Method Article

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

DOI:

10.3791/62207

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As fatias vivas de tecido pancreático permitem o estudo da fisiologia da ilhota e funcionam no contexto de um microambiente de ilhotas intactos. As fatias são preparadas a partir de tecido pancreático humano vivo e rato embutido em agarose e cortado usando um vibratome. Este método permite que o tecido mantenha viabilidade e função, além de preservar patologias subjacentes como diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D). O método de fatia permite novas direções no estudo do pâncreas através da manutenção das estruturas complexas e de diversas interações intercelulares que compõem os tecidos endócrinos e exócrinos do pâncreas. Este protocolo demonstra como realizar a coloração e microscopia de lapso de tempo de células imunes endógenas vivas dentro de fatias pancreáticas, juntamente com avaliações da fisiologia da ilhota. Além disso, essa abordagem pode ser refinada para discernir populações de células imunes específicas para antígenos de células ilhotas usando grandes reagentes complexos-multimers de histocompatibilidade.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O envolvimento do pâncreas é pathognomônico a doenças como pancreatite, T1D e T2D1,2,3. O estudo da função em ilhotas isoladas geralmente envolve a remoção das ilhotas de seu ambiente circundante4. O método de fatia de tecido pancreático vivo foi desenvolvido para permitir o estudo do tecido pancreático, mantendo microambientes intactos de ilhotas e evitando o uso de procedimentos estressantes de isolamento de ilhotas5,6,7. Fatias de tecido pancreático do tecido doador humano têm sido usadas com sucesso para estudar T1D e demonstraram processos de perda e disfunção de células beta, além da infiltração de células imunes8,9,10,11,12,13. O método de fatia de tecido pancreático vivo pode ser aplicado tanto no tecido pancreático humano5,6,8. As fatias de tecido pancreático humano de tecidos doadores de órgãos são obtidas através de uma colaboração com a Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD). As fatias do mouse podem ser geradas a partir de uma variedade de cepas diferentes de mouse.

Este protocolo se concentrará na recombinação diabética não obesa ativando gene-1-nulo (NOD). Rag1-/-) e receptor de células T transgênicos (AI4) (NOD. Rag1-/-. Cepas de camundongos AI4 α/β). ACENO. Os camundongos são incapazes de desenvolver células T e B devido a uma interrupção no gene ativador de recombinação 1 (Rag1)14. ACENO. Rag1-/-. Camundongos aI4 α/β são usados como modelo para diabetes tipo 1 acelerado porque produzem um único clone de células T que tem como alvo um epítope de insulina, resultando em infiltração consistente de ilhotas e desenvolvimento rápido de doenças15. O protocolo aqui apresentado descreve procedimentos para estudos funcionais e imunológicos utilizando fatias pancreáticas humanas e de camundongos vivas através da aplicação de abordagens de microscopia confocal. As técnicas aqui descritas incluem avaliações de viabilidade, identificação e localização de ilhotas, registros citosóicos do Ca2+, bem como coloração e identificação de populações de células imunes.

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Protocol

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NOTAs: Todos os protocolos experimentais que utilizam camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida (201808642). Seções pancreáticas humanas de doadores de tecidos de ambos os sexos foram obtidas através da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD), universidade da Flórida. A pancreata humana foi colhida de doadores cadavéricos de órgãos por organizações certificadas de aquisição de órgãos em parceria com a nPOD de acordo com as leis e regulamentos de doação de órgãos e classificada como "Sujeitos Não Humanos" pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Flórida (IRB) (IRB nº 392-2008), dispensando a necessidade de consentimento. os tecidos nPOD especificamente utilizados para este projeto foram aprovados como não humanos pela Universidade da Flórida IRB (IRB20140093). Os objetivos das seções 1-3 deste protocolo são explicar como dissecar com sucesso um rato, preparar e processar o pâncreas, e gerar fatias vivas de tecido pancreático. As soluções devem ser preparadas com antecedência, e as receitas podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. O tempo é o fator mais crítico durante essas etapas de protocolo. Uma vez que o rato tenha sido sacrificado, a viabilidade do tecido começará a diminuir. Todas as três partes deste protocolo precisam ser concluídas o mais rápido possível até que todas as fatias necessárias sejam geradas.

1. Preparação para geração de fatias de pâncreas de rato

  1. Aperte a lâmina no suporte da lâmina vibratome, mas não a anexe ao vibratome ainda.
  2. Derreta 100 mL de 1,25% w/v baixo ponto de fusão em um micro-ondas. Opere o micro-ondas em intervalos de 1 min e pare o micro-ondas por 10 s se a solução agarose começar a ferver. Repita este processo até que a ágarose seja derretida, e uma solução homogênea seja produzida. Coloque a garrafa em um banho de água de 37 °C.
    NOTA: A baixa concentração de agarose deve ser responsável pela menor densidade do pâncreas do rato.
  3. Encha uma seringa de bloqueio Luer de 10 mL com 3 mL de agarose quente. Coloque uma agulha de 27 G 25 mm na seringa. Mantenha a seringa com a agulha tampada presa em um banho de água de 37 °C até que a solução seja injetada.
    NOTA: Uma agulha de 27 G é preferida, pois se encaixa firmemente no ducto biliar comum de camundongos entre 10-25 g em peso corporal e permite o fluxo da solução agarose altamente viscosa. Embora agulhas de furo maiores possam ser selecionadas para uso, agulhas menores (bitola maior) não são recomendadas, pois estas podem ser mais facilmente entupidas com a solução agarose.
  4. Adicione 20 mL de solução extracelular resfriada (ECS) a uma placa de Petri de 10 cm.
    NOTA: O ECS não precisa ser borbulhado em nenhum momento.
  5. Encha duas placas de Petri não tratadas de 10 cm com 15 mL de tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) contendo 3 mM D-glicose e inibidor de trippsina de soja a uma concentração de 0,1 mg/mL por prato.
    NOTA: Ao longo deste protocolo, é essencial que todas as soluções utilizadas para a manutenção de fatias contenham inibidor de trippsina de soja para evitar danos teciduais causados por proteases digestivas pancreáticas.

2. Excisão do pâncreas do rato e processamento de tecidos

NOTA: O protocolo para excisar o pâncreas, processar o tecido e gerar fatias é modificado a partir de Marciniak et al5. Para garantir a viabilidade tecidual, minimize a quantidade de tempo entre a remoção do pâncreas e a geração de fatias. Todos os equipamentos necessários devem ser preparados com antecedência e orientados de forma a permitir uma rápida progressão através das etapas abaixo. A canulação e injeção do ducto biliar, bem como a excisão do pâncreas são melhor realizadas sob um estereoscópio.

  1. O rato é profundamente anestesiado com isoflurano e sacrificado por luxação cervical.
    NOTA: Isoflurane é o método preferido de anestesia. Uma concentração de 5% de isoflurane deve ser usada. Por exemplo, 0,26 mL deve ser usado com uma câmara de 1 L16. Observou-se diminuição da viabilidade do tecido pancreático quando o CO2 foi utilizado.
  2. Pulverize o mouse com 70% de v/v de etanol liberalmente para reduzir a contaminação tecidual com pele durante a dissecção e excisão. Coloque o mouse em uma dor dorsal para baixo, ventral para cima orientação com o lado anterior para a esquerda.
  3. Usando uma tesoura, abra o peritônio e remova a caixa torácica, tomando cuidado para não perfurar o coração ou vasos adjacentes. Use fórceps para virar o fígado para a cavidade torácica, e para mover os intestinos para fora da cavidade corporal para expor o ducto biliar comum. Use um grampo de buldogue Johns Hopkins para ocluir a ampola de Vater.
  4. Recupere uma seringa luer de 10 mL pré-carregada com 3 mL de solução de agarose quente a partir do banho de água de 37 °C.
    NOTA: Uma vez que a seringa com a agarose seja removida do banho de água, a injeção de pâncreas precisa ser realizada rapidamente antes que a agarose esfrie e se instale na seringa.
  5. Segurando os fórceps na mão esquerda, use-os para apoiar suavemente e estabilizar o ducto biliar para a injeção.
  6. Segure a seringa na mão direita, insira a agulha lado do bisbiário no ducto biliar. Injete lentamente e firmemente o pâncreas. Uma vez iniciada a injeção, o fluxo não pode ser interrompido sem o endurecimento da agarose na seringa e no pâncreas.
    NOTA: O volume utilizado dependerá do peso do mouse. Com base na experiência, recomenda-se que 1 mL de solução agarose seja usado por 10 g de peso corporal do mouse com um volume máximo de 2 mL. O pâncreas deve parecer ligeiramente inflado com uma estrutura mais definitiva, mas não sobrecarregado. A sobreinjeção resulta em ilhotas que se separam do tecido exócrino e que têm uma aparência "soprada" nas fatias.
  7. Extirula o pâncreas cheio de agarose do rato. Usando fórceps e tesouras, corte o pâncreas, começando pelo estômago, movendo-se para o intestino, e terminando no baço. Uma vez cortado, retire suavemente o pâncreas injetado com fórceps, e coloque em uma placa de Petri de 10 cm cheia de ECS refrigerado.
  8. Use uma tesoura para remover o adiposo, tecido conjuntivo, tecido fibroso e partes do pâncreas que não são injetadas com agarose.
    NOTA: Partes do tecido que devem ser removidas não terão estruturas fortemente estabelecidas e aparecerão um pouco gelatinosas.
  9. Depois de aparar o tecido, use a tesoura para cortá-lo em seções menores de aproximadamente 5 mm de diâmetro, deixando-o submerso sob eCS. Corte o tecido cuidadosamente, tomando cuidado para não empurrar a agarose para fora do tecido.
  10. Retire os pedaços de tecido do ECS e coloque-os em um limpador de dois ply (veja a tabela de materiais). Role-os suavemente no limpador usando fórceps para remover o excesso de líquido.
  11. Usando fórceps, coloque cuidadosamente os pedaços de tecido em uma placa de Petri de 35 mm com no máximo 4 peças por placa. Coloque o lado mais plano do bloco de tecido voltado para baixo. Pressione suavemente o tecido usando fórceps.
    NOTA: Certifique-se de que há espaço, pelo menos alguns milímetros, entre os pedaços de tecido, e que eles não estão tocando a borda da placa.
  12. Despeje lentamente os 37 °C de agarose no prato, tomando cuidado para não despejá-lo diretamente sobre o tecido. Despeje o suficiente para que os pedaços de tecido estejam completamente cobertos. Certifique-se de que há uma camada de agarose acima dos pedaços de tecido, pois esta parte será colada ao suporte da amostra.
  13. Transfira cuidadosamente o prato com os pedaços de tecido para uma geladeira para permitir que a agarose coloque. Certifique-se de que as peças de tecido não se deslocam ou comecem a flutuar. Se o fizerem, reajuste-os rapidamente usando fórceps.
    NOTA: A configuração da agarose deve levar apenas alguns minutos.
  14. Uma vez que a agarose tenha definido, use um bisturi para cortar ao redor do tecido em linhas retas para fazer blocos de agarose como se estivesse fazendo uma grade entre os pedaços de tecido. Certifique-se de deixar alguns milímetros de agarose em torno de todos os lados do tecido.
    NOTA: Não deve haver nenhum tecido saliente da agarose. Cada bloco deve ser um cubo de aproximadamente 5 mm x 5 mm x 5 mm de volume.
  15. Use o bisturi para lançar as seções vazias de agarose que foram cortadas ao redor das bordas da placa. Remova os blocos com o tecido do prato levantando-os cuidadosamente com fórceps.

3. Geração de fatias pancreáticas do rato

  1. Usando fórceps, organize os blocos no porta-espécime; colocá-los de lado, tendo em mente que eles serão virados para a super cola. Disponha os blocos para que não se estendam mais longe da largura da lâmina. À medida que o vibratome se move lentamente, organize os blocos para que a lâmina tenha que avançar a distância menos possível.
    NOTA: Duas linhas de três ou quatro blocos cada uma com alguns milímetros entre as linhas funciona bem. Os blocos dentro da mesma linha podem tocar uns aos outros, mas quando ambas as linhas se tocam, pode ser difícil recuperar fatias quando saem dos blocos.
  2. Aplique uma linha de super cola no suporte do espécime e use a extremidade do distribuidor de cola para espalhar a cola em uma camada fina. Vire os blocos de tecido sobre a cola para que o lado mais próximo do tecido fique virado para cima. Empurre suavemente para baixo nos blocos e deixe a cola secar por três minutos.
  3. Fixar o suporte da lâmina e a placa ao vibratome, normalmente com um parafuso ou ímã, dependendo do modelo vibratome. Ajuste a altura da lâmina e a distância percorrida para que a lâmina se mova sobre o comprimento dos blocos e apenas pouco acima deles.
    NOTA: Os fórceps podem ser úteis ao ajustar a altura da lâmina. Eles podem ser colocados em cima do bloco de tecido para ajudar a colocar a lâmina o mais perto possível do topo do bloco sem tocar no bloco.
  4. Certifique-se de que a cola secou gentilmente cutucando os blocos com fórceps e encha a bandeja de vibratome com ECS refrigerado até que a lâmina esteja coberta. Ajuste o vibratome para fazer fatias de espessura de 120 μm a uma velocidade de 0,175 mm/s, uma frequência de 70 Hz e uma amplitude de 1 mm.
    NOTA: A velocidade do vibratome pode ser ajustada dependendo da facilidade de corte do tecido.
  5. Inicie o vibratome, e observe quando as fatias começarem a sair dos blocos de tecido. Use fórceps Graefe de 10 cm ou um pequeno pincel nº 4 para remover cuidadosamente as fatias uma vez que flutuam fora do bloco, e coloque-as em placas de 10 cm com KRBH contendo 3 mM D-glicose e inibidor de trypsina. Pegue as fatias colocando um pincel ou fórceps abaixo delas e levantando suavemente as fatias. Não incubar mais de 15 fatias juntas em uma única placa.
    NOTA: É normal que o vibratome tenha algumas passagens sobre os blocos onde não são feitas fatias, mas estas devem ser minimizadas por tempo. Tenha a tesoura pronta caso as fatias não separem totalmente dos blocos de tecido. Se isso acontecer, um canto ou borda da fatia ficará preso ao bloco após a passagem da lâmina vibratome. Não retire a fatia ou bloqueie ao remover a fatia presa.
  6. Coloque as placas com as fatias em um roqueiro em temperatura ambiente e a 25 rpm. Deixe as fatias descansarem em temperatura ambiente por uma hora. Se eles forem deixados por mais tempo, coloque as fatias em 15 mL de meio de cultura de fatia (ver Tabela Suplementar 1) em uma incubadora. Incubar fatias preparadas para estudos no mesmo dia a 37 °C, e fatias de cultura que são cultivadas durante a noite a 24 °C, transferindo-as para 37 °C pelo menos 1 h antes dos experimentos.
    NOTA: A longo prazo, as fatias têm melhor viabilidade quando cultivadas a 24 °C, embora 37 °C esteja mais próxima de seu ambiente fisiológico nativo, provavelmente devido à menor atividade das enzimas de protease secretadas em temperatura mais baixa. As fatias de tecido pancreático do rato e humano são cultivadas na mesma temperatura e com um máximo de 15 fatias por prato. No entanto, as receitas de mídia diferem para fatias humanas e de rato. Ambas as formulações estão listadas na Tabela Suplementar 1. Além disso, o procedimento é o mesmo para gerar fatias de camundongos e humanos, com exceção do pâncreas do rato que requer injeção com agarose para estabilização. As fatias humanas são adquiridas através do programa nPOD Pancreas Slice. Ambas as fatias de rato e humano têm 120 μm de espessura. Uma variedade de experimentos pode ser realizada nas fatias; escolher painéis de coloração que funcionam melhor para experimentos planejados.

4. Preparação de fatias para procedimentos de coloração

  1. Cultura as fatias a 37 °C por pelo menos 1 h à frente dos experimentos planejados. KRBH quente contendo 3 mM D-glicose em um banho de água de 37 °C. Transfira 2 mL de KRBH contendo 3mM D-glicose em um prato de 35 mm e use um pincel para colocar suavemente a fatia no prato.
  2. Se a fatia estiver sendo transferida do meio, lave-a duas vezes com KRBH contendo 3 mM D-glicose. Aspire cuidadosamente o KRBH com 3 mM D-glicose usando uma pipeta de transferência ou pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar a fatia. Mantenha a fatia na placa com KRBH contendo 3 mM D-glicose enquanto os painéis de coloração estiverem preparados.

5. Mancha de dithizone

NOTA: Embora a dithizone possa ser usada para manchar as ilhotas vermelhas, ela matará a fatia, pois foi encontrada como citotóxica para ilhotas17.

  1. Meça 12,5 mg de dithizone, adicione-a a 1,25 mL de dimetilsulfoxida, e leve essa mistura em uma seringa de 50 mL. Encha a seringa a um volume de 25 mL usando a Solução de Sal Balanceado Hanks e conecte um filtro à extremidade da seringa. Aliquot 2 mL de KRBH com 3 mM D-glicose, e adicione 2 gotas da solução de dithizone filtrada a partir da seringa de 50 mL em um prato de 35 mm.
  2. Usando um pincel, coloque cuidadosamente uma fatia em uma placa de petri de 35 mm. Imagem da fatia com as ilhotas indicadas pela coloração de dithizone vermelho usando um estereoscópio.

6. Mancha de viabilidade

NOTA: Esta seção do protocolo descreve como avaliar a viabilidade da fatia usando calcein-AM e azul-fluorescente SYTOX Blue (veja a Tabela de Materiais). Calcein-AM deve ser usado em uma concentração de 4 μM e SYTOX Azul a 1 μM.

  1. Aliquot 2 mL de KRBH contendo 3 mM D-glicose, e adicione 2 μL de corante calcein-AM e SYTOX Blue para separar alíquotas. Vórtice as misturas para 5 s.
  2. Adicione 200 μL de KRBH contendo 3 mM D-glicose e corante calcein-AM a cada poço de um copo de cobertura de 8 poços.
    NOTA: Podem ser utilizadas placas alternativas e/ou câmaras de imagem que não sejam uma tampa de 8 poços.
  3. Com um pincel, coloque cuidadosamente uma fatia em cada poço da placa e transfira a placa com as fatias para uma incubadora de 37 °C por 20 minutos. Lave as fatias duas vezes com KRBH contendo 3 mM D-glicose. Aspire cuidadosamente o KRBH usando uma transferência ou pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar a fatia.
  4. Coloque a fatia em uma placa de Petri com fundo de vidro de 35 mm contendo 2 mL de KRBH com 3 mM D-glicose e 2 μL do Azul SYTOX a uma concentração de 1 μL por 1 mL de solução. Cubra a fatia com uma âncora de fatia, garantindo que o lado com a harpa se despoje para baixo. Tire imagens da fatia.
    NOTA: Se a âncora da fatia continuar flutuando, molhe-a em ambos os lados com KRBH contendo 3 mM D-glicose para submergir na solução. É fundamental manter sempre as fatias em soluções que contenham inibidor de protease, mesmo durante o carregamento de corante. As manchas de viabilidade utilizadas podem ser adaptadas para a configuração específica do experimento ou microscópio.

7. Coloração do indicador Ca2+ fatia

NOTA: Esta seção do protocolo descreve como manchar fatias para gravações ca2+ usando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e SYTOX Blue em fatias de mouse (ver a Tabela de Materiais). O Oregon Green 488 BAPTA-1, AM deve ser usado a uma concentração de 5,6 μM e o SYTOX Blue a 1 μM. Em fatias humanas, o Fluo-4-AM deve ser usado com uma concentração de 6,4 μM.

  1. Aliquot 2 mL de KRBH contendo 3 mM D-glicose, adicione 7 μL do Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e vórtice da mistura para 5 s.
    NOTA: Para fatias de tecido humano, use Fluo-4-AM em vez do Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. O Fluo-4-AM é preferível porque é mais brilhante quando a concentração intracelular de Ca2+ aumenta; no entanto, ele não carrega bem no tecido pancreático do rato. O protocolo é o mesmo descrito acima para o Fluo-4-AM, com exceção de que o Fluo-4-AM só precisa ser incubado por 30 minutos.
  2. Adicione 200 μL de KRBH contendo 3mM D-glicose e o corante a cada poço de um copo de cobertura de 8 poços. Usando um pincel, coloque cuidadosamente uma fatia em cada poço da tampa de câmara. Transfira o vidro de cobertura com as fatias para uma incubadora de 37 °C por 45 min.
  3. Lave as fatias duas vezes com KRBH contendo 3 mM D-glicose. Aspire cuidadosamente o KRBH com 3 mM D-glicose usando uma transferência ou pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar a fatia.
  4. Coloque uma fatia em uma placa de imagem ou câmara com KRBH contendo 3 mM D-glicose e SYTOX Azul a uma concentração de 1 μL por 1 mL, e cubra com uma âncora de fatia, garantindo que a harpa olhe para baixo. Tire imagens da fatia.
    NOTA: Neste protocolo, foi utilizado um prato de 35 mm recheado com 2 mL de KRBH contendo 3 mM D-glicose e 2 μL de SYTOX Blue. Se a âncora da fatia continuar flutuando, molhe-a em ambos os lados com KRBH contendo 3 mM D-glicose para submergir na solução.

8. Rato fatia gravações ca2+

NOTAs: A seção a seguir descreve como realizar gravações de Ca2+ em fatias de tecido pancreático do rato usando o Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e SYTOX Blue. A imagem foi realizada em um microscópio de varredura a laser confocal (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes). Os lasers utilizados foram de 405 nm para o SYTOX Blue, 488 nm para o Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e 638 nm para reflexão. Um detector de hyd foi usado para o Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Detectores de tubo fotomultiplier (PMT) foram utilizados para reflectância e o SYTOX Blue. O protocolo de imagem Ca2+ é o mesmo para fatias de tecido pancreático humano, exceto que fluo-4-AM foi usado como indicador. Os níveis de potência do laser, o ganho e o tamanho do orifício devem ser ajustados com base na amostra e na imagem da ilhota particular. Normalmente, um pinhole de 1,5 unidades arejados e uma potência laser de 1% são bons pontos de partida.

  1. Pelo menos 1h antes da gravação, ligue o microscópio e equilibre a incubadora no estilo palco ou cage para 37 °C. Coloque a placa petri de fundo de vidro de 35 mm contendo a fatia no palco depois de remover a tampa. Concentre-se definindo o microscópio para o modo objetivo e brightfield de 10x. Localize ilhotas usando campo brilhante procurando ovais marrom-laranja dentro da fatia.
  2. Uma vez localizada uma ilhota provável, mude o microscópio para o modo de imagem confocal. Para confirmar as ilhotas por reflexão, ligue o laser de 638 nm, defina a potência laser entre 1% e 2%, e desligue o filtro de entalhe de 638 nm que normalmente removeria a luz traseira. Defina os limites de detecção no detector PMT para uma largura de banda de aproximadamente 20 nm centrada em torno de 638 nm.
    NOTA: Tenha cuidado ao operar o microscópio no modo de reflectância pode danificar o detector. Devido à alta granularidade do tecido endócrino, a luz refletida agora pode ser usada para localizar ilhotas. As ilhotas aparecerão como grupos de células granulares brilhantemente recuando neste canal de reflexão.
  3. Para ver o SYTOX Blue, ligue o laser de 405 nm e o detector PMT, e defina a potência laser entre 1% e 2%. Centralize a ilhota de interesse no campo de visão usando os botões X e Y do controlador de palco. Uma vez que uma ilhota de interesse seja localizada e confirmada pelo backscatter, mude para o objetivo de 20x e amplie para que a ilhota assuma a maior parte do quadro.
  4. Pegue uma pilha z da ilhota com um tamanho de passo z de 1,5 μm. Encontre a melhor seção óptica da ilhota onde a maioria das células estão vivas (negativa para o Azul SYTOX) e bem carregada com o Oregon Green 488 BAPTA-1, AM ou Fluo-4-AM.
    NOTA: Não é incomum ver células que estão sobrecarregadas com uma grande quantidade de corante e que são muito brilhantes. Estas podem estar morrendo células pancreáticas nas quais o armazenamento ca2+ no ânticulo endoplasmático pode ser liberado, resultando em altos níveis de carregamento; estas não são células ideais para gravar. Procure por células que claramente carregaram o corante, mas não estão supersaturando o detector de modo que um aumento no brilho que ocorre quando os níveis citosóicos ca2+ flutuam é visível. O carregamento de corante de ilhotas dentro das fatias é variável; no entanto, o corante normalmente carrega bem através de ~10-15 μm da ilhota. No entanto, o carregamento de tingimento pode ser difícil de visualizar se as células estão profundas no tecido.
  5. Para evitar o desbotamento do corante durante a gravação, certifique-se de que a potência laser no canal de 488 nm não exceda 2%. Aumente o pinhole para 2 unidades arejadas para coletar mais sinal com menor potência de excitação.
  6. Defina o microscópio para gravar no modo XYZT. Otimize as configurações para reduzir a taxa de quadros para 2 s ou menos por quadro.
    NOTA: Os ajustes de configurações que podem ser feitos para ajudar a diminuir a taxa de quadros incluem ligar a varredura bidirecional, diminuir ou desligar a média da linha e aumentar a velocidade de varredura.
  7. Uma vez que as configurações tenham sido otimizadas, grave vários minutos de atividade basal.
    NOTA: Outro bom indicador de viabilidade tecidual é se as células parecem ativas e estão visivelmente piscando durante este registro de atividade basal.
  8. Adicione 100 μL de glicose concentrada de 20x e KCl em KRBH à placa usando uma micropipette de 200 μL nos pontos de tempo dado para alcançar uma concentração final de 16,7 mM de glicose ou 30 mM KCl.
    NOTAs: Adicione as soluções com cuidado, tomando cuidado para não perturbar a fatia durante a gravação. Certifique-se de não bater a placa com a micropipette. É típico ver o tecido contraír em resposta a essas estimulações. As gravações de fluxo Ca2+ foram processadas e quantificadas em ImageJ18. Usando o software ImageJ, a intensidade de coloração do Oregon Green 488 BAPTA-1, AM foi medida nas células selecionando manualmente regiões de interesse (ROIs). A intensidade de fluorescência desses ROIs foi calculada dividindo os valores de fluorescência em momentos posteriores pelos valores iniciais de fluorescência das células (F/F0). Um sistema de perfusão pode ser usado juntamente com uma câmara de imagem especializada para administrar as soluções para fatias dinamicamente, em vez de adicioná-las manualmente. Recomendações de sistema de perfusão e câmara de imagem podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

9. Coloração de células T do rato em fatias pancreáticas vivas

NOTA: Esta seção do protocolo descreve como manchar células imunes dentro de fatias de camundongos. A cepa do mouse usada é o NOD. Rag1-/-. AI4 α/β, pois este modelo desenvolve consistentemente a doença com insulite significativa. As células T CD8+ neste camundongo têm como alvo um epítope de insulina, permitindo o uso de uma ficoerthrina (PE) rotulada insulina-Db tetramer15. O anticorpo CD8 deve ser usado em uma concentração de 1:20 e o tetramer de insulina às 1:50.

  1. Aliquot 100 μL de KRBH contendo 3 mM D-glicose, adicione 2 μL de tetramer de insulina PE e 5 μL de anticorpo CD8 de alofilina (APC) e vórtice da mistura para 5 s.
  2. Adicione 100 μL de KRBH contendo 3 mM D-glicose e o tetramer e anticorpo a um poço de um copo de cobertura de 8 poços. Usando um pincel, coloque cuidadosamente uma fatia no poço da tampa de câmara. Transfira o vidro de cobertura com a fatia para uma incubadora de 37 °C por 30 min.
  3. Lave a fatia duas vezes com 2 mL KRBH contendo 3 mM D-glicose. Aspire cuidadosamente o KRBH com 3 mM D-glicose usando uma transferência ou pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar a fatia.
  4. Coloque a fatia em uma placa de Petri de fundo de vidro de 35 mm contendo KRBH com 3 mM D-glicose e o Azul SYTOX a uma concentração de 1 μL por 1 mL, e cubra com uma âncora de fatia, colocando o lado com a harpa voltada para baixo. Tire imagens da fatia.
    NOTA: Se a âncora da fatia continuar flutuando, molhe-a em ambos os lados com KRBH contendo 3 mM D-glicose para submergir na solução. O anticorpo diluído e o tetramer podem ser reutilizados uma vez. Depois de colorar duas fatias, deve ser feita uma mistura de anticorpos frescos.

10. Gravação de células imunes do camundongo

NOTA: A seção a seguir descreve como realizar gravações de células imunes em fatias de tecido pancreático do rato usando anticorpo CD8, tetramer de insulina PE e Azul SYTOX. A configuração de imagem está descrita na seção 8. As gravações foram feitas com 800 × resolução de 800 pixels. Os lasers utilizados foram de 405 nm para o SYTOX Blue, 488 nm para o tetramer de insulina, e 638 nm para anticorpo CD8 e reflectância. Detectores de húd hyd foram usados para anticorpos CD8 e tetramer de insulina PE. Detectores PMT foram utilizados para reflectância e o SYTOX Blue. O protocolo de imagem de células imunes é o mesmo para fatias de tecido pancreático humano, exceto pelo uso de diferentes anticorpos e hla-multimers complexos de antígeno para tecido humano. Tanto para a coloração do tetramer de insulina no tecido do camundongo quanto para a coloração HLA-multimer no tecido humano, uma co-mancha de células imunes deve ser usada para verificar a presença das células T específicas de antígeno-reativo. Aqui, um anticorpo anti-CD8 foi usado. Anticorpos, como anti-CD3 ou anti-CD4, também podem ser usados dependendo da população celular alvo.

  1. Pelo menos 1h antes de gravar, ligue o microscópio e equilibre a incubadora de topo de palco para 37 °C. Fixar a placa petri de fundo de vidro de 35 mm contendo a fatia no palco. Concentre o microscópio definindo o objetivo de 10x no modo brightfield. Localize as ilhotas usando o modo brightfield procurando ovais cor-de-laranja dentro da fatia.
  2. Mude o microscópio para imagens confocal, pressionando o botão CS no controlador de tela de toque do microscópio. Para ver as ilhotas por reflexão, ligue o detector 638 laser e PMT, defina a potência laser entre 1% e 2%, e desligue os filtros de entalhe.
    NOTA: Devido ao aumento da granularidade do tecido endócrino, a luz refletida agora pode ser usada para localizar ilhotas. As ilhotas aparecerão como grupos de células granulares brilhantes neste canal.
  3. Para ver o SYTOX Blue, anticorpo CD8 e tetramer de insulina, verifique se a potência do laser está entre 1% e 2%. Use as seguintes configurações para visualizar cada uma das três: para o Azul SYTOX, ligue o laser de 405 nm e o detector PMT; para o anticorpo CD8, ligue o detector de HyD; e para ver o tetramer de insulina, ligue o laser de 488 nm e o detector de HyD.
  4. Centralize a ilhota de interesse no campo de visão usando os botões X e Y do controlador de palco. Uma vez localizada uma ilhota de interesse, mude para o objetivo de 20x e amplie para que a ilhota assuma a maior parte do quadro. Pegue uma pilha z da ilhota com um tamanho de passo z de 1,5 μm. Encontre as melhores seções ópticas (uma série entre 5 a 10 seções) da ilhota onde a maioria das células estão vivas (negativa para o Azul SYTOX) e quaisquer células imunes circundantes estão em foco.
    NOTA: Tente encontrar quadros onde existem múltiplas células CD8-positivas e tetramer-positivas ao redor ou infiltrando-se na ilhota.
  5. Defina o microscópio para gravar no modo XYZT. Otimize as configurações para gravar uma pilha Z das etapas selecionadas a cada 20 minutos durante um período de várias horas.
    NOTA: Se possível, é melhor fazer essas gravações em uma câmara de imagem onde os níveis de temperatura e CO2 podem ser controlados, especialmente quando se registra por mais de quatro horas. No caso de gravação noturna, o excesso de anticorpos pode ser adicionado à mídia para compensar o ciclismo do receptor de células T e o desbotamento do tingimento. Além disso, diferentes fluoroforos podem ser usados para os anticorpos de células T. Com base na experiência, anticorpos na faixa vermelha funcionam melhor para células T.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo produzirá fatias de tecido pancreático ao vivo adequadas tanto para estudos de funcionalidade quanto para gravações de células imunes. A aparência de fatia em campo brilhante e sob luz refletida são mostradas na Figura 1A,B. Como discutido, as ilhotas podem ser encontradas em fatias usando luz refletida devido à sua granularidade aumentada que ocorre devido ao seu teor de insulina (Figura 1C) e são claramente observadas em compara...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste protocolo é explicar a geração de fatias de pâncreas e os procedimentos necessários para empregar as fatias em estudos funcionais e imunológicos. Há muitos benefícios em usar fatias pancreáticas vivas. No entanto, existem várias etapas críticas que são essenciais para que o tecido permaneça viável e útil durante os protocolos de experimento descritos. É imperativo trabalhar rapidamente. O tempo entre injetar o pâncreas e gerar as fatias no vibratome deve ser minimizado para manter a viabilidade do tecido...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 patrocinado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e o Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Os conteúdos e opiniões expressos são de responsabilidade de seus autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com a nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Obrigado ao Dr. Kevin Otto, universidade da Flórida, por fornecer o vibratome usado para gerar fatias de rato.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Estilo Bisturi PunhoFisherbrand12-000-163
1 M HEPESFisher ScientificBP299-100HEPES Buffer, Solução 1M
10 cm Prato de Cultura Não TratadoCorning430591
Seringa Luer-Lok de 10 mL SeringaBD301029BD com Pontas Luer-Lok
Agulha de 27 GBDBD 305109Agulhas hipodérmicas BD de uso geral e precisãoGlide
35 mm placa de Petri com fundo de lamínulaIbidi81156µ-Dish 35 mm,
seringa alta de 50 mLBD309653
lamínula com câmara de 8 poçosIbidi80826µ-Slide 8 Well
APC anticorpo CD8a anti-ratoBiolegend100712
BSAFisher Scientific199898
Cloreto de cálcioSigmaC5670CaCl2
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigmaC7902CaCl2 (di-hidratado)
Compact Digital RockerThermo Fisher Microscópiolaser confocal 88880020
científicaLeicaSP8Pinhole = 1,5-2 unidades arejadas; adquirido com objetivas HC PL APO CS2 secas de abertura numérica de 10x/0,40 e HC PL APO CS2 secas de abertura numérica de 20x/0,75 a 512 e thinsp; &vezes;   Resolução de 512 pixels
D-(+)-GlucoseSigmaG7021C6H12O6
ddiH2O
DithizoneSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345Dimethyl sulfoxide
Ethanol Decon Laboratories2805
Placa de cultura de tecidos Falcon 35 mmCorning353001Falcon Placas de cultura de tecidos de fácil aderência
FBSGibco10082147
Feather No. 10 Surgical BladeMicroscopiaCiências 7204410
fluo-4-AMInvitrogenF14201indicador Ca2+ permeável a células
Super Colade controle de gelLoctite45198
Graefe FórcepsFerramentas de Ciência Fina11049-10
Tesoura Fina EndurecidaFerramentas de Ciência Fina14090-09
HBSSGibco14025092Hanks Solução Saleira Balanceada
HEPESSigmaH4034C8H18N2O4S
Balde de geloFisherbrand03-395-150
IsofluranoPatterson VeterinaryNDC 14043-704-05
Grampo de Bulldog Johns HopkinsRoboz Surgical StoreRS-7440  Reto; 500-900 gramas de pressão; Kimwipes de 1,5" de Comprimento
Kimberly-Clark Professional34705Kimtech Science™ Kimwipes™ Limpadores de Tarefas Delicadas, Kit de Viabilidade
/Citotoxicidade VIVO/MORTOInvitrogenL3224Este kit contém o corante de células vivas calceína-AM.
Baixo teor de glicose DMEMCorning10-014-CV
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigmaM9272MgCl2 (hexahidratado)
Sulfato de magnésio heptahidratadoSigmaM2773MgSO4 (heptahidratado)
Plataforma aquecida magnéticaWarner InstrumentsPM-1Plataforma para câmara de imagem para estimulação dinâmica gravações
MicroondasGEJES1460DSWW
Nalgene Filtro de seringaThermo Fisher Scientific726-2520
No.4 PincelMichaels10269140
Câmara de imagem de banho de diamante abertoWarner InstrumentsRC-26Câmara de imagem para gravações de estimulação dinâmica
Oregon Green 488 BAPTA-1-AMInvitrogenO6807permeável a células Ca2+ indicador
Câmara de imagem noturnaOkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050Para fazer agarose para geração de fatias
Tetrâmero de insulina marcado com PEEmory Tetramer Research Sequência centralYAIENYLEL
Penicilina EstreptomicinaGibco15140122
Cloreto de potássioSigmaP5405KCl
Fosfato de potássio monobásicoSigmaP5655KH2PO4
Lâminas de barbearMicroscopia eletrônica Ciências71998para vibratome; Aço inoxidável de borda dupla, não revestido
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque agarose de baixo ponto de fusão Lonza50101Para fazer agarose para geração de fatias
Âncora de fatiaWarner Instruments64-1421
Âncora de fatia (imagem dinâmica)Warner Instruments640253Âncora de fatia para câmara
de imagem dinâmicaBicarbonato de sódioSigmaS5761NaHCO3
Cloreto de sódioSigmaS5886NaCl
Fosfato de sódio monohidratadoSigmaS9638NaH2PO4 (monohidratado)
Inibidor de tripsina de sojaSigmaT6522-1GInibidor de tripsina de Glycine max (soja)
Estágio AdaptadorWarner InstrumentsSA-20MW-ALPara ajustar a câmara de imagem para gravações de estimulação dinâmica no estágio do microscópio
Incubadora de palcoOkolabH201
EstereoscópioLeicaIC90 E MSV266
SYTOX Coloração de Células Mortas AzuisInvitrogenS34857coloração de ácido nucleico fluorescente azul
Pipeta de TransferênciaFalcão357575Falcon™ Sistema de controle de válvula de pipetas de transferência descartáveis de plástico
Warner InstrumentsVCS-8Sistema para gravações de estimulação dinâmica
Vibratome VT1000 SLeicaVT1000 S
Banho-mariaFisher ScientificFSGPD02Fisherbrand Isotemp Banho-maria de luxo de uso geral GPD 02
de varredura a eletrônica de 2 Camadas

References

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