Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.
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Artigo de método
Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Hepatócitos primários são amplamente utilizados em pesquisas básicas sobre doenças hepáticas e para testes de toxicidade in vitro. O procedimento de perfusão de colagem de duas etapas para isolamento primário de hepatócitos é tecnicamente desafiador, especialmente na canulação venosa do portal. O procedimento também é propenso a contaminação ocasional e variações nas condições de perfusão devido a dificuldades na montagem, otimização ou manutenção da configuração de perfusão. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para um procedimento de perfusão de colagem de duas etapas melhorado com controle de perfusão multiparmétrica. Os hepatócitos primários foram isolados com sucesso e confiabilidade, tomando as precauções técnicas necessárias em etapas críticas do procedimento, e reduzindo a dificuldade operacional e mitigando a variabilidade dos parâmetros de perfusão através da adoção de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura e sistema de monitoramento e alarme em tempo real. Os hepatócitos primários isolados exibem consistentemente alta viabilidade celular (85%-95%), rendimento (2-5 x 108 células por rato de 200-300 g) e funcionalidade (atividade albumina, ureia e CYP). O procedimento foi complementado por um sistema integrado de perfusão, compacto o suficiente para ser configurado na coifa de fluxo laminar para garantir o funcionamento asséptico.
Introdução
Hepatócitos primários são ferramentas importantes para pesquisa básica relacionada ao fígado, tratamento de doenças e aplicação, como testes de drogas. O padrão-ouro atual para o isolamento primário do hepatocito é o procedimento de perfusão de colagem de duas etapas 1,2,3 introduzido pela Seglen na década de 19704. No entanto, este procedimento é tecnicamente desafiador e tem uma alta taxa de falha quando realizado por cirurgiões iniciantes. Mesmo quando uma perfusão é considerada bem sucedida, podem ser observadas diferenças drásticas na viabilidade ....
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Protocolo
Todos os procedimentos e habitação animal foram realizados nos números do protocolo R15-0027 e R19-0669 de acordo com as exigências do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura.
1. Elaboração de soluções e instrumentos cirúrgicos
- Prepare buffers e mídia de cultura celular na Tabela 1 usando água ultrapurada.
- Pré-aqueça o tampão sem cálcio e o tampão de colagem até 37 °C em um banho de água antes de usar.
- Autoclave os seguintes instrumentos cirúrgicos e equipamentos de laboratório: um par de tesouras cirúrgicas afiadas, um par de tesoura cirú....
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Resultados
Um cirurgião poderia dizer se a perfusão hepática está acontecendo sem problemas observando o resultado após certos passos. O primeiro desfecho pode ser observado após a canulação, corte do IVC infrahético e restauração da vazão de perfusão. O fígado deve ter mudado completamente a cor do vermelho escuro para o marrom, mantendo seu volume. Se o fígado parece ligeiramente deflacionado e tem uma tonalidade avermelhada ou manchas de vermelho, significa que a taxa de fluxo de perfusão foi definida erroneamente (muito baixa),.......
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Discussão
Existem alguns pontos que são particularmente importantes de se observar para o procedimento de coagem de duas etapas em geral. Em primeiro lugar, deve-se dar um cuidado especial ao resseccionar o fígado. Certifique-se de que o trato gastrointestinal não esteja danificado, pois o vazamento do conteúdo resultará em contaminação bacteriana. Além disso, evite danificar a cápsula do Glisson, que cobre a superfície do fígado durante o procedimento animal. Se a lágrima for grande o suficiente, pode permitir a liberação prematu.......
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Divulgações
Zhou Yan e Hanry Yu declaram interesses concorrentes, pois detêm capital próprio em Vasinfuse, que fabrica e comercializa o Sistema Integrado de Perfusão. Hanry Yu detém equidade em Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Inovar e Synally Futuristech que não têm interesses concorrentes com as informações aqui relatadas.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado em parte pelo MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NuHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instituto de Mecanobiologia de Cingapura (R-714-106-004-135); e Instituto de Bioengenharia e Nanotecnologia, Conselho de Pesquisa Biomédica, Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR) (Projeto Números IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 e MedCaP-LOA-18-02) para Hanry Yu. Ng Chan Way é um pesquisador da Universidade Nacional de Singapura. Gostaríamos de agradecer à Unidade de Microscopia Confocal & Unidade de Citometria de Fluxo da Universidade Nacional de Cingapura por ajuda e aconselhamento na análise da pureza hepatocyte.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material/Equipamento | |||
| 1 seringa de 1 mL | Nipro | ||
| 27G | Nipro | ||
| Black seda trançada não absorvível, sutura cirúrgica não estéril | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 pinça de aço inoxidável, ponta afiada contém ponta redonda dobrada | Bochem | 10333511 | |
| Conjunto de Perfusão | Descartável Vasinfuse | BPF-112 | |
| Tubo de microcentrífuga circular flutuante de 1,5 mL | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| Pinça de Tecido Padrão Alemão, Serrilhada / 1&vezes; 2 dentes, pipeta | Walentech | ||
| Greiner Cellstar | Sistema | ||
| IPS-001 | |||
| 11 cm Microscópio | CVD | produtos médicos ideais Pte Ltd | |
| Folha de Malha Olympus | |||
| 100µ M Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Tesoura de Operação, BL/BL, 13cm | Produtos Médicos Optimal Pte Ltd | STR • Tesoura de operação BL/BL | |
| , SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – Clipe | |
| Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | ||
| Banho-maria Grant | |||
| Reagentes/Produtos Químicos | |||
| 10X Fosfato tampolado com solução salina (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2· 2H2O | Merck | 137101 | |
| Colagenase Tipo IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexametasona | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Ácido linoleico | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Tipo I colágeno bovino | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William ' s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Referências
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endot....
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Reimpressões e permissões
