Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.
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Artigo de método
Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
O processamento de mRNA envolve múltiplas etapas simultâneas para preparar o mRNA para tradução, como 5'capping, adição poli-A e emenda. Além do emendamento constitutivo, o emendamento alternativo de mRNA permite a expressão de proteínas multifuncionais de um gene. Como os estudos interactome são geralmente a primeira análise para proteínas novas ou desconhecidas, a associação da proteína isca com fatores de emenda é uma indicação de que ela pode participar do processo de emenda mRNA, mas determinar em que contexto ou quais genes são regulados é um processo empírico. Um bom ponto de partida para avaliar esta função é usar a ferramenta minigene clássica. Aqui apresentamos o uso de minigene Adenoviral E1A para avaliar as mudanças alternativas de emenda após diferentes estímulos de estresse celular. Avaliamos o splicing de minigene E1A em HEK293 exprimidamente superexpressando proteína Nek4 após diferentes tratamentos de estresse. O protocolo inclui transfecção de minigene E1A, tratamento celular, extração de RNA e síntese de CDNA, seguido de análise de PCR e gel e quantificação das variantes emendadas E1A. O uso deste método simples e bem estabelecido combinado com tratamentos específicos é um ponto de partida confiável para lançar luz sobre processos celulares ou quais genes podem ser regulados por emendas mRNA.
Introdução
O splicing está entre os passos mais importantes no processamento de mRNA eucariótico que ocorre simultaneamente ao capping de 5'mRNA e à poliadenilação de 3'mRNA, compreendendo a remoção de intron seguido de junção exon. O reconhecimento dos locais de emenda (SS) pelo emendatório, um complexo ribonucleoproteíno contendo pequenas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 e U6), pequenas RNAs (snRNAs) e várias proteínas regulatórias1 é necessário para emendas.
Além da remoção intron (emendas constitutivas), em eucariotes, os introns podem ser retidos e os exons podem ser excluídos, configurando o processo chamado emenda a....
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Protocolo
1. Células de chapeamento
NOTA: Neste protocolo descrito, foram utilizadas linhas de células estáveis HEK293, anteriormente geradas para expressão indutível estável de Nek421, porém, o mesmo protocolo é adequado para muitas outras linhas celulares, tais como HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. O padrão de expressão dos isoformes minigene E1A em condições basais varia entre essas....
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Resultados
Um ensaio de 5' locais de emenda utilizando minigene E1A foi realizado para avaliar mudanças no perfil de emenda nas células após a exposição da quimioterapia. O papel de Nek4 - isoform 1 na regulação AS em células estáveis HEK293 após o tratamento paclitaxel ou cisplatina foi avaliado.
A região Adenoviral E1A é responsável pela produção de três mRNAs principais de um precursor de RNA devido ao uso de diferentes doadores de emen.......
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Discussão
Minigenes são ferramentas importantes para determinar os efeitos no splicing alternativo global in vivo. O minigene adenoviral E1A tem sido usado com sucesso há décadas para avaliar o papel das proteínas, aumentando a quantidade delas na célula13,14. Aqui, propomos o uso de minigene E1A para avaliar emendas alternativas após exposição quimioterápica. Uma linha de célula estável expressando isoforme Nek4 1 foi usada, evitando os artefatos de superexpressão causado.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por meio do Grant Temático 2017/03489-1 ao JK e à bolsa da FLB 2018/05350-3) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) para financiar essa pesquisa. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Adrian Krainer por fornecer o plasmídeo pMTE1A e Zerler e colegas por seu trabalho na clonagem E1A. Agradecemos também ao Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti e Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller para permitir que usem seu espaço de laboratório e equipamentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 placa de poços | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatina | Sigma | P4394 | |
| DEPC água | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| mistura dNTP | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Soro Fetal Bovino - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Microscópio Fluorescente | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Sistema de aquisição de imagem em gel - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 - HEK293 Flp-In | Gerado a partir do Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen e descrito na ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Usado para manutenção de células Flp-In |
| Software de processamento e análise de imagem - software | ref. 32 | ||
| Reagente de transfecção à base de lipídios - jetOPTIMUS Polyplus Reagente | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Leitor de Placas Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| / Absorvância UV | Biotech | Epoch Biotek/ Adaptador Take3 | |
| plasmid | Fornecido pelo Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3' | |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | F5810R | |
| Transcriptase reversa - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Transcriptase reversa - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Inibidor de ribunuclease RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| Reagente à base de fenol-clorofórmio de extração de RNA - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Usado para Flag empty ou Nek4- Indução de expressão de bandeira |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Tripsina | Sigma | T4799 |
Referências
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....
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Reimpressões e permissões
