Method Article

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poderosas técnicas de sequenciamento de próxima geração oferecem análises robustas e abrangentes para investigar como as redes reguladoras de genes da retina funcionam durante o desenvolvimento e nos estados de doenças. O sequenciamento de RNA unicelular nos permite traçar alterações abrangentes de expressão genética observadas no desenvolvimento da retina e na doença a nível celular, enquanto o ATAC-Seq unicelular permite que a análise da acessibilidade e do fator de transcrição de cromatina sejam perfilada em resolução semelhante. Aqui, descreve-se o uso dessas técnicas na retina em desenvolvimento, e multi-Seq é demonstrado, onde amostras individuais são rotuladas com um complexo oligonucleotídeo-lipídio modificado, permitindo aos pesquisadores aumentar o escopo de experimentos individuais e reduzir substancialmente os custos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entender como os genes podem influenciar o destino celular desempenha um papel fundamental na interrogação de processos como doenças e progressão embrionária. As complexas relações entre fatores de transcrição e seus genes-alvo podem ser agrupadas em redes reguladoras genéticas. A montagem de evidências coloca essas redes reguladoras genéticas no centro de doenças e desenvolvimento através das linhagens evolutivas1. Embora técnicas anteriores como qRT-PCR se concentrem em um único gene ou conjunto de genes, a aplicação da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento permite o perfil de transcriptomes celulares completos.

O RNA-seq oferece um vislumbre da transcriptômica em larga escala 2,3. O sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) dá aos pesquisadores a capacidade de não apenas traçar transcrições de perfil, mas vincular tipos de células específicas com perfisde expressão genética 4. Isso é conseguido bioinformática alimentando perfis de células individuais em algoritmos de classificação usando marcadores genéticos conhecidos5. O multiplexing usando sequenciamento de índices marcados por lipídios (MULTI-seq) oferece uma diversidade sem precedentes no número de perfis scRNA-Seq que podem ser coletados6. Esta técnica baseada em lipídio difere de outras técnicas de indexação de amostras, como o hashing celular que dependem da presença de antígenos superficiais e anticorpos de alta afinidade em vez da integração da membrana plasmática7. Não só agora é possível traçar perfis de expressão genética em tipos de células, mas diferentes experimentos podem ser combinados em uma única biblioteca de sequenciamento, reduzindo drasticamente o custo de um experimento individual de scRNA-seq6. O custo do scRNA-seq pode parecer proibitivo para uso em experimentos de fenotipos onde são analisados muitos genótipos, condições ou amostras de pacientes diferentes, mas o multiplexing permite a combinação de até 96 amostras em uma única biblioteca6.

O perfil da expressão genética via scRNA-seq não tem sido a única técnica baseada em sequenciamento de alto rendimento para revolucionar a compreensão atual de como os mecanismos moleculares ditam o destino celular. Embora entender quais transcrições genéticas estão presentes em uma célula permite a identificação do tipo celular, igualmente importante é entender como a organização genômica regula o desenvolvimento e a progressão da doença. Estudos iniciais se basearam na detecção de decote mediado por DNase de sequências não ligadas a histones, seguidos pelo sequenciamento dos fragmentos de DNA resultantes para identificar regiões de cromatina aberta. Em contraste, o ensaio celular único para sequenciamento de cromatina acessível transposon (scATAC-seq) permite que os pesquisadores testem DNA com um transposon domesticado para perfilar facilmente cromatina aberta no nível único de nucleotídeo8. Isso passou por um dimensionamento semelhante ao scRNA-seq e agora os pesquisadores podem identificar tipos de células individuais e perfis de fenótipos em milhares de genomas individuais8.

O emparelhamento de scRNA-seq e scATAC-seq permitiu aos pesquisadores a capacidade de perfilar milhares de células para determinar populações celulares, organização genômica e redes de regulação genética em modelos de doenças e processos de desenvolvimento 9,10,11,12. Aqui, os autores descrevem como primeiro utilizar multi-seq para condensar fenotipagem de uma miríade de modelos animais e empregar scRNA-seq e scATAC-seq emparelhados para obter uma melhor compreensão da paisagem e redes regulatórias de cromatina nesses modelos animais.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso de animais para esses estudos foi realizado por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins, em conformidade com as diretrizes do ARRIVE, e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes.

1. MULTI-seq

  1. Preparação da mídia
    1. Prepare e equilibre o inibidor de ovomucoid, 10 mg de inibidor de ovomucoid e 10 mg de albumina por mL da Solução de Sal Balanceado (EBSS) de Earle, por 30 minutos antes do uso13. Equilibre com 95% O2:5% CO2 em uma incubadora.
      1. Prepare a solução de dissociação papain, 20 unidades/mL papain e 0,005% DNase na EBSS, durante esta etapa de incubação13.
        NOTA: Um frasco de solução DNase será suficiente para 5 amostras. Frascos adicionais podem precisar ser reconstituídos se realizarem MULTI-seq em mais de 5 amostras.
    2. Prepare soluções de codificação de oligo modificadas lipídicas.
      1. Faça uma diluição de código de barras única para cada amostra, combinando 0,5 μL de 100 μM de solução de estoque de código de barras com 4,5 μL de Salina Tamponada fosfato (PBS).
      2. Para preparar a solução de código de barras de 1:1 na relação molar, combine 4,4 μL de diluição de código de barras de 10 μM, 0,9 μL de solução de âncora de 50 μM e 16,7 μL de PBS e coloque no gelo. A concentração final tanto para os fios de código de barras quanto para os fios de âncora deve ser de 2 μM.
      3. Para preparar a solução co-âncora, combine 0,88 μL de solução co-âncora de 50 μM e 21,12 μL de PBS e coloque no gelo. A concentração final da co-âncora deve ser de 2 μM. Multiplique os volumes nesta etapa por 1,1x o número de amostras.
    3. Para fazer 1% de BSA na PBS, dissolva 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA) em 10 mL de PBS e coloque no gelo.
    4. Para fazer PBS com inibidor de RNase, combine 2,5 μL de 40 inibidores de RNase U/μL com 197,5 μL de PBS e armazene no gelo. Multiplique os volumes nesta etapa por 1,1x o número de amostras.
  2. Dissociação da amostra
    1. Eutanize os animais por luxação cervical e/ou asfixia por CO2 de acordo com os requisitos institucionais da IACUC. O método para a eutanásia dependerá de requisitos institucionais e organismo modelo utilizado.
    2. Disseque a retina de ambos os olhos em PBS frio sob um microscópio de dissecção e transfira para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL estéril usando uma pipeta de transferência.
    3. Transfira 500 μL da solução papain para um tubo de 1,5 mL para cada amostra.
    4. Coloque amostras na solução papain e cubra imediatamente os tubos.
    5. Incubar os tubos contendo as amostras a 37 °C, 5% de CO2 por 30 min. Inverta os frascos 3 vezes a cada 10 minutos. As amostras devem se dissociar progressivamente a cada rodada de inversões.
    6. Volte os frascos à temperatura ambiente e triturar cada amostra 3-4 vezes com uma pipeta de 1 mL definida para 300 μL.
    7. Deixe que quaisquer pedaços de tecido não dissociado permaneçam após a trituração para resolver.
    8. Remova a suspensão celular nublada, evitando qualquer pedaço de tecido não dissociado e coloque a suspensão celular de cada amostra em um novo tubo estéril de 15 mL tampado por parafuso.
    9. Centrifugar as suspensões celulares a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente.
    10. Durante a etapa de centrifugação, prepare a mídia de resuspensão celular.
      1. Misture 857 μL de EBSS (Frasco 1) com 95 μL de solução inibidora de albumina-ovomucoid reconstituída em um tubo estéril de 1,5 mL tampado. Adicione 48 μL de solução DNase salvo de 1.1.1. Multiplique os volumes nesta etapa por 1,1x o número de amostras.
    11. Descarte o supernasce, tenha o cuidado de reter as pelotas celulares e resuspense imediatamente as pelotas de célula em solução de ressuspensão de células de 1 mL preparada na etapa 1.2.10.
    12. Prepare o gradiente de densidade descontínua.
      1. Para cada amostra, adicione 1,6 mL de solução inibidora de ovomucoid a um novo tubo estéril de 15 mL e coloque cuidadosamente a suspensão celular em cima. A interface entre as duas camadas do gradiente deve ser visível, mas alguma mistura não afeta os resultados.
    13. Centrifugar os gradientes de densidade descontínua a 70 x g por 6 min a temperatura ambiente. As células dissociadas devem ser pelotas na parte inferior dos tubos enquanto os fragmentos de membrana permanecem na interface.
    14. Descarte o supernasce e adicione 200 μL de PBS para lavar as células pelladas. Centrifugar a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente.
    15. Descarte o supernasce e resuspenque as células em 180 μL de PBS com inibidor de RNase. Passe as células através de um coador de células de 40 μm em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL estéril.
  3. Codificação de barras de células
    1. Adicione 20 μL de solução de âncora:código de barras a cada amostra e pipeta suavemente para misturar. Certifique-se de que cada amostra receba uma solução de âncora única:código de barras e incubar no gelo por 5 minutos.
      1. Prepare os materiais necessários para a geração de contas de gel (GEM) e a codificação de barras durante esta incubação14.
    2. Adicione 20 μL de solução co-âncora a cada amostra e pipeta suavemente para misturar. Incubar no gelo por 5 minutos.
    3. Adicione 1 mL de 1% de BSA gelado em PBS a cada amostra e centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 °C.
    4. Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular e adicione 400 μL de gelo frio 1% BSA no PBS. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C.
      1. Repita o passo 1.3.4 para um total de 2 lavagens. Remova o supernatante e resuspend em 400 μL gelado frio 1% BSA em PBS.
    5. Determine a concentração de células para cada amostra usando um hemótmetro.
      1. Determine o número total de células para carregar para cada amostra. Normalmente, este é o número total de células desejadas divididas pelo número de amostras. No entanto, se uma réplica biológica para uma condição foi perdida, sua parte pode ser dividida entre as outras réplicas biológicas dessa condição.
      2. Divida o número de células desejadas para cada amostra pela concentração celular dessa amostra calculada na etapa 3.5 para determinar o volume necessário para carregar o número desejado de células.
    6. Combine os volumes calculados na etapa 3.5.2 de cada amostra em um novo tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. É prudente dobrar o volume retirado de cada amostra em caso de falha na geração GEM.
      1. Determine a concentração celular "final" das amostras combinadas usando um hemócito.
  4. Geração GEM e barcoding
    1. Use amostras combinadas para gerar e código de barras GEMs14.
  5. Pós limpeza GEM-RT e amplificação cDNA
    1. Prepare materiais para a limpeza pós-transcriptase reversa gem e amplificação cDNA de acordo com as instruções do fabricante com as seguintes modificações14. Realize a limpeza pós GEM-RT por seleção de tamanho14.
      1. Aumento do volume de 80% de etanol preparado por 2 mL.
      2. Prepare a amplificação cDNA Mix no gelo14. Adicione 1 μL de 2,5 μM MULTI-seq primer ao mix de amplificação cDNA. Vórtice para 5 s e centrífuga para 5 s em uma mini centrífuga de bancada.
    2. Realize a amplificação cDNA14. O cDNA pode ser armazenado a 4 °C por até 72 h neste ponto.
    3. Realizar a limpeza cDNA por seleção de tamanho14. A transcrição endógena cDNA pode ser armazenada a 4 °C por até 72 h ou a -20 °C por até 4 semanas neste ponto.
      1. Não descarte o supernatante da primeira rodada de seleção de tamanho. Esta fração contém os códigos de barras da amostra. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífugo estéril de 1,5 mL.
      2. Guarde o supernatante no gelo.
    4. Vortex para resuspend reagente de tamanho baseado em contas paramagnéticas e adicionar 260 μL reagente de tamanho à base de contas paramagnética (final 3.2x) e 180 μL de 100% isopropanol (1,8x) ao supernante. Pipeta a mistura 10 vezes e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
    5. Coloque o tubo em um rack magnético e espere a solução clarear. Em seguida, remova e descarte o supernatante.
    6. Adicione 500 μL de 80% de etanol às contas e deixe ficar para os 30 s. Remova e descarte o supernatante.
      1. Repita para um total de 2 lavagens.
    7. Centrifufique brevemente as contas e retorne ao rack magnético. Inicie um temporizador por 2 minutos.
    8. Remova o etanol restante com uma pipeta P10 e seque as contas no rack magnético durante o restante dos 2 minutos. Não exceda 2 min.
    9. Remova as contas do rack magnético e resuspense em 100 μL tampão de eluição (EB). Pipeta bem para resuspend.
    10. Incubar em temperatura ambiente por 2 minutos.
    11. Volte para o rack magnético e espere a solução clarear.
    12. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo fresco de 1,5 mL.
    13. Repetição de passos 1.5.4 a 1.5.12. Reduza pela metade o volume de EB tampão utilizado na etapa 1.5.9.
    14. Determine a concentração de DNA de código de barras e a distribuição de tamanho usando um kit de ensaio de alta sensibilidade dsDNA e fluorômetro e analisador defragmentos 15,16. O código de barras cDNA pode ser armazenado a 4 °C por até 72 h ou a -20 °C por até 4 semanas neste momento.
  6. Construção de biblioteca de código de barras
    1. Prepare 1 mL de 80% de etanol.
    2. Prepare a biblioteca de código de barras PCR master mix em um tubo de tira PCR estéril: combine 26,25 μL de 2x hot start PCR ready mix, 2,5 μL de 10 μM Primer Universal i5, 2,5 μL de primer RPI de 10 μM, 3,5 ng de código de barras cDNA (volume determinado pela concentração do Passo 5.14), e água sem nuclease suficiente para levar o volume final a 50 μL.
      1. Use um primer RPI exclusivo para cada biblioteca de código de barras se várias bibliotecas MULTI-seq forem sequenciadas juntas.
    3. Sujeito a mistura mestre da biblioteca de código de barras a uma preparação de biblioteca PCR: 95 °C por 5 min; 10 ciclos de 98 °C para 15 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 30 s; 72 °C por 1 min; e, em seguida, mantenha a 4 °C.
    4. Vórtice para resuspensar o reagente de seleção de tamanho paramagnético baseado em contas.
    5. Remova o produto PCR do termociclador e adicione 80 μL (1,6x) de reagente de seleção de tamanho paramagnético à base de contas. Pipeta completamente.
    6. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Coloque no separador de ímãs na posição alta e aguarde a solução para limpar.
    7. Remova e descarte o supernatante.
    8. Adicione 200 μL de 80% de etanol às contas e deixe ficar por 30 s. Remova e descarte o supernatante.
      1. Repita o passo 1.6.8 para um total de 2 lavagens.
    9. Centrifufique brevemente o tubo e coloque no separador magnético na posição baixa. Inicie um temporizador por 2 minutos.
    10. Remova o etanol restante com uma pipeta P20 e seque as contas no separador magnético durante o restante dos 2 minutos. Não exceda 2 min.
    11. Remova o tubo do separador magnético e resuspense as contas em 25 μL de EB tampão. A pipeta misture bem para resuspensar as contas.
    12. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente.
    13. Retorne ao separador magnético na posição baixa e aguarde a solução para limpar. Transfira o supernatante para um novo tubo de tira PCR.
    14. Quantifique a concentração da biblioteca de expressões e a distribuição do tamanho do fragmento usando o kit de ensaio de alta sensibilidade adsDNA e o fluorômetro e o analisador de fragmentos.
  7. Construção da Biblioteca de Expressão Genética de 3'
    1. Realize a construção da biblioteca de expressão genética de 3'de acordo com as instruções do fabricante14.
  8. Seqüenciamento
    1. Além da biblioteca endógena cDNA amplificada na etapa 7, submeta a biblioteca de código de barras amplificada na etapa 6. Para simplificar, envie essas bibliotecas separadamente, ou como medida econômica, inclua uma alíquota do material de codificação de barras de amostra com a biblioteca cDNA endógena. Meta entre 20.000-50.000 cDNA e 3.000-5.000 leituras de código de barras por célula.
    2. Converta os arquivos bcl de sequenciamento resultantes em arquivos fastq por cellranger mkfastq e conte matrizes geradas a partir destes pela contagem de violoncelranger.
    3. Amostras desconvolutes pós análise cellranger usando o pacote r deMULTIplex disponível no repositório MULTI-seq GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. ScRNA-seq emparelhado e scATAC-seq

  1. Tecido de congelamento flash para scATAC-seq e fixação de metanol de células da retina para scRNA-seq
    1. Preparação da mídia
      1. Para preparar as soluções para dissociação da retina, repita as etapas 1.1.1 e 1.1.4.
      2. Prepare um banho de gelo seco de etanol em um pequeno balde de gelo.
      3. Prepare 15 mL de 70% de etanol adicionando 10,5 mL de etanol a 4,5 mL de água sem nuclease.
      4. Adicione gelo seco suficiente ao balde de gelo (de preferência em forma de pelota) que 15 mL de líquido subirão para cobrir apenas o gelo. Adicione os 15 mL de etanol.
      5. Coloque PBS no gelo e 1 mL de alíquotas de 100% metanol em um conveniente congelador de -20 °C.
    2. Preparação da amostra
      1. Siga as etapas 1.2.1 e 1.2.2 para isolar as retinas; no entanto, desta vez coloque cada retina em um tubo de microcentrifuuge separado.
      2. Para as amostras destinadas ao scATAC-seq, remova qualquer líquido do tubo de microcentrifuuge usando uma pipeta P200 e tampar imediatamente e colocar o tubo em banho de gelo seco a etanol para congelar a amostra.
      3. Para as amostras destinadas ao scRNA-seq, para dissociar as células, repita as etapas 1.2.3 a 1.2.15 na retina dissecada.
      4. Centrifugar as células a 300 x g por 3 min a temperatura ambiente.
      5. Remova o supernatante sem interromper a pelota celular.
      6. Adicione 1 mL de PBS refrigerado e misture delicadamente a pipeta 10 vezes ou até que as células estejam completamente suspensas.
      7. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C.
        1. Repetição de passos 2.1.2.5 a 2.1.2.7 para um total de 2 lavagens.
      8. Remova o supernatante sem interromper a pelota celular.
      9. Adicione 100 μL de PBS refrigerado e misture suavemente 10x ou até que as células estejam completamente suspensas.
      10. Comece a fazer o vórtice do tubo na configuração de velocidade mais baixa. Adicione 900 μL de metanol resfriado (-20 °C) gota a gota enquanto continua a vórtice suavemente o tubo para evitar que as células se aglomeram.
      11. Incubar as células no gelo por 15 minutos.
      12. Determine a concentração das células fixas usando um hemótmetro.
      13. Avalie a eficácia da etapa de fixação usando o azul trypan. Uma alta fração de células viáveis indica que mais tempo de fixação é necessário.
      14. Armazene o tecido congelado e as células fixas a -80 °C.
  2. Isolamento de núcleos de tecido congelado flash para scATAC-seq
    1. Preparação da mídia
      1. Prepare o tampão de diluição de lise combinando 9,77 mL de água sem nuclease, 100 μL de 1 M Tris-HCl (pH 7.4), 100 μL de 1 M NaCl, 30 μL de 1 M MgCl2 e 0,1 g de BSA.
      2. Prepare o tampão de diluição de lise à frente, como no dia anterior, e armazene a 4 °C. No dia do protocolo, coloque no gelo.
      3. Equilibre o tampão de núcleos de 20x fornecido pelo fabricante do kit scATAC de -20 °C até a temperatura ambiente. Vórtice e centrífuga brevemente.
      4. Prepare o tampão de 1x lysis incubando a solução de 5% de Digitonin em um banho de água de 65 °C até que o precipitado seja dissolvido. Em seguida, combine 2 mL de tampão de diluição de lise, 20 μL de 10% Tween-20, 20 μL de Substituto P40 Nãoide (pode ser rotulado alternativamente IGEPAL) e 4 μL de Digitonin.
      5. Armazene o tampão de 1x de lise no gelo.
      6. Para preparar o tampão de 0,1x de lise, combine 1,8 mL de tampão de diluição de lise com 200 μL do tampão de 1x lysis e armazene no gelo.
      7. Para preparar o tampão de lavagem, combine 2 mL de tampão de diluição de lise e 20 μL de 10% Tween-20 e armazene no gelo.
      8. Para preparar o tampão de núcleos diluídos, combine 950 μL de água sem nuclease com 50 μL de tampão de núcleos (20x) e armazene no gelo.
    2. Isolamento dos Núcleos
      1. Não descongele a amostra antes da lise. Adicione 500 μL de tampão de 0,1x de lise refrigerado a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo a amostra congelada. Homogeneize imediatamente 15x usando um pilão de pelota.
      2. Incubar por 5 minutos no gelo. Prepare os materiais necessários para a transposição scATAC durante esta etapa de incubação17.
      3. Misture 10x com uma pipeta de 1 mL e incubar por 10 minutos no gelo. Preparação completa dos materiais necessários para a transposição scATAC durante esta etapa de incubação, se ainda não concluída. É desnecessário preparar mais Buffer de Núcleos Diluídos.
      4. Adicione 500 μL de tampão de lavagem refrigerado às células líssedas. Mistura de pipeta 5x.
      5. Passe a suspensão através de um coador de células de 70 μm em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Filtrar ~300 μL de cada vez usando um novo coador de células de 70 μm cada vez.
      6. Passe o fluxo coletado através de um coador de células de 40 μm em um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e armazene no gelo.
      7. Determine a concentração dos núcleos usando um hemócito. Com base na concentração dos núcleos e no volume total da suspensão celular, calcule o número total de núcleos dissociados.
      8. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C e remover o sobrenatante sem interromper a pelota dos núcleos.
      9. Para criar o estoque de núcleos com base na contagem total de núcleos determinados na etapa 2.2.2.7., resuspensar os núcleos em buffer de núcleos diluídos suficientes para alcançar uma concentração de núcleos desejado.
        NOTA: A concentração de núcleos desejados baseia-se na recuperação dos núcleos-alvo para o experimento scATAC-seq e é determinada a partir das Diretrizes de Concentração dos Núcleos encontradas no protocolo17 do fabricante. Por exemplo, se 10.000 núcleos forem finalmente desejados, a concentração de núcleos desejada para o Estoque de Núcleos está entre 3.080 e 7.700 núcleos/μL. Talvez seja melhor mirar no meio do intervalo em concentração.
      10. Determine a concentração dos núcleos usando um hemócito.
      11. Proceda imediatamente à transposição scATAC usando o estoque de núcleos preparados17.
  3. Reidratação de Células Fixas de Metanol para uso em scRNA-Seq
    1. Preparação de mídia
      1. Para preparar o tampão de lavagem/diluição, dissolva 0,01 g de BSA em 1 mL de PBS. Em seguida, adicione 12,5 μL de 40 U/μL RNase Inibidor e misture suavemente. Guarde no gelo.
    2. Reidratação celular
      1. Centrífugas de células fixas de metanol em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL a 3000 x g por 10 min a 4 °C. Em seguida, remova o supernatante.
      2. Adicione 200 μL de tampão de lavagem/diluição refrigerado ao tubo de microcentrifusagem. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenante. Repita para um total de 2 lavagens.
        NOTA: Prepare os materiais necessários para a geração GEM e a codificação de barras durante as duas etapas anteriores14.
      3. Para preparar o estoque celular, com base no número total de células calculado em 2.1.2.12., resuspencou as células em suficiente tampão de lavagem/diluição para alcançar a concentração celular desejada. As concentrações celulares preferidas estão entre 700 e 1200 células/μL.
      4. Determine a concentração celular do estoque celular usando um hemócito.
      5. Proceda imediatamente para a geração GEM e a codificação de barras usando o estoque decélulas 14.
    3. Seqüenciamento
      1. Ao realizar a análise do curso de tempo (como no desenvolvimento ou doença), sequencie várias amostras em uma execução multiplexada (ou seja, várias bibliotecas em uma única célula de fluxo) para reduzir a variação técnica.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este fluxo de trabalho estabelece uma estratégia de investigação de fenótipos de desenvolvimento e processos regulatórios usando sequenciamento de célula única. O multiplexing de amostra multi-seq permite um ensaio inicial de fenotipagem de baixo custo, enquanto a coleta e fixação emparelhadas de amostras para scRNA-seq e scATAC-seq permite uma investigação mais aprofundada (Figura 1).

A codificação multi-seq permite o sequenciamento combinado de múltiplas amostra...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O poder do MULTI-seq decorre da integração perfeita de dados de múltiplas condições experimentais ou modelos e do enorme benefício em termos de custo e limitação dos efeitos em lote. Utilizar multi-seq oferece um laboratório sem precedentes fenotipagem de profundidade. Métodos não genéticos de multiplexagem, como hashing celular ou hashing de núcleos, abriram a porta para amostras multiplexadas através do uso de anticorposcom código de barras 7,19,20

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Disclosures

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Nada para revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Linda Orzolek da Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core por ajudar a sequenciar as bibliotecas produzidas e Lizhi Jiang por realizar as explantas ex vivo retinal.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 µ L, 200 µ L, 1000 µ Ponteiras
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 µ Solicitação de solução de código de barras Mdo laboratório do Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
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100% EtanolMillipore SigmaE7023-500ML
100% MetanolMillipore Sigma322415-100ML
10x Chip Holder10x Genômica1000195
10x Controlador de cromo e Kit de Acessórios10x GenomicsPN-120263
Tubo de Centrífuga de 15mLQualidade BiológicaP886-229411
40 µ Filtro de Célula FlowMi MBel-ArtH13680-0040
50 µ M Anchor SolutionSigma ou solicitação do Gartner labhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
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50 µ M Co-Anchor SolutionSigma ou solicitação do laboratório Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
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5200 Sistema Analisador de FragmentosAgilentM5310AA
filtro de células FlowMi de 70 umBel-ArtH13680-0070
Centrífuga Allegra X-12RVWRBK392302
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA9647
Cromo Next GEM Chip G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.110x GenomicsPN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Kit de Contas de Gel v3.110x GenomicsPN-1000121
Microscópio de dissecação
DNA LoBind, 1,5 mLEppendorf22431021
Gelo Seco
Espuma EVA Ice Ice IceTequipment04393-54
Array Short, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Banho-maria FisherScientific15-460-20Q
Forma CO2 Incubadora com camisa de águaThermoFisher Scientific3110
Glicerol 50% Solução aquosaRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Câmara de contagem de linhas brilhantesFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq ou NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Qualidade de tampão de baixo TESolução de cloreto de magnésio biológico351-324-721
1 MSigma-AldrichM1028
Rack separador magnético para tubos de 1,5 mLMillipore Sigma20-400
Rack Separador Magnético para 200 µ Tubos L10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma ou IDTVeja a lista
MyFuge Mini CentrifugeBenchmarkScientific C1008
Nonidet P40 SubstitutoSigma-Aldrich74385
Água livre de nucleaseMicropipetas Fisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000Eppendorf
Worthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7.4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Centrífuga Refrigerada 5424 REppendorf2231000655
Pilões de pellets descartáveis sem RNaseFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus RNase InhibitorPromegaN2615
RPI primerSigma ou IDTVeja a lista
Kit de Índice Único N, Conjunto A10x GenomicsPN-1000212
Kit de Índice Único T Conjunto A10x GenomicsPN-1000213
Solução de Cloreto de Sódio 5 MSigma-AldrichKit de Reagentes SPRIselect 59222C
Pipetas de Transferência Descartáveis Padrão
TempAssure PCR 8-tube stripUSA Scientific1402-4700
Solução de Cloridrato de Trizma, pH 7.4Solução de Azul de Tripano Sigma-AldrichT2194
Primer Universal I5 Corning25-900-CI
Sigma ou IDT Veja alista
sequências Veriti TermocicladorAplicador Misturadorde
Biosystems VWR10153-838
de filtro de pipeta L Digitonin Fisher Scientific BN2006 Tubos Leica FA 12-Capilar de sequências Sistema de Dissociação de Papaína de sequências Beckman Coulter B23318 Fisher Scientific 13-711-7M , 0.4% (p/v)de Vórtice 4375786

References

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