Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ^{ácido acético de 14}C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Resumo

Lipídios neutros (NLs) são uma classe de biomoléculas hidrofóbicas e sem carga que desempenham papéis-chave na energia e homeostase lipídica. Os NLs são sintetizados de novo a partir de acetil-CoA e estão principalmente presentes em eucariotes na forma de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs). As enzimas responsáveis pela síntese de NLs são altamente conservadas de Saccharomyces cerevisiae (levedura) para humanos, tornando a levedura um organismo modelo útil para dissecar a função e regulação das enzimas do metabolismo NL. Embora se saiba muito sobre como o acetil-CoA é convertido em um conjunto diversificado de espécies NL, mecanismos para regular enzimas do metabolismo NL, e como a regulação errada pode contribuir para patologias celulares, ainda estão sendo descobertos. Inúmeros métodos de isolamento e caracterização de espécies de NL foram desenvolvidos e utilizados ao longo de décadas de pesquisa; no entanto, um protocolo quantitativo e simples para a caracterização abrangente das principais espécies de NL não foi discutido. Aqui, é apresentado um método simples e adaptável para quantificar a síntese de nova das principais espécies de LN na levedura. Aplicamos ¹⁴rotulagem metabólica de ácido acético C juntamente com cromatografia de camada fina para separar e quantificar uma gama diversificada de NLs fisiologicamente importantes. Além disso, este método pode ser facilmente aplicado para estudar taxas de reação in vivo de enzimas NL ou degradação de espécies NL ao longo do tempo.

Introdução

Acetil-CoA é o bloco fundamental de construção de diversas biomoléculas, incluindo lipídios neutros (NLs), que servem como uma moeda biomolecular versátil para a construção de membranas, geração de ATP e regulação da sinalização celular^1,2. A disponibilidade de NLs a serem desviados para qualquer uma dessas respectivas vias é, em parte, regulada pelo seu armazenamento. Gotículas lipídicas (LDs), organelas citoplasmáticas compostas de núcleos hidrofóbicos de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs), são os principais compartimentos de armazenamento da maioria dos NLs celulares. Sendo assim, os LDs sequeram e....

Protocolo

1. Crescimento e rotulagem de células de levedura com ^{ácido acético de 14}C

1. Inocular uma cultura de levedura, escolhendo uma colônia de um prato e distribuindo-a em 20 mL de mídia sintética completa (SC) contendo 2% de dextrose (ver Arquivo Suplementar para a receita de mídia SC). Incubar a 30 °C durante a noite com agitação a 200 rpm.
   NOTA: Condição de crescimento, volume amostral e tratamento diferem com base nos lipídios de interesse. Antes de realizar experimentos completos, as condições de crescimento ideais e os volumes de cultura devem ser empiricamente determinados. Este protocolo discute a rotulagem radiolabel de cultur....

Resultados

Neste protocolo, demonstramos que a rotulagem, detecção e quantificação de espécies NL podem ser realizadas por rotulagem metabólica ^{de ácido acético C de 14}C. As principais espécies de NL podem ser separadas em um sistema solvente de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter de diethyl:Ácido acético (Figura 1A, B). A imagem do fósforo permite a visualização de ácido graxo livre rotulado (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), colesterol (Chol) .......

Discussão

Aqui, é apresentado um versátil protocolo de radiolabeling para monitorar quantitativamente a síntese de espécies de NL na levedura. Este protocolo é muito modular, o que permite que o procedimento seja concluído dentro de 3-6 dias. Além disso, existe uma riqueza de literatura sobre o uso de TLC para separar espécies lipídicas e metabólitos, o que deve permitir ao usuário detectar várias espécies lipídicas de interesse com uma simples mudança dos sistemas de solventes TLC^16,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[1-C14] Atividade específica do sal de sódio do ácido acético: 45-60mCi	PerkinElmer	NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoíla-sn-glicerol	Avanti	800811O
200 prova de etanol absoluto	Sigma	459836
Contas de vidro lavadas com ácido 425-600um	Sigma	G8772
Lâmpadas âmbar para pipetas Pastuer	Fisher	03-448-24
Sulfato de amônio >99%	Sigma	A4418
Beckman LS6500 contador de cintilação	PerkinElmer	A481000
Clorofórmio (grau HPLC)	Colesterol Fisher	C607SK
>99%	Sigma	C8667
Colesteril-linoleato >98%	Sigma	C0289
Ácido sulfúrico concentrado	Sigma	339741
Corning 50mL tubos cônicos, polipropileno com tampa centristar	Sigma	CLS430829
Dextrose, grau anidro	Sigma	D9434
Éter dietílico grau anidro	Sigma	296082
Forno de secagem	Fisher	11-475-155
EcoLume líquido de cintilação	Centrífuga VWR	IC88247001
Eppendorf 5424R	Fisher	05-401-205
GE Tela de fósforo de armazenamento	Sigma	GE28-9564-75
Gerador de imagens
Ácido acético glacial, grau ACS	Sigma	695092
Frascos de cintilação de vidro de 6mL	Sigma	M1901
Tampas de tubo de centrífuga de vidro	Fisher	14-595-36A
Tubos de centrífuga de vidro	Fisher	14-595-35A
Pipeta de vidro Pasteur	Fisher	13-678-20C
Hexano, grau anidro	Sigma	296090
L-Adenina >99%	Sigma	A8626
L-Alanina >98%	Sigma	A7627
L-arginina >99%	Sigma	A1270000
L-asparagina >98%	Sigma	A0884
L-aspartato >98%	Sigma	A9256
L-cisteína >97%	Sigma	W326305
sal monossódico de ácido L-glutâmico monohidratado >98%	Sigma	49621
L-glutamina >99%	Sigma	G3126
L-Glicina >99%	Sigma	G8898
L-Histidina >99%	Sigma	H8000
L-Isoleucina >98%	Sigma	I2752
L-Leucina >98%	Sigma	L8000
L-Lisina >98%	Sigma	L5501
L-Metionina, HPLC grau	Sigma	M9625
L-fenilalanina, grau reagente	Sigma	P2126
L-Prolina >99%	Sigma	P0380
L-serina >99%	Sigma	S4500
L-Ateronina, grau reagente	Sigma	T8625
L-triptofano >98%	Sigma	T0254
L-tirosina >98%	Sigma	T3754
L-Uracil >99%	Sigma	U0750
L-valina >98%	Sigma	V0500
Metanol, grau ACS	Fisher	A412
Ácido oleico >99%	Sigma	O1008
p-anisaldeído	Sigma	A88107
Éter de petróleo, grau ACS	Sigma	184519
Fosfatidilcolina, dipalmitoyl >99%	Sigma	P1652
Pipetas	Eppendorf	2231000713
Cloreto de potássio, grau ACS Sigma		P3911
Pellets de hidróxido de sódio, certificado ACS	Fisher	S318-100
Esqualeno >98%	Sigma	S3626
Ácido succínico cristalino/certificado	Fisher	110-15-6
TLC almofada de saturação	Sigma	Z265225
TLC sílica gel 60G placa canalizada	de vidro Fisher	NC9825743	Sem indicadores fluorescentes
Filme plástico	transparente Apollo	829903
Tricine	Sigma	T0377
Trioleína >99%	Sigma	T7140
Misturador de vórtice	Fisher	02-215-414
de exposição Whatman	Sigma	WHA29175523
Base de nitrogênio de levedura sem sulfato de amônio e aminoácidos	Sigma	Y1251

de FLA9500 GE Typhoon