Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Resumo

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Resumo

Poderosas técnicas de sequenciamento de próxima geração oferecem análises robustas e abrangentes para investigar como as redes reguladoras de genes da retina funcionam durante o desenvolvimento e nos estados de doenças. O sequenciamento de RNA unicelular nos permite traçar alterações abrangentes de expressão genética observadas no desenvolvimento da retina e na doença a nível celular, enquanto o ATAC-Seq unicelular permite que a análise da acessibilidade e do fator de transcrição de cromatina sejam perfilada em resolução semelhante. Aqui, descreve-se o uso dessas técnicas na retina em desenvolvimento, e multi-Seq é demonstrado, onde amostras individuais são rotuladas com um complexo oligonucleotídeo-lipídio modificado, permitindo aos pesquisadores aumentar o escopo de experimentos individuais e reduzir substancialmente os custos.

Introdução

Entender como os genes podem influenciar o destino celular desempenha um papel fundamental na interrogação de processos como doenças e progressão embrionária. As complexas relações entre fatores de transcrição e seus genes-alvo podem ser agrupadas em redes reguladoras genéticas. A montagem de evidências coloca essas redes reguladoras genéticas no centro de doenças e desenvolvimento através das linhagens evolutivas¹. Embora técnicas anteriores como qRT-PCR se concentrem em um único gene ou conjunto de genes, a aplicação da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento permite o perfil de transcriptomes celulares completos.

Protocolo

O uso de animais para esses estudos foi realizado por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins, em conformidade com as diretrizes do ARRIVE, e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes.

1. MULTI-seq

1. Preparação da mídia
   1. Prepare e equilibre o inibidor de ovomucoid, 10 mg de inibidor de ovomucoid e 10 mg de albumina por mL da Solução de Sal Balanceado (EBSS) de Earle, por 30 minutos antes do uso¹³. Equilibre com 95% O₂:5% CO₂ em uma incubadora.
      1. Prepare a solução de dissociação papain, ....

Resultados

Este fluxo de trabalho estabelece uma estratégia de investigação de fenótipos de desenvolvimento e processos regulatórios usando sequenciamento de célula única. O multiplexing de amostra multi-seq permite um ensaio inicial de fenotipagem de baixo custo, enquanto a coleta e fixação emparelhadas de amostras para scRNA-seq e scATAC-seq permite uma investigação mais aprofundada (Figura 1).

A codificação multi-seq permite o sequenciamento combinado de múltiplas amostra.......

Discussão

O poder do MULTI-seq decorre da integração perfeita de dados de múltiplas condições experimentais ou modelos e do enorme benefício em termos de custo e limitação dos efeitos em lote. Utilizar multi-seq oferece um laboratório sem precedentes fenotipagem de profundidade. Métodos não genéticos de multiplexagem, como hashing celular ou hashing de núcleos, abriram a porta para amostras multiplexadas através do uso de anticorpos^com código de barras ^7,19,20

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 µ L, 200 µ L, 1000 µ Ponteiras
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100 µ Solicitação de solução de código de barras M	do laboratório do Gartner	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =true
100% Etanol	Millipore Sigma	E7023-500ML
100% Metanol	Millipore Sigma	322415-100ML
10x Chip Holder	10x Genômica	1000195
10x Controlador de cromo e Kit de Acessórios	10x Genomics	PN-120263
Tubo de Centrífuga de 15mL	Qualidade Biológica	P886-229411
40 µ Filtro de Célula FlowMi M	Bel-Art	H13680-0040
50 µ M Anchor Solution	Sigma ou solicitação do Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =true
50 µ M Co-Anchor Solution	Sigma ou solicitação do laboratório Gartner	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =true
5200 Sistema Analisador de Fragmentos	Agilent	M5310AA
filtro de células FlowMi de 70 um	Bel-Art	H13680-0070
Centrífuga Allegra X-12R	VWR	BK392302
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9647
Cromo Next GEM Chip G	10x Genomics	PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H	10x Genomics	PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1	10x Genomics	PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Kit de Contas de Gel v3.1	10x Genomics	PN-1000121
Microscópio de dissecação
DNA LoBind, 1,5 mL	Eppendorf	22431021
Gelo Seco
Espuma EVA Ice Ice Ice	Tequipment	04393-54
Array Short, 33 cm	Agilent	A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Banho-maria Fisher	Scientific	15-460-20Q
Forma CO2 Incubadora com camisa de água	ThermoFisher Scientific	3110
Glicerol 50% Solução aquosa	Ricca Chemical Company	3290-32
Hausser Scientific Câmara de contagem de linhas brilhantes	Fisher Scientific	02-671-51B
Illumina NextSeq ou NovaSeq	Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix	HiFi	7958927001
Qualidade de tampão de baixo TE	Solução de cloreto de magnésio biológico	351-324-721
1 M	Sigma-Aldrich	M1028
Rack separador magnético para tubos de 1,5 mL	Millipore Sigma	20-400
Rack Separador Magnético para 200 µ Tubos L	10x Genomics	NC1469069
MULTI-seq Primer	Sigma ou IDT	Veja a lista
MyFuge Mini Centrifuge	Benchmark	Scientific C1008
Nonidet P40 Substituto	Sigma-Aldrich	74385
Água livre de nuclease	Micropipetas Fisher Scientific	AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000	Eppendorf
	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
PBS pH 7.4 (1X)	Fisher Scientific	10010-023
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Centrífuga Refrigerada 5424 R	Eppendorf	2231000655
Pilões de pellets descartáveis sem RNase	Fisher Scientific	12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2615
RPI primer	Sigma ou IDT	Veja a lista
Kit de Índice Único N, Conjunto A	10x Genomics	PN-1000212
Kit de Índice Único T Conjunto A	10x Genomics	PN-1000213
Solução de Cloreto de Sódio 5 M	Sigma-Aldrich	Kit de Reagentes SPRIselect 59222C
Pipetas de Transferência Descartáveis Padrão
TempAssure PCR 8-tube strip	USA Scientific	1402-4700
Solução de Cloridrato de Trizma, pH 7.4	Solução de Azul de Tripano Sigma-Aldrich	T2194
	Primer Universal I5 Corning	25-900-CI
	Sigma ou IDT Veja a	lista
sequências Veriti Termociclador	Aplicador Misturador	de
	Biosystems VWR	10153-838

de filtro de pipeta L Digitonin Fisher Scientific BN2006 Tubos Leica FA 12-Capilar de sequências Sistema de Dissociação de Papaína de sequências Beckman Coulter B23318 Fisher Scientific 13-711-7M , 0.4% (p/v)de Vórtice 4375786