Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.
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Artigo de método
Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As fatias vivas de tecido pancreático permitem o estudo da fisiologia da ilhota e funcionam no contexto de um microambiente de ilhotas intactos. As fatias são preparadas a partir de tecido pancreático humano vivo e rato embutido em agarose e cortado usando um vibratome. Este método permite que o tecido mantenha viabilidade e função, além de preservar patologias subjacentes como diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D). O método de fatia permite novas direções no estudo do pâncreas através da manutenção das estruturas complexas e de diversas interações intercelulares que compõem os tecidos endócrinos e exócrinos do pâncreas. Este protocolo demonstra como realizar a coloração e microscopia de lapso de tempo de células imunes endógenas vivas dentro de fatias pancreáticas, juntamente com avaliações da fisiologia da ilhota. Além disso, essa abordagem pode ser refinada para discernir populações de células imunes específicas para antígenos de células ilhotas usando grandes reagentes complexos-multimers de histocompatibilidade.
Introdução
O envolvimento do pâncreas é pathognomônico a doenças como pancreatite, T1D e T2D1,2,3. O estudo da função em ilhotas isoladas geralmente envolve a remoção das ilhotas de seu ambiente circundante4. O método de fatia de tecido pancreático vivo foi desenvolvido para permitir o estudo do tecido pancreático, mantendo microambientes intactos de ilhotas e evitando o uso de procedimentos estressantes de isolamento de ilhotas5,6,7. Fatias de tecido pancreático do teci....
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Protocolo
NOTAs: Todos os protocolos experimentais que utilizam camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida (201808642). Seções pancreáticas humanas de doadores de tecidos de ambos os sexos foram obtidas através da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD), universidade da Flórida. A pancreata humana foi colhida de doadores cadavéricos de órgãos por organizações certificadas de aquisição de órgãos em parceria com a nPOD de acordo com as leis e regulamentos de doação de órgãos e classificada como "Sujeitos Não Humanos" pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Flórida (IRB) (IRB nº 392-20....
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Resultados
Este protocolo produzirá fatias de tecido pancreático ao vivo adequadas tanto para estudos de funcionalidade quanto para gravações de células imunes. A aparência de fatia em campo brilhante e sob luz refletida são mostradas na Figura 1A,B. Como discutido, as ilhotas podem ser encontradas em fatias usando luz refletida devido à sua granularidade aumentada que ocorre devido ao seu teor de insulina (Figura 1C) e são claramente observadas em compara.......
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Discussão
O objetivo deste protocolo é explicar a geração de fatias de pâncreas e os procedimentos necessários para empregar as fatias em estudos funcionais e imunológicos. Há muitos benefícios em usar fatias pancreáticas vivas. No entanto, existem várias etapas críticas que são essenciais para que o tecido permaneça viável e útil durante os protocolos de experimento descritos. É imperativo trabalhar rapidamente. O tempo entre injetar o pâncreas e gerar as fatias no vibratome deve ser minimizado para manter a viabilidade do tecido.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 patrocinado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e o Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Os conteúdos e opiniões expressos são de responsabilidade de seus autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com a nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://ww....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #3 Estilo Bisturi Punho | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, Solução 1M |
| 10 cm Prato de Cultura Não Tratado | Corning | 430591 | |
| Seringa Luer-Lok de 10 mL Seringa | BD | 301029 | BD com Pontas Luer-Lok |
| Agulha de 27 G | BD | BD 305109 | Agulhas hipodérmicas BD de uso geral e precisãoGlide |
| 35 mm placa de Petri com fundo de lamínula | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, |
| seringa alta de 50 mL | BD | 309653 | |
| lamínula com câmara de 8 poços | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anticorpo CD8a anti-rato | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma | C7902 | CaCl2 (di-hidratado) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Microscópio | laser confocal 88880020 | |
| científica | Leica | SP8 | Pinhole = 1,5-2 unidades arejadas; adquirido com objetivas HC PL APO CS2 secas de abertura numérica de 10x/0,40 e HC PL APO CS2 secas de abertura numérica de 20x/0,75 a 512 e thinsp; &vezes; Resolução de 512 pixels |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol Decon Laboratories | 2805 | ||
| Placa de cultura de tecidos Falcon 35 mm | Corning | 353001 | Falcon Placas de cultura de tecidos de fácil aderência |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Microscopia | Ciências 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | indicador Ca2+ permeável a células |
| Super Cola | de controle de gelLoctite | 45198 | |
| Graefe Fórceps | Ferramentas de Ciência Fina | 11049-10 | |
| Tesoura Fina Endurecida | Ferramentas de Ciência Fina | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Solução Saleira Balanceada |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Balde de gelo | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurano | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Grampo de Bulldog Johns Hopkins | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Reto; 500-900 gramas de pressão; Kimwipes de 1,5" de Comprimento |
| Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Limpadores de Tarefas Delicadas, Kit de Viabilidade | |
| /Citotoxicidade VIVO/MORTO | Invitrogen | L3224 | Este kit contém o corante de células vivas calceína-AM. |
| Baixo teor de glicose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahidratado) |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahidratado) |
| Plataforma aquecida magnética | Warner Instruments | PM-1 | Plataforma para câmara de imagem para estimulação dinâmica gravações |
| Microondas | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Filtro de seringa | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Pincel | Michaels | 10269140 | |
| Câmara de imagem de banho de diamante aberto | Warner Instruments | RC-26 | Câmara de imagem para gravações de estimulação dinâmica |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | permeável a células Ca2+ indicador |
| Câmara de imagem noturna | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | Para fazer agarose para geração de fatias |
| Tetrâmero de insulina marcado com PE | Emory Tetramer Research Sequência central | YAIENYLEL | |
| Penicilina Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Cloreto de potássio | Sigma | P5405 | KCl |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Lâminas de barbear | Microscopia eletrônica Ciências | 71998 | para vibratome; Aço inoxidável de borda dupla, não revestido |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque agarose de baixo ponto de fusão Lonza | 50101 | Para fazer agarose para geração de fatias | |
| Âncora de fatia | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Âncora de fatia (imagem dinâmica) | Warner Instruments | 640253 | Âncora de fatia para câmara |
| de imagem dinâmicaBicarbonato de sódio | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Cloreto de sódio | Sigma | S5886 | NaCl |
| Fosfato de sódio monohidratado | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohidratado) |
| Inibidor de tripsina de soja | Sigma | T6522-1G | Inibidor de tripsina de Glycine max (soja) |
| Estágio Adaptador | Warner Instruments | SA-20MW-AL | Para ajustar a câmara de imagem para gravações de estimulação dinâmica no estágio do microscópio |
| Incubadora de palco | Okolab | H201 | |
| Estereoscópio | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Coloração de Células Mortas Azuis | Invitrogen | S34857 | coloração de ácido nucleico fluorescente azul |
| Pipeta de Transferência | Falcão | 357575 | Falcon™ Sistema de controle de válvula de pipetas de transferência descartáveis de plástico |
| Warner Instruments | VCS-8 | Sistema para gravações de estimulação dinâmica | |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Banho-maria | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp Banho-maria de luxo de uso geral GPD 02 |
Referências
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R.
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Reimpressões e permissões
