Artigo de método

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

DOI:

10.3791/62228

10 de fevereiro de 2021

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Resumo

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Os distúrbios oculares afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas a disponibilidade limitada de tecidos humanos dificulta seu estudo. Modelos de camundongos são ferramentas poderosas para entender a fisiopatologia de doenças oculares devido às suas semelhanças com a anatomia humana e a fisiologia. Alterações no epitélio pigmento da retina (RPE), incluindo alterações na morfologia e função, são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares. No entanto, o isolamento bem sucedido e a cultura das células RPE do mouse primário é muito desafiador. Este artigo é uma versão audiovisual atualizada do protocolo publicado anteriormente por Fernandez-Godino et al. em 2016 para isolar e cultivar eficientemente células RPE do mouse primário. Este método é altamente reproduzível e resulta em culturas robustas de monocamadas RPE altamente polarizadas e pigmentadas que podem ser mantidas por várias semanas na Transwells. Este modelo abre novos caminhos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes às doenças oculares. Além disso, fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas que podem ser usadas para tratar doenças oculares importantes com necessidades médicas não atendidas, incluindo distúrbios hereditários da retina e degenerações maculares.

Introdução

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Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células de pigmento de retina de camundongos (RPE), que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas transwell. O RPE é uma monocamada localizada no olho entre a retina neural e a membrana do Bruch. Esta camada única consiste em células epiteliais altamente polarizadas e pigmentadas unidas por junções apertadas, exibindo uma forma hexagonal que se assemelha a um favo de mel2. Apesar dessa aparente simplicidade histológica, o RPE executa uma grande ....

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Protocolo

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Foram seguidas as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.

NOTA: Este método tem sido comprovado com sucesso com camundongos de diferentes origens genéticas, incluindo C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e ratos albinos, em várias idades. Use preferencialmente camundongos de 8 a 12 semanas para obter células RPE. As células RPE de camundongos mais velhos proliferam menos na cultura e os camundongos mais jovens têm células cada vez menores, o que requer a junção de olhos de diferentes animais para ter culturas viáveis.

1. Preparação ....

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Resultados

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Este protocolo tem sido usado para isolar e cultivar células RPE de camundongos geneticamente modificados1. Não foram observadas diferenças entre cepas de camundongos ou sexo. Os resultados têm ajudado a compreender alguns aspectos importantes do mecanismo subjacente às doenças oculares subjacentes, como a degeneração macular relacionada à idade, que é a causa mais comum de perda de visão entre os idosos9. As células RPE isoladas após este protocolo foram completamente liga.......

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Discussão

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Enquanto vários métodos para o isolamento e cultura das células RPE do camundongo haviam sido desenvolvidos antesde 1,13,20,22,26,27, o método de Fernandez-Godino usou pela primeira vez inserções de membrana permitindo o crescimento eficiente das células RPE na cultura durante as semanas1,

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Genômica Ocular em Massachusetts Eye and Ear.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de ponta BD Luer-Lok de 10 ml, descartávelBD Biosciences309604
tubo de centrífuga de 15 mlVWR International21008-103
Tubo de centrífuga de 50 mlVWR International21008-951
Alpha Minimum Essential MediumSigma-AldrichM4526-500ML
Micropinça angularWPI501727
Centrífuga de bancadaqualquer
incubadora de CO2ThermoHERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Microscópio de dissecaçãoQualquer
Dulbecco' s Phospate Buffered Saline sem Cálcio, sem MagnésioGibco14190144
Dumont #5 45° Pinças de Biologia Médica, ponta de 0,05 x 0,01 mm, comprimento de 11 cmWPI14101
EtanolSigma-AldrichE7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mmBD Biosciences353001
Fetal BovineSerum HycloneSH30071.03Inativado por calor.
Hank' s Solução salina balanceada mais cálcio e magnésio, sem fenol RedLife Technologies14175095
Hank' s Solução salina balanceada mais cálcio e magnésio, sem fenol vermelho B6Life Technologies14025092
HEPES 1MGibco15630106
HialuronidaseSigma-AldrichH-3506 1G
HidrocortisonaSigma-AldrichH-0396
Capa de fluxo laminarThermoCLASSE II A2 4 115V PACOTECLA
Laminina 1mg/ mlSigma-AldrichL2020-1 MGDiluir em PBS a 37C a 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Tesoura 8 cm de comprimentoWPI503216
Aminoácidos não essenciais 100XGibco11140050
N1 Suplemento 100XSigma-AldrichN6530-5ML
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-148
Lâmina cirúrgica de aço carbono Bard-Parker estéril tamanho 11Fisher-Scientific08-914B
TaurinaSigma-AldrichT-0625
Placas de 12 poços tratadas para cultura de tecidosFisher-Scientific08-772-29
Placas de 6 poços tratadas para cultura de tecidosFisher-Scientific14-832-11
Transwell suporta 6,5 mmSigma-AldrichCLS3470-48EA
Triiodo-thyroninSigma-AldrichT-5516
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolPinçaGibco 25200056
Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curva, aço inoxidável 0,02 x 0,06 mm Pontas ModWPI500232
Vannas Tesoura 8cm de comprimento, aço inoxidávelWPI501790
Filtros de Seringa Whatman Puradisc 25mm 0.45μ m tamanho do poroFisher-Scientific6780-2504
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Referências

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  1. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3),....

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