Artigo de método

Um método de inoculação fácil e flexível para avaliar com precisão os fenótipos de infecção por oídio de Arabidopsis e outras plantas

DOI:

10.3791/62287

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9 de março de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland, 2Department of Nutrition and Food Science, University of Maryland College Park, 3Department of Plant Sciences and Landscape Architecture, University of Maryland College Park

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um protocolo para a construção de um sistema simples de distribuição de esporos constituído por uma caixa de inoculação com uma malha de ~50 μm e uma câmara de plástico transparente. Isso pode ser usado para inocular uniformemente plantas com esporos de oídio, permitindo assim uma avaliação precisa e reprodutível dos fenótipos de doenças das plantas em estudo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reduzir as perdas de culturas devido a doenças fúngicas requer uma melhor compreensão dos mecanismos que regem a imunidade das plantas e a patogênese fúngica, o que, por sua vez, requer a determinação precisa dos fenótipos de doenças das plantas após a infecção por um patógeno fúngico específico. No entanto, a fenotipagem precisa da doença com patógenos fúngicos biotróficos incultiváveis, como o oídio, não é fácil de alcançar e pode ser uma etapa limitante da taxa de um projeto de pesquisa. Aqui, desenvolvemos um sistema de fenotipagem de doenças seguro, eficiente e fácil de operar usando a interação Arabidopsis-oídio como exemplo. Este sistema consiste principalmente em três componentes: (i) uma caixa de inoculação de madeira equipada com uma tampa removível montada com uma malha de aço inoxidável ou nylon de poros de ~50 μm para inocular um plano de plantas com esporos de fungos, (ii) uma câmara de plástico transparente com uma pequena abertura frontal para minimizar a fuga de esporos durante a realização da inoculação no interior, e (iii) um método de deslocamento e distribuição de esporos para inoculação uniforme e eficaz. Os protocolos aqui descritos incluem as etapas e parâmetros para fazer a caixa de inoculação e a câmara de plástico a um baixo custo, e uma demonstração em vídeo de como usar o sistema para permitir até mesmo a inoculação com esporos de oídio, melhorando assim a precisão e a reprodutibilidade da fenotipagem da doença.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O oídio é uma das doenças mais comuns e importantes de inúmeras culturas alimentares e plantas ornamentais1. Estudos de doenças do oídio têm sido muito populares, como evidenciado por mais de 10.500 publicações como o resultado da pesquisa com "oídio" como palavra-chave na Web of Science (a partir de novembro de 2020). De fato, o oídio (representado pela Blumeria graminis) é considerado um dos 10 principais patógenos fúngicos pela revista Molecular Plant Pathology2. A quantificação da suscetibilidade à doença é um passo necessário na caracterização dos genes das plantas que contribuem para a resistência ou suscetibilidade à doença, ou na identificação funcional de genes efetores candidatos no oídio. No entanto, a fenotipagem confiável da doença é muito mais desafiadora com o oídio em comparação com a maioria dos outros patógenos fúngicos, em parte porque, ao contrário dos esporos deste último, os esporos de espécies de oídio (como Golovinomyces cichoracearum UCSC1 com base em nossa experiência de laboratório) mostram viabilidade reduzida após passar por um processo de suspensão de água 3,4 . A inoculação inadequada e/ou desigual de plantas de ensaio com um determinado agente patogénico do oídio pode conduzir a resultados de fenotipagem imprecisos.

Vários métodos de inoculação foram relatados para estudos de oídio. Estes incluem (i) escovação de esporos diretamente de folhas infectadas para testar plantas5, (ii) pulverização de uma suspensão de esporos para testar plantas6, (iii) sopro de esporos usando uma torre de decantação operada a vácuo para plantas no fundo da torre7 e (iv) entrega de esporos pelo uso combinatório de uma membrana de malha de nylon e vibração baseada em som8 . O método de escovação de esporos (ou poeira) é fácil de executar, mas de natureza desigual, portanto, pode não ser preciso para avaliação quantitativa. A pulverização de esporos é conveniente e uniforme, mas, como dito acima, pode resultar em má germinação de esporos4. Os dois últimos (isto é, iii-iv) são métodos muito aprimorados capazes de alcançar até mesmo a inoculação; no entanto, ambos não são flexíveis no ajuste de sua capacidade de inoculação em termos do número de plantas a serem inoculadas em um único evento, fazendo com que qualquer aparelho não seja trivial, e sua operação é restrita a áreas de laboratório onde há vácuo e / ou fonte de eletricidade.

Nosso laboratório trabalha com interação planta-oídio há mais de 20 anos 9,10. Ao longo da última década, testamos uma série de métodos de inoculação e desenvolvemos recentemente um método de inoculação de oídio simples e eficaz. Este método de escovação de esporos à base de malha pode garantir uma inoculação uniforme e é simples e escalável, portanto, deve ser facilmente adotado por qualquer laboratório que trabalhe com oídio.

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Protocolo

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1. Fazer uma caixa de inoculação padrão com uma tampa superior removível montada com uma malha

  1. Compre um rolo de malha de membrana de nylon de 50 μm ou malha de aço inoxidável de 48 μm (recomendado) nas lojas. Certifique-se de encomendar o suficiente para cortar em várias peças de 14 em x 26 em para a substituição de malha desgastada.
  2. Compre um 1/4 em x 2 pés x 4 pés de fibra de média densidade ou compensado, e corte dois 24-1/2 em x 10 em pedaços e dois 12 em x 10 em pedaços para fazer uma caixa de inoculação. Use 8 grampos de canto para apoiar os quatro lados.
    NOTA: Se estiver voltado para o lado largo do gabinete, o lado esquerdo de 12 em x 10 no lado é fixado permanentemente e o lado direito de 12 em x 10 no lado é uma porta removível mantida no lugar por quatro capturas magnéticas (Figura 1A,B).
  3. Coloque quatro cintas de canto de 2 polegadas, duas em cada canto interno do lado esquerdo, a uma polegada do topo e a uma polegada da parte inferior, marque e faça um furo. Use parafusos para prender permanentemente o lado curto esquerdo a dois lados longos (frente e verso). A distância interna entre os dois lados longos deve ser de 12 polegadas e não de 11-1/2 polegadas.
  4. Com as braçadeiras de canto ainda no lugar e o alinhamento adequado da porta direita, marque e perfure a localização das 4 pegas magnéticas para manter a porta destacável direita no lugar. Instale uma maçaneta de botão na porta. A parte superior da porta pega sob a tampa superior (Figura 1A,B).
  5. Para fazer uma tampa superior removível com uma malha, corte a longa cavilha quadrada de madeira em 2 conjuntos de 26 polegadas e 12-3/4 polegadas. Cole e pregue as quatro peças de tal forma que caiba ao redor da caixa - as dimensões internas do quadro são um pouco maiores do que as dimensões externas da caixa, pois a malha da tela será anexada a esse quadro.
  6. Corte a malha da tela para um pouco menos de 14 pol x 26 pol. Não permita que a tela se projete além do quadro de modo a evitar bordas afiadas. Tenha ajuda para esticar a tela no quadro. Segure a malha com a armação por grampos (Figura 1C) e use uma pistola grampeadora com os grampos certos para prender a tela ao quadro.
  7. Corte dois conjuntos de cavilha quadrada de madeira mais curta (21 pol e 9 pol) e use parafusos para encaixotar firmemente a malha ao longo do quadro usando os 4 pedaços mais curtos de cavilha quadrada de madeira (Figura 1C, D).

2. Fazer uma câmara de inoculação

  1. Compre folhas de acrílico transparente e itens de ferragens de lojas apropriadas. Corte uma janela de abertura de 7 em x 20 na folha de acrílico frontal da caixa, conforme mostrado na Figura 2C.
  2. Monte as folhas de acrílico dos lados esquerdo e direito, frontal (com janela) e traseira em uma caixa usando 8 grampos de canto, conforme mostrado na Figura 2A. Certifique-se de que as medidas internas da câmara sejam iguais às dimensões da folha superior.
    NOTA: O lado direito está lá para suporte e não será anexado às folhas dianteiras ou traseiras. É 1/2 em mais curto do que as outras folhas de propósito. Este lado direito se tornará uma porta "puxada para baixo" mantida no lugar por uma dobradiça de ângulo reto na parte inferior e duas capturas magnéticas na parte superior, como mostrado na Figura 2C,D.
  3. Use chaves de canto para fixar os painéis juntos (Figura 2B,C). Segure as chaves no lugar, marque com um marcador sharpie, perfure o centro e, em seguida, faça o furo.
    NOTA: Perfurar acrílico é diferente de perfurar qualquer outra coisa, não force ou o lado do furo oposto à broca pode rachar. Use rebites ou parafusos. Não aperte demais os parafusos ou o acrílico pode rachar com o tempo.
  4. Gire o compartimento em seu lado traseiro e remova as 4 braçadeiras de canto e posicione a folha superior no lugar. Marque e perfure.
  5. Instale a dobradiça de ângulo reto, feita de uma cinta angular de 3/4. Use uma porca de bloqueio de retenção de nylon como uma haste de dobradiça. Não aperte, deixe um vão para que a porta gire nesta dobradiça.
  6. Marque, perfure centralmente, perfure e prenda os dois ímãs magnéticos da porta com parafusos de cabeça de panela #6-32x3/4". Em seguida, prenda as placas de captura com parafusos de cabeça plana #6-32x3/8", consulte a Figura 2C,D.

3. Plantas inoculantes em planícies

  1. Prepare esporos de oídio frescos como inóculo (por exemplo, Arabidopsis oídio Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Cultivar plantas mutantes limpas de Arabidopsis imunocomprometidas4-1 11 em uma câmara de crescimento (22 °C, 65% de umidade relativa por 6-8 semanas) e inocular uma ou meia planta plana de almofada 4-1 para acumular esporos de oídio frescos suficientes (Figura 3A).
  2. Cultivar as plantas para determinação dos fenótipos de infecção no padrão 11 em x 21 em x 2,5 em flats.
    NOTA: Plantas de Arabidopsis cultivadas em dias curtos (8 h de luz, 16 h de escuridão; 22 ° C) por seis a oito semanas são boas para testes de infecção com oídio.
  3. Quando esporos frescos de oídio de plantas infectadas em 8-10 dias após a inoculação (dpi) estiverem disponíveis, mova um plano de plantas para teste de infecção para a caixa de inoculação dentro da câmara de inoculação (Figura 1B,2C).
  4. Corte 15-20 folhas de Arabidopsis fortemente infectadas (ou 4-6 rosetas infectadas, dependendo do tamanho da folha / roseta e do nível de inoculação), deixe as folhas secarem se houver água condensada.
  5. Pegue 1-2 folhas ou uma roseta com um par de pinças longas usando uma mão e enfrente as folhas de cabeça para baixo. Em seguida, coloque as duas mãos através da abertura da câmara e bata suavemente no braço da pinça com uma tesoura enquanto move lentamente as folhas/roseta acima da malha montada na caixa de inoculação (Figura 3B). Repita isso até que todas as folhas ou rosetas sejam usadas.
    NOTA: Os esporos maduros se desalojarão facilmente dos conidióforos das folhas infectadas. Tente desalojar os esporos na malha da forma mais uniforme possível.
  6. Use uma ou duas escovas finas de ventilador-liquidificador para escovar suavemente os esporos através da malha (Figura 3C). Certifique-se de escovar toda a superfície da malha em diferentes direções por quatro ou mais vezes para maximizar a distribuição uniforme de esporos nas plantas no fundo da caixa de inoculação (Figura 3D). Gentilmente bata na malha por algumas vezes com os pincéis para sacudir os esporos que estão presos na malha.
  7. Deixe os esporos se acalmarem por meio minuto. Em seguida, mova para fora o plano que contém as plantas inoculadas da caixa de inoculação. Cubra o plano com uma cúpula de plástico e coloque-o em uma câmara de crescimento (22 °C, 65% de umidade relativa). A fenotipagem da doença pode ser realizada em 5, ou 8 a 12 dpi 12.

4. Inocular plantas com caixas de inoculação menores

NOTA: Nos casos em que menos plantas devem ser inoculadas, a caixa de inoculação padrão ainda pode ser usada. Certifique-se de colocar as plantas no meio da caixa. Desaloje e escove os esporos na área da malha que cobre as plantas para garantir que todas as plantas sejam inoculadas enquanto salva o inóculo. Alternativamente, e de preferência, caixas de inoculação menores podem ser usadas (conforme descrito abaixo).

  1. Converta caixas de papelão em uma caixa de inoculação. Basta remover os lados superior e inferior da caixa, colar o canto para firmá-lo, se necessário, e montar uma malha de 50 μm de tamanho adequado na parte superior, colando ou grampeando (Figura 4A,B).
  2. Mova o plano contendo as plantas dentro da câmara de inoculação, coloque a caixa de inoculação menor em cima do plano para cobrir as plantas.
  3. Desaloje e pincele os esporos conforme descrito acima.

5. Inocular folhas destacadas em placas de Petri

NOTA: Nos casos em que (i) os esporos de oídio fresco são muito limitados e/ou (ii) as plantas devem ser mantidas limpas enquanto os fenótipos da doença e/ou a localização subcelular de proteínas nas células infectadas precisam ser avaliados, as folhas destacadas podem ser usadas para infecção em placas de ágar MS.

  1. Faça uma mini caixa de inoculação que seja apenas um pouco maior que uma placa de Petri.
  2. Prepare placas de ágar médio Murashige e Skoog (MS) de 1/2 resistência (1,5%). Adicione tiabendazol (40 mg/L) para reduzir a contaminação por mofo, se necessário. Conservar as placas a 4 °C no frigorífico até à sua utilização.
  3. Corte uma ou duas folhas totalmente expandidas da base do pecíolo para cada planta individual a ser testada. Insira o pecíolo das folhas separadas em meio de ágar em um ângulo de ~30°.
    NOTA: Cada placa pode conter de 20 a 40 folhas, dependendo do tamanho das folhas e da placa utilizada (Figura 4C).
  4. Inocular as folhas dentro da câmara de inoculação conforme descrito acima. Mova a placa com a tampa para uma câmara de crescimento.
  5. Corte uma pequena seção de uma folha e verifique a localização subcelular das proteínas em pontos de tempo específicos.
  6. Para avaliar os fenótipos de infecção, transfira as folhas para uma placa de ágar MS asséptica fresca a 4 ou 5 dpi. Corte a base do pecíolo antes de inserir as folhas no meio de ágar fresco. Avalie os fenótipos da doença em 8 ou 9 dpi.

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Resultados

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Aqui, apresentamos um novo método de inoculação de esporos de oídio que é fácil de preparar, operar e ajustar. A Figura 1 mostra a montagem da caixa de inoculação padrão com ênfase na marca da tampa removível montada com uma malha de membrana de 50 μm. A Figura 2 mostra a montagem da câmara de inoculação. A Figura 3 ilustra as principais etapas do processo de inoculação utilizando esse sistema. A Figura 4

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Discussão

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Nosso método de inoculação baseado em caixa de malha tem várias vantagens em relação a outros métodos de inoculação. Primeiro, pode alcançar uma distribuição uniforme dos esporos se operado corretamente, como demonstrado na Figura 5. Em segundo lugar, o uso de malha de ~ 50 μm, além de deslocamento de esporos por agitação suave de folhas infectadas pode reduzir a infecção de plantas por tripes ou outros insetos infectantes de plantas que estão presentes em plantas de origem. Em terceiro luga...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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O trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (IOS-1901566) para S. Xiao. Os autores gostariam de agradecer a F. Coker e C. Hooks pela manutenção da instalação de crescimento da planta, e a Jorge Zamora pela ajuda técnica associada à fabricação da caixa e câmara de inoculação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  48 µ Tela de malha de grade de aço inoxidável M; Tamanho: 24" X 48" AmazonNAPara fazer a tampa de uma caixa de inoculação
#6-32 x ¾ " Parafusos de máquina, arruelas planas e porcas Home DepotNAPara fazer uma câmara de inoculação
#6-32 porca de travamento de nylon zincado (4-Pack)Home DepotNAPara fazer uma câmara de inoculação
#6-32x3/8" Parafusos de máquina de cabeça chata Phillips, arruelas planas e porcas Home DepotNAPara fixar  placas de captura de porta magnética
8-32x1/2" parafusos de máquina, arruelas planas e porcasHome DepotNAPara fixar suportes de canto e dobradiça de porta
Folha de filme acrílico extrudado transparente de 0,250 de espessura;   Tamanho: 17 ½ " X 20"Professional PlasticsSACR.250CEFPara fazer uma câmara de inoculação
com 0,250 de espessura de folha mascarada de filme acrílico extrudado transparente; Tamanho: 18" X 20"   Plásticos Profissionais  SACR.250CEFPara fazer uma câmara de inoculação
de 0,250 folha mascarada de filme acrílico extrudado transparente de espessura; Tamanho: 18" X 30" Plásticos ProfissionaisSACR.250CEFPara fazer uma câmara de inoculação
de 0,250 folha mascarada de filme acrílico extrudado transparente de espessura; Tamanho: 20" X 29 ½ "Professional PlasticsSACR.250CEFPara fazer uma câmara de inoculação
1-5/8" porta de armário fecho magnético brancoHome DepotModelo #P110-WPara fazer uma câmara de inoculação
" suporte de canto de aço zincado (8-Pack) Home Depot  Modelo #13611 Para fazer uma caixa e câmara de inoculação
Braçadeira de canto de 3Ferramentas de frete do portoSKU 63653, 1852, 60589Para fazer câmara de inoculação
3/4"  cinta de canto de aço zincado (pacote com 4)Home DepotModelo #13542Para fazer uma caixa e câmara de inoculação
4-7/8" puxadores de porta leves zincadosHome DepotModelo #15184Para fazer uma caixa de inoculação
Liquidificador fino pincéisMichaels StoreM10472846 Para inoculação
Cavilha quadrada de madeira Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" Home DepotNAPara fazer a tampa de uma caixa de inoculação
Placa de fibra de densidade média (1/4" x 2' x 4');  Home DepotModelo# 1508104Para fazer uma caixa de inoculação
Lamínulas de vidro redondas com um 500 µ m gridibidi USA Inc.10816Para determinar  a densidade de esporos
# 2"

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
  4. Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
  5. Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369(1978).
  6. Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
  7. Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
  8. Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
  9. Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
  11. Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
  12. Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).

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