Produção de nanodroplets de decafluorobutano filtrados por membrana a partir de microbolhas pré-formadas

Resumo

Este protocolo descreve um método de geração de grandes volumes de microbolhas de decafluorobutano encapsuladas lipídicas usando sônica de ponta de sonda e, posteriormente, condensando-as em nanodroplets de mudança de fase usando extrusão de alta pressão e filtração mecânica.

Resumo

Existem muitos métodos que podem ser usados para a produção de gotículas vaporizáveis de mudança de fase para imagem e terapia. Cada método utiliza técnicas diferentes e varia em preço, materiais e propósito. Muitos desses métodos de fabricação resultam em populações polidispersas com limiares de ativação não uniformes. Além disso, controlar os tamanhos das gotículas normalmente requer líquidos perfluorocarbonos estáveis com altos limiares de ativação que não são práticos in vivo. Produzir tamanhos uniformes de gotículas usando gases de ponto de baixa ebulição seria benéfico para experimentos de imagem e terapia in vivo. Este artigo descreve um método simples e econômico para a formação de nanodroplets de mudança de fase estabilizadas lipídicas com decafluorobutano de ponto de baixa ebulição (DFB). Descreve-se um método comum de geração de microbolhas lipídicas, além de um novo método de condensação deles com extrusão de alta pressão em um único passo. Este método foi projetado para economizar tempo, maximizar a eficiência e gerar maiores volumes de soluções de microbolhas e nanodroplet para uma grande variedade de aplicações usando equipamentos de laboratório comuns encontrados em muitos laboratórios biológicos.

Introdução

Os agentes de contraste de ultrassom (UCAs) estão crescendo rapidamente em popularidade para aplicações de imagem e terapia. Os microbolhas, os UCAs originais, são atualmente os principais agentes utilizados em aplicações de diagnóstico clínico. Microbolhas são esferas cheias de gás, tipicamente de 1-10 μm de diâmetro, cercadas por conchas lipídicas, proteicas ou polímeras1. No entanto, seu tamanho e estabilidade in vivo podem limitar sua funcionalidade em muitos aplicativos. Nanodroplets de mudança de fase, que contêm um núcleo líquido superaquecido, podem superar algumas dessas limitações devido ao seu tamanho menor e à melhoria da vida útil ....

Protocolo

1. Fazer filmes lipídes

1. Prepare filmes lipídeis para a geração de microbolhas usando 90% DSPC e 10% DSPE-PEG2K misturando os lipídios na razão correta usando as seguintes instruções:
   1. Faça lipídios de estoque de DSPC e DSPE-PEG2K em clorofórmio. Pesar 50 mg de cada pó lipídico em frascos separados. Adicione 1 mL de clorofórmio a cada frasco usando uma seringa de vidro de 1 mL.
   2. Adicione 287 μL de estoque DSPC e 113 μL de estoque DSPE-PEG2K (ambos 50 mg/mL) em um frasco de cintilação de 20 mL usando uma seringa de vidro.
   3. Seque os lipídios mistos para remover o clorofórmio usando nitrogênio. Usando um comprimento apropriado de tubul....

Resultados

Os resultados representativos da distribuição de tamanho estão incluídos utilizando a dispersão dinâmica de luz (DLS) e a análise de sensor de pulso resistivo (TRSP). A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho das soluções de bolha condensada com e sem extrusão. Sem extrusão, o protocolo termina na etapa 5.3. As bolhas geladas são condensadas ventilando a amostra à pressão atmosférica enquanto frias. A amostra condensada só tem uma distribuição muito mais ampla centrada perto de 400 nm. A a.......

Discussão

Está disponível um corpo abrangente de literatura que discute a formulação, física e aplicações potenciais de microbolhas e gotículas de mudança de fase para imagem e terapia in vivo. Esta discussão diz respeito explicitamente à geração de microbolhas lipídicas e à conversão em gotículas de mudança de fase sub-micron usando um baixo ponto de ebulição de gás DFB e extrusão de alta pressão. O método aqui descrito destina-se a fornecer um método relativamente simples de produzir grandes quantidades de microbolhas lipídicas .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrífuga de 15 mL	Falcon	352095	Coletando e centrifugando gotículas
Filtro de policarbonato de 200 nm	Whatman	110606	Filtros extrusores
2-metilbutano	Fisher Chemical	03551-4 Pré-resfriamento	rápido da solução de microbolhas antes da extrusão
Grampos de 3 pinos X2	Fisher	02-217-002	Segurando os frascos de cintilação no lugar para sonicação de ponta de sonda
400W Ponta de Sonda Analógica Sonicator com Chifre	Branson	101-063-198R	Usado para gerar microbolhas lipídicas a partir de solução lipídica
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Usado para ajudar a quebrar lipossomas em vesículas unilamelares
Clorofórmio	Fisher Bioreagents	C298-4	Usado para fazer filme lipídico para preparação de
microbolhasGás Decafluorobutano (Perfluorobutano)	FluoroMed LP	1 kg	gerando microbolhas via sonicação da ponta da sonda
Gelo seco	-		Pré-resfriamento rápido da solução de microbolhas antes da extrusão
DSPC Lipídio em pó	NOF America	COATSOME MC-8080	Componente do filme lipídico
DSPE-PEG-2K Lipídio em pó	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Componente do filme lipídico
Termômetro geral	-	-	Usado para medir a temperatura do banho de gelo e a temperatura do 2-metilbutano (precisa acomodar temperaturas de -20C)
Seringas de vidro	Hamilton	81139	Usado para misturar lipídios em clorofórmio
Glicerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduz a temperatura de congelamento da solução PBS
Bloco de aquecimento	VWR Scientific Products		Aquecimento de filmes lipídicos e gotículas de vaporização
Lipex 10 Extrusora mL	Evonik		Sistema de extrusão comercial de alta pressão
Mini Misturador de Vórtice	Marca Fisher	14-955-151	Usado para remover o excesso de clorofórmio de filmes lipídicos
Tanque de nitrogênio		-	Usado para operar extrusora
Tampão fosfato Salino	Fisher Scientific		Hidratar filmes lipídicos e gotículas de lavagem
Disco	de drenagem de poliésterWhatman	230600	Fornece suporte para filtro de policarbonato
Tampas de polipropileno	Fisher Scientific	298417	Usado para armazenamento de solução
Propilenoglicol	Fisher Chemical	P355-1	Reduz a temperatura de congelamento da solução PBS
Frascos de cintilação	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Usado para filmes lipídicos e geração de microbolhas
Pequeno martelo	-		Usado para quebrar o gelo seco para resfriar o metilbutano
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Usado para gerar microbolhas a partir de solução lipídica
Recipiente de aço	Medegen	79310	Pré-resfriamento rápido da solução de microbolhas antes da extrusão (qualquer recipiente classificado para -20C funcionará)
Dessecador de vácuo	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Remove o excesso de clorofórmio dos filmes lipídicos
Tubo de centrífuga de 2mL	Fisher	02682004	Usado para concentrar nanogotículas

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