Células transfectas com Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM plasmídeos mutantes e esperam por 24-48 h antes de prosseguir para FISH. O passo de dimerização é o mesmo descrito em 3.2.
    NOTA: Aqui o TRF1 não é fundido com o GFP para que o canal verde seja liberado para a sonda de DNA de telômero.
  2. Fixar células com 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente e lavar 4 vezes com PBS. Para IF-FISH, proceda ao protocolo IF daqui e depois de lavar anticorpos secundários em IF (3.8), refixar células com 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente e lavar três vezes com PBS.
  3. A desidratação cobre deslizamentos em uma série de etanol (70%, 80%, 90%, 2 minutos cada).
  4. Incubar tampas com sonda PNA de 488 telC (proporção 1:2000) em solução de hibridização de 5 μL a 75 °C por 5 minutos. A solução de hibridização contém 70% de formamida deionizada, 10 mM Tris (pH 7,4), reagente de bloqueio de 0,5%. Em seguida, incubar durante a noite em uma câmara umidificada à temperatura ambiente.
  5. Lavar tampas com tampão de lavagem (70% formamida, 10 mM Tris) 2 minutos por 3 vezes à temperatura ambiente e montar com 1 μg/mL DAPI em mídia de montagem para imagem.
    NOTA: O protocolo FISH é um protocolo publicado33'34.

5. Imagem ao vivo

  1. Quando as células estão prontas para a imagem, as tampas de montagem em câmaras magnéticas com células mantidas em meio de imagem de 1 mL sem fenol vermelho em um estágio aquecido em uma câmara ambiental.
  2. Configure microscópio e aparato de controle ambiental. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de disco giratório com um objetivo 100x 1.4 NA, um Piezo Z-Drive, uma câmera de dispositivo acoplado a carga (EMCCD) de elétrons e um módulo de fusão a laser equipado com lasers 455, 488, 561, 594 e 647 nm controlados por software de imagem. Os poderes de saída para todos os lasers são medidos em 20 mW na extremidade da fibra.
  3. Localize células com sinal GFP brilhante nos telômeros e sinal mCherry localizado difusivamente no nucleoplasma. Encontre cerca de 20 células, memorize cada posição com informações x, y, z e configure parâmetros para imagens de lapso de tempo com espaçamento de 0,5 μm para um total de 8 μm em Z e intervalo de tempo de 5 minutos para 2-4 horas para ambos os canais GFP e mCherry. Use 30% de 594 nm e 50% de intensidade de potência de 488 nm, com tempos de exposição de 200 ms e ganho de câmera de 300.
    NOTA: A potência de saída das unidades laser é de 20 mW. Os focos GFP brilhantes indicam tamanho de âncora maior que pode nuclear condensados mais facilmente. Encontre células com uma ampla gama de sinal mCherry porque a separação de fase depende da concentração de SIM na célula. Células com sinal mCherry muito escuro ou muito brilhante podem não se separar de fase. Para evitar fotobleaching, não use muita potência laser ou muito tempo de exposição.
  4. Inicie a imagem e faça um loop único como pré-dimerização. Pausar a imagem, adicionar 0,5 mL de mídia de imagem contendo 15 μL de dimerizer de 10 μM à câmara de imagem no palco de modo que a concentração final de dimerizer seja de 100 nM. Retomar a imagem.
  5. Quando estiver pronto para reverter a dimerização, pause a imagem, adicione 0,5 mL de mídia de imagem contendo 2 μL de 100 mM de estoque TMP à câmara de imagem no palco para obter 100 μM TMP concentração final. Continuem as células de imagem por 1-2 horas.

6. Imagem fixa

  1. Mesmo microscópio configurado como imagens ao vivo, o aquecimento do palco não é necessário. Use 488 nm para imagem de telômero FISH, 561 nm para mCherry IF e 647 nm para PML ou SUMO IF.
    NOTA: Se não estiver usando um anticorpo mCherry, basta imaginar diretamente a proteína mCherry, mas sinal talvez fraca por causa da sacieciação em PEIXES.  Ainda use 561 nm em vez de laser de 594 nm para imaginar mCherry para evitar o sinal de sangramento de Cy5 para mCherry.
  2. Localize cerca de 30-50 células com sinal vermelho (mCherry ou mCherry IF) para selecionar para células transfeinadas.
  3. As imagens foram tiradas com espaçamento de 0,3 μm para um total de 8 μm em Z para coleta de mais sinais. Use 80% de 647 nm, 80% de 561 nm, e 70% de intensidade de potência de 488 nm, com tempos de exposição de 600 ms e ganho de câmera de 300.

7. Processar imagens de lapso de tempo

  1. Definir binário para telômeros
    Escolha uma célula com informações de sempre e z-stack, escolha apenas o canal GFP e crie uma camada binária definindo o limiar. Ajuste os valores inferiores e superiores do limiar e use funções como "Liso", "Limpar" e "Preencher buracos" para ver o quão bem o limiar capta os objetos desejados em todos os pontos de tempo.
  2. Subtrair fundo
    Escolha todos os canais, desenhe o retângulo Região de Interesse (ROI) em segundo plano (além da célula). Defina este ROI como plano de fundo e, em seguida, subtraia a intensidade de fundo.
  3. Link telomere binário à intensidade do telômero
    Escolha o binário do telômero e vincule-o ao canal GFP para calcular a intensidade do GFP nos objetos binários como intensidade de telômero.
  4. Calcular número de telômero e intensidade ao longo do tempo
    Especifique quais informações devem ser exportadas, como tempo, ID do objeto, intensidade média, intensidade da soma e dados de exportação. Use o software de plotagem de figuras para ler a tabela exportada e gerar figuras do número de telômero e intensidade do telômero (resumir a intensidade sobre o volume em cada telômero e, em seguida, a média sobre todos os telômeros em uma célula) ao longo do tempo.

8. Processar imagens de células fixas

  1. Definir binário para APBs
    Escolha células transfeinadas para análise procurando sinal no canal de 561nm. Após o procedimento em 7.1, defina limiar tanto no canal GFP (Telomere DNA FISH) quanto no Cy5 (PML ou SUMO IF) para gerar binário para telômeros e corpos pml ou SUMô, respectivamente. Mesclar camadas binárias GFP e Cy5 e criar uma nova camada contendo partículas que tenham sinal GFP e Cy5 para representar a co-localização do corpo PML nos telômeros, assim APBs.
  2. Calcular o número e intensidade do APB/SUM
    Subtraia o fundo de imagem após 7.2. Link apb/sumo camada binária para canal Cy5 após 7.3. Calcular o número e a intensidade DO APB/SUM. Dados de exportação e parcela após 7.4.

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Resultados

Imagens representativas da localização telômica do SUMM identificado pelo DNA de telômero FISH e pela proteína SUME são mostradas na Figura 2. Células com recrutamento de SIM enriqueceram o SUMO1 e o SUMÔ 2/3 nos telômeros em comparação com células com recrutamento mutante SIM. Isso indica que o enriquecimento de SUM induzido por dimerização do SIM nos telômeros depende das interações SUMO-SIM.

Um filme de lapso de tempo representativo do TRF1 e DO SIM após a dime...

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Discussão

Este protocolo demonstrou a formação e dissolução de condensados em telômeros com um sistema de dimerização química. Cinéticas de separação de fase e agrupamento de telômeros induzidos por gotículas são monitorados com imagens ao vivo. A localização e a composição do condensado são determinadas com DNA FISH e proteína IF.

Há dois passos críticos neste protocolo. A primeira é determinar a concentração de proteínas e dimerizer. O sucesso em induzir a separação de fase local em um lócus genômico ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e fundação Charles E. Kaufman para h.Z. Os autores gostariam de agradecer jason Tones por revisar o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina, 0,1% de EDTA em HBSS sem cálcio, magnésio e bicarbonato de sódioCorningMT25053CI
16% de formaldeído (p/v), sem metanolThermo Scientific28906Prepare 1% em 1x PBS
6 Placa de cultura de poçosVWR10861-554
Folha de alumínioFisher Scientific01-213-101
Anti-mCherry anticorpoAbcamAb183628
Anticorpo anti-PMLSanta Cruzsc966
Anticorpo anti-SUMO1AbcamAb32058
Anti-SUMO2/3 anticorpoCitoesqueletoAsm23
Reagente bloqueadorRoche11096176001
Albumina de soro bovino (BSA)Fisher ScientificBP9706100
Tubo BTX micro 1.5ML VWR89511-258
Lamelas de Cobertura CircularThermo Scientific3350
Microscópio confocal NikonMQS31000
DAPI FisherScientificD1306
Dimetil Sulfóxido Sigma-Aldrich472301
DMEM com L-Glutamina, 4.5g/L Glicose e Piruvato de SódioCorningMT10017CV
EMCCD CameraiXon Life 897
EtanolFisher Scientific4355221
Soro Fetal Bovino, Qualificado, Regiões Aprovadas pelo USDAGibcoA4766801
Formamida, Millipore DeionizadoSigma46-101-00ML
IgG anti-rato de cabra (H + L), Anticorpo secundário recombinante, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
IgG anti-coelho de cabra (H+L), anticorpo secundário recombinante, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
Fisher Scientific12-000-122
Módulo de fusão a laser NikonNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668027
Software de plotagem de figuras, MATLABThe MathWorks
Microscópio Slide BoxFisher Scientific34487
EsmalteFisher Scientific50-949-071
Software de imagem, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Mídia de Soro ReduzidaGibco51985091
ParafilmBemis13-374-12
PBS 10x, pH 7.4Fisher Scientific70-011-044
, 100XGibco15140122
Piezo Z-Drive Physik Instrumente (PI)91985
Pontas de pipetaVWR10017
Lâminas de microscópio de canto cortadas lisas e foscosFisher Scientific22-037-246
Sigma-AldrichA-003-E
Azida de sódioFisher ScientificBP922I-500
Disco giratórioYokogawaCSU-X1
Lamínulas QuadradasThermo Scientific3305
TBS 10x soluçãoFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPSintetizado pelo laboratórioDisponível mediante solicitação
TNHSintetizado pelo laboratórioDisponível mediante solicitação
Tris SolutionFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10% SoluçãoMilliporeSigma64-846-350MLPrepare 0,5% em 1x linha celular PBS
U2OsDo laboratório E.V. Makayev (Universidade Tecnológica de Nanyang, Cingapura)HTB-96
VECTASHIELD Antifade Montagem MediumVector LaboratoriesNC9524612
Pinça/fórceps de ponta ultrafina reta reta de alta precisão Solução de Penicilina-Estreptomicina Solução de poli-D-lisina Chenoweth Chenoweth

Referências

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