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Artigo de método

Medição da captação de glutamato usando L-[3H]-glutamato radiomarcado em fatias transversais agudas obtidas de hipocampo ressecado por roedores

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DOI:

10.3791/62292

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2 de outubro de 2021

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1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve uma maneira confiável e simples de obter fatias transversais agudas do hipocampo ex vivo de camundongos e ratos usando um cortador de tecido. Fatias obtidas de hipocampos ressecados podem ser submetidas à análise funcional da captação de glutamato para investigar a homeostase do sistema glutamatérgico.

Resumo

A remoção de glutamato do espaço extracelular por transportadores dependentes de Na+ de alta afinidade é essencial para garantir que os mecanismos de conectividade intrínseca do cérebro funcionem adequadamente e a homeostase seja mantida. O hipocampo é uma estrutura cerebral única que gerencia funções cognitivas superiores e é objeto de vários estudos sobre doenças neurológicas. A investigação de mecanismos fisiológicos e patológicos em modelos de roedores pode se beneficiar de preparações de fatia aguda do hipocampo (AHS). A AHS tem a vantagem de fornecer informações confiáveis sobre a função celular, uma vez que a citoarquitetura e os circuitos sinápticos são preservados. Embora as preparações de AHS sejam comumente utilizadas em laboratórios de neuroquímica, é possível encontrar algumas diferenças metodológicas na literatura. Considerando que protocolos distintos de preparo de cortes podem alterar as regiões hipocampais analisadas, este protocolo atual propõe uma técnica padrão para a obtenção de AHS transverso do hipocampo ressecado. Este protocolo simples de executar pode ser usado em modelos experimentais de camundongos e ratos e permitir várias abordagens ex vivo investigando a dinâmica neuroquímica (no hipocampo dorsal, intermediário e ventral) em diferentes origens (por exemplo, manipulações transgênicas) ou após manipulações in vivo (por exemplo, tratamentos farmacológicos ou modelos de roedores adequados para estudar distúrbios clínicos). Após a dissecação do hipocampo do cérebro do roedor, foram obtidos cortes transversais ao longo do eixo septo-temporal (300 μm de espessura). Esses AHS contêm partes distintas do hipocampo e foram submetidos a uma investigação neuroquímica individual (como exemplo: transportadores de neurotransmissores usando seus respectivos substratos). Como o hipocampo apresenta uma alta densidade de sinapses excitatórias, e o glutamato é o neurotransmissor mais importante no cérebro, o sistema glutamatérgico é um alvo interessante para fenômenos observados in vivo. Assim, o protocolo atual fornece etapas detalhadas para explorar a captação de glutamato em AHS ex vivo usando L-[3H]-glutamato. O uso deste protocolo para investigar a função hipocampal pode ajudar a entender melhor a influência do metabolismo do glutamato nos mecanismos de neuroproteção ou neurotoxicidade.

Introdução

O hipocampo, uma estrutura cerebral enterrada profundamente no lobo temporal medial de cada hemisfério, onde se encontram altas funções cognitivas, é uma das entidades mais estudadas do sistema nervoso central (SNC). A função do hipocampo está fortemente relacionada à memória declarativa e espacial. Essa estrutura também desempenha um papel no comportamento emocional e na regulação das funções hipotalâmicas 1,2,3,4. Desde que foi confirmado, importantes mecanismos de formação e armazenamento de memória ocorrem nessa região e o campo começou a investigar profundamente a região do hipocampo. Assim, o uso de modelos animais que se assemelham a distúrbios cerebrais humanos relacionados às funções do hipocampo, como doença de Alzheimer, epilepsia, depressão maior e estresse, continua a crescer.

Em roedores, o hipocampo é uma estrutura curva que começa perto do septo medial em direção ao córtex temporal ventral. Ao longo de seu eixo longitudinal, o hipocampo pode ser dividido em três regiões diferentes, cada uma relacionada a circuitos específicos1. A parte superior constitui o hipocampo dorsal/septal, a parte inferior constitui o hipocampo ventral/temporal e a área entre eles é considerada o hipocampo intermediário. Há extensa literatura cobrindo as diferenças nas projeções celulares para cada parte, bem como relatos de aspectos cognitivos específicos processados por cada uma 5,6. Em relação à sua organização interna, as regiões do hipocampo podem ser separadas por suas áreas funcionais. A área de Cornu ammonis (CA) é subdividida em CA1, CA2 e CA3 e se estende pela parte superior do hipocampo, acima do giro dentado (DG) e do subículo, que são as partes mais internas do hipocampo (Figura 1). As sinapses localizadas nessas regiões sofrem rearranjo contínuo, apresentando processos neurogênicos e plásticos ao longo da vida3. Vários estudos já mostraram que manipulações experimentais distintas no hipocampo resultam em deficiência cognitiva7. Em relação à avaliação de alterações bioquímicas e moleculares, técnicas utilizando fatias cerebrais agudas são uma excelente ferramenta para melhorar o conhecimento sobre diferentes aspectos do hipocampo.

Devido à sua precisão e reprodutibilidade, muitos estudos que exploraram aspectos de fenômenos relacionados à neurotransmissão (atividade, captação ou liberação enzimática) utilizaram AHS transverso do hipocampo ressecado obtido por helicóptero tecidual 8,9,10,11,12. Esta técnica de fatiamento seguida de avaliação da captação é adequada para experimentos neuroquímicos sofisticados que exigem que a atividade do transportador do tecido do hipocampo seja preservada. Para isso, o emprego de um picador de tecidos é preferível, pois é mais rápido que o vibratomo e fornece o AHS em tempo adequado para uso experimental com precisão adequada.

A neurotransmissão excitatória no cérebro é realizada pelo glutamato, o neurotransmissor mais abundante, inclusive no hipocampo, que é dependente da sinalização do glutamato em maior extensão13,14. Essa abundância de neurotransmissores é rigidamente controlada no ambiente extracelular. No interior das vesículas intracelulares, no entanto, pode atingir até 100 mM15. Uma vez liberado na fenda sináptica, o glutamato não é metabolizado e precisa ser removido para evitar a excitotoxicidade, geralmente desencadeada como resposta a uma sobrecarga de glutamato14,16. O único mecanismo que separa a toxicidade da sinalização normal é o transporte dependente de sódio através da atividade de proteínas localizadas nas membranas plasmáticas de, principalmente, células gliais 14,17,18,19. Esses transportadores [GLAST (EAAT1) e GLT-1 (EAAT2)] regulam rigidamente os níveis extracelulares de glutamato e podem ser modulados por uma ampla gama de fatores, como transcrição de DNA, splicing e degradação de mRNA, síntese e direcionamento de proteínas, atividade de transporte de aminoácidos e atividades de canais iônicos 20,21,22,23. Assim, sua atividade pode ser medida pelo transporte de substrato radiomarcado, como glutamato.

O uso de substratos radiomarcados representa um método preferível para quantificar a atividade do transportador, uma vez que permitem rastrear mecanismos dinâmicos, como o transporte através das membranas celulares. Além de sua alta sensibilidade e especificidade, as vantagens dos experimentos com radiotraçadores incluem sua simplicidade e pequeno custo em comparação com tecnologias concorrentes, como espectrometria de massa24. Além disso, ao usar apenas pequenas quantidades de traçador, os níveis fisiológicos de substratos não são alterados, fornecendo assim uma imagem mais representativa do cenário real da atividade metabólica.

A disponibilidade de abordagens experimentais ex vivo é fundamental para apoiar a pesquisa básica na identificação de novos alvos moleculares e atividades de descoberta de medicamentos. Assim, considerando a relevância da captação de glutamato para a homeostase do sistema glutamatérgico e a alta predominância de sinapses glutamatérgicas no hipocampo, este protocolo demonstra como avaliar a atividade de captação de glutamato em um método rápido e de fácil reprodução usando AHS transverso do hipocampo ressecado. Este ensaio usa L-[3H]-glutamato radiomarcado, que permite comparações quantitativas e visualização clara dos resultados, e pode ser modificado para uso com substratos específicos ou personalizados, em uma ampla gama de condições de reação25.

Fatias cerebrais agudas apresentam muitas vantagens e têm sido usadas para apoiar a mudança de função sob manipulações farmacológicas e genéticas 26,27,28. Seu uso se beneficia do seguinte: (i) a conservação da funcionalidade neuroquímica e as interações célula a célula; (ii) a possibilidade de realizar inúmeras manipulações farmacológicas e genéticas para investigar vias subjacentes às funções neuronais e gliais; (iii) controle preciso do ambiente extracelular; e (iv) bom acesso experimental a diferentes áreas hipocampais (como CA1, CA3 ou DG), que são mantidas na mesma fatia dependendo do método de fatiamento. Considerando que protocolos distintos de preparo de cortes podem alterar as regiões do hipocampo expostas, este protocolo propõe uma técnica padrão para a obtenção de AHS transverso do hipocampo ressecado. Este protocolo simples de executar pode ser usado em modelos de roedores e pode permitir várias abordagens ex vivo investigando a dinâmica neuroquímica em diferentes contextos ou após manipulações in vivo29,30 (Figura 2).

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética local (aprovação do projeto # 33732/CEUA-UFRGS). Todos os esforços foram feitos para minimizar o desconforto e o número de animais utilizados nos experimentos.

1. Preparando a solução salina balanceada de Hank (HBSS)

  1. Num copo de 1 L, adicionar cerca de 0,5 L de água estéril ou bidestilada e começar a agitar vigorosamente num agitador magnético. Adicione os seguintes componentes HBSS (em mM): 137 NaCl, 0,63 Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,41 MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-Glicose (ver Tabela 1).
  2. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH ou HCl antes de adicionar 1,26 mM CaCl2 para evitar precipitação. Adicione este sal muito lentamente e sob agitação. Aumente o volume de 1 L com água estéril ou bidestilada Este tampão será usado para lavar o tecido e manter o AHS em um estado viável durante o experimento. Ele fornecerá íons inorgânicos, mantendo um pH fisiológico e pressão osmótica.
    NOTA: A adição de cátions divalentes é feita após a titulação do pH para evitar precipitação.
  3. Separe duas frações diferentes de HBSS: uma será mantida em banho-maria a 37 °C e usada durante o paradigma de absorção, enquanto a outra será mantida gelada (4 °C) e usada para lavagens antes e depois do experimento.
    NOTA: É possível preparar soluções de estoque de cada sal e mantê-las congeladas até o uso, armazená-las no freezer (-20 °C) e usá-las dentro de algumas semanas.

2. Preparando HBSS sem sódio

  1. Antes de misturar os componentes para HBSS sem sódio, prepare com antecedência duas outras soluções: Glucamine-HCl (137 mM) e Glucamine-HEPES (4,17 mM). Misture concentrações equimolares de base NMDG e HCl para obter a solução de Glucamine-HCl. Faça o mesmo procedimento com ácido livre de HEPES 2,0 M para obter a solução NMDG-HEPES (ver Tabela 2).
  2. Num copo de 0,5 l, adicionar cerca de 0,2 l de água estéril ou bidestilada e começar a agitar vigorosamente num agitador magnético. Adicione os seguintes componentes tampão (em mM): 137 Glucamina-HCl, 4,17 Glucamina-HEPES, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 1,26 MgSO4, 0,41 MgCl2 e 5,55 D-Glicose (ver Tabela 2).
  3. Ajuste o pH para 7,4 com KOH ou HCl e continue mexendo. Adicione 1,26 mM de CaCl2 muito lentamente e sob agitação. Levar a solução até um volume de 0,3 L com água estéril ou bidestilada
    NOTA: Este tampão será usado para medir a captação de glutamato não dependente de sódio, o que permitirá a medição da captação passiva/não específica de glutamato. Após o experimento, este parâmetro é subtraído da absorção total de glutamato para determinar a absorção dependente de sódio.
  4. Após a preparação, este tampão pode ser armazenado no congelador (-20 °C) e utilizado posteriormente em experiências subsequentes. O mesmo vale para as soluções NMDG.
  5. Durante o experimento, sempre mantenha o HBSS sem sódio gelado.

3. Organizando o material para dissecção do hipocampo de ratos

  1. Organize a área de dissecação ao lado da pia antes de iniciar o experimento. Posicione uma guilhotina específica para ratos (para camundongos, será possível usar uma tesoura afiada) na pia para manter a bancada limpa.
  2. Organize os instrumentos cirúrgicos e outros materiais para remoção do cérebro e dissecção do hipocampo na ordem de uso e o mais próximo possível de onde são necessários (consulte a Tabela de Materiais). Coloque a placa de Petri em um balde de gelo. Além disso, mantenha um saco plástico por perto para descarte da carcaça.
  3. Prepare ambas as soluções HBSS na concentração recomendada para uso. O HBSS livre de sódio pode ser congelado e descongelado antes do experimento.
    1. Separe o HBSS contendo sódio em duas porções distintas, conforme recomendado anteriormente: uma aquecida a 37 °C e outra a 4 °C que será usada para dissecação. Descongelar o HBSS isento de sódio e conservá-lo a 4 °C.
  4. Para induzir a anestesia, utilizar isofluranoa 3% 31. Antes de iniciar o experimento, certifique-se de verificar a ausência de reflexo corneano e estimulação nociceptiva da pata traseira.
    NOTA: Tenha o cuidado de escolher o anestésico adequado, pois ele não deve interferir em nenhum parâmetro que estará sob investigação. Para esse protocolo, recomenda-se o uso de anestésico inalatório (por exemplo, isoflurano)32.

4. Eutanásia do rato

  1. Eutanasiar o roedor usando os métodos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), bem como pelo Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 8023, revisado em 1978).
  2. Usando uma guilhotina, decapite o rato imediatamente antes da primeira vértebra cervical.
  3. Coloque a cabeça sobre uma toalha de papel limpa umedecida com solução salina fria. Remover completamente o couro cabeludo com a tesoura cirúrgica tamanho S, bem como o músculo cutâneo visando expor totalmente as suturas na superfície superior do crânio. Inicie este procedimento com cuidado, começando perto do osso occipital e correndo posteriormente ao osso nasal.
    NOTA: Caso o modelo experimental seja de camundongos, use uma tesoura afiada para remover a cabeça. Certifique-se de cortar logo atrás do crânio para excluir o excesso de tecido.

5. Remoção do cérebro do rato

  1. Realize a remoção do cérebro o mais rápido possível. Com um alicate de osso apropriado, faça um único corte entre os dois orifícios dos olhos, unindo os dois orifícios no crânio do rato. Depois, coloque uma ponta da tesoura cirúrgica tamanho S no forame magno e faça um único corte lateralmente no crânio. Repita para o outro lado.
  2. Corte as placas cranianas da placa occipital, depois ao longo da sutura da linha média das placas parietais e, finalmente, até a placa frontal em direção ao nariz. Certifique-se de que a cabeça do roedor esteja firmemente segurada e que a pressão seja direcionada para longe do cérebro para evitar danos ao tecido por baixo.
    NOTA: É extremamente importante que a pressão seja direcionada para longe do cérebro para evitar danos ao tecido por baixo. Em ratos e camundongos jovens, é possível cortar o crânio com uma pequena tesoura cirúrgica.
  3. Remova suavemente as placas occipital e parietal de ambos os hemisférios usando uma espátula ou fórceps. Inspecione cuidadosamente se há matéria de dura-máter que possa estar presa aos ossos do crânio e esticada na superfície do cérebro.
  4. Remova o cérebro imediatamente com a espátula fina de ponta dupla e coloque delicadamente todo o cérebro em uma placa de Petri gelada coberta com papel de filtro. Com a pipeta de plástico Pasteur, umedeça-a com solução salina gelada. Comece imediatamente a dissecar o hipocampo de ambos os hemisférios cerebrais, conforme explicado abaixo.
  5. Ressecção cuidadosamente o cerebelo de todo o cérebro com a lâmina do bisturi # 11. Para separar completamente os hemisférios cerebrais, passe uma lâmina de bisturi por toda a fissura intra-hemisférica. Com a pipeta de plástico Pasteur, umedeça-a com tampão HBSS gelado com frequência para manter o tecido úmido e preservado.
  6. Pegue cada hemisfério separadamente, ressecção o tronco cerebral e o mesencéfalo do córtex sobrejacente com uma tesoura de íris. Cuidadosamente, com a tesoura cirúrgica, corte o tronco encefálico / mesencéfalo / tálamo, enquanto com uma escova fina empurre para baixo e puxe essas estruturas cerebrais. Abaixo será possível observar o hipocampo (superfície medial) e o ventrículo lateral. O córtex com o hipocampo agora deve estar livre do tronco cerebral.

6. Dissecção do hipocampo de ratos

  1. Para ressecar o hipocampo, coloque um hemisfério cerebral no plano coronal com o córtex parietal voltado para baixo. Neste momento, é possível observar as fibras brancas da fímbria que formam uma hipérbole rasa na parte inferior do hipocampo.
  2. Com muito cuidado, com a mão não dominante, ancore o tecido cerebral com uma pinça fina. Com a mão dominante, coloque outras pinças sob a ponta caudal do hipocampo.
  3. Ancorando os tratos mediais da substância branca, posicione a pinça completamente sob o hipocampo para separá-lo do resto do cérebro suavemente. Aplique pressão enquanto move a segunda ponta ligeiramente anterior e lateralmente. Se feito corretamente, o hipocampo deve pousar no papel de filtro.
  4. Para terminar a dissecção do hipocampo, remova o tecido sobressalente com a mesma pinça (geralmente qualquer córtex restante, vasos sanguíneos e substância branca). Repita a mesma metodologia para o segundo hemisfério.
  5. Depois que ambos os hipocampos forem removidos, transfira-os para uma placa de Petri com HBSS colocada no balde de gelo e transfira para a área da mesa de corte acima da lâmina no picador de tecido. Certifique-se de identificar corretamente as áreas dorsal e ventral se a investigação exigir analisá-las separadamente.
    NOTA: É importante sempre distinguir as partes ventral e dorsal do hipocampo durante a dissecção. Ao fazer isso, a extremidade anterior estará voltada para cima33. Esta parte do hipocampo é ligeiramente mais fina que a extremidade posterior.

7. Preparação de fatias

NOTA: Ao organizar o material cirúrgico na bancada (sessão 2), prepare o cortador de tecidos para obter o corte transversal do hipocampo ressecado.

  1. Defina os parâmetros no picador de tecidos antes de usá-lo. O Chopper pode cortar fatias de 100 a 400 μm; defina-o para 300 μm. Além disso, recomenda-se uma faixa de 60 a 80 golpes por minuto, pois mantém a integridade do tecido durante o procedimento de corte.
  2. Após todos os procedimentos realizados na sessão 2, uma vez que os hipocampos foram ressecados do cérebro e colocados sobre o papel filtro umidificado com soro fisiológico frio em cima de um suporte liso de polipropileno, alinhe cada hipocampo no papel filtro antes de submetê-los ao procedimento de corte.
  3. Coloque o hipocampo de cada vez na mesa de corte circular de aço inoxidável do picador de tecido, perpendicular às lâminas de corte para obter as fatias transversais do hipocampo ao longo do eixo septo-temporal. Antes de iniciar o processo de corte, umedeça levemente a lâmina com álcool isopropílico. Este procedimento evita que o tecido grude na lâmina, permitindo um corte mais suave e preciso.
  4. Depois de ligar o equipamento, a lâmina no braço de corte será levantada e solta, cortando o tecido na espessura selecionada. Este é um processo rápido e, normalmente, o tecido será cortado adequadamente após um minuto. É possível cortar mais de um hipocampo ao mesmo tempo se eles forem mantidos devidamente separados na mesa de corte.
  5. Para separar as fatias, pegue cada amostra fatiada do picador de tecidos cuidadosamente usando a espátula de ponta dupla e mergulhe-a em uma placa de Petri com solução salina gelada. Usando duas escovas finas, aperte suavemente o hipocampo e separe as fatias. Tenha cuidado para manter a integridade da fatia por meio desse processo.
    1. Realize este experimento em triplicatas, portanto, selecione 6 fatias de cada amostra: 3 fatias para a absorção total de glutamato e 3 para a absorção inespecífica.
  6. Com o pincel, transfira suavemente cada fatia da placa de Petri para uma placa de 24 poços contendo: (i) 1 mL de HBSS; e (ii) 1 mL de HBSS isento de sódio. Identificar o poço/placa com os grupos experimentais correspondentes e realizar a análise pelo menos em triplicatas.
    NOTA: Devido a um problema de tempo limitado, se o experimento for realizado em triplicatas, ele limita o número de animais/grupos a apenas 6 de cada vez (um hipocampo por animal em 5 minutos de absorção). Isso significa que o L-[3H]-glutamato será administrado a cada 15 s até que todas as fatias sejam incubadas. Para interromper a reação, o mesmo intervalo deve ser observado para garantir que todas as amostras sejam expostas a um período de incubação de 5 minutos.

8. Ensaio de captação de glutamato

  1. Durante a estabilização das fatias no respectivo tampão (HBSS ou HBSS livre de sódio), preparar a solução contendo radioativo diluindo L-[3H]-Glutamato em água estéril até uma concentração final de 4,5 μCi/mL em um volume final que permita 20 μL por fatia mais algum excesso, o que evitará a falta de entrada radioativa no final do lote, uma vez que será necessário quantificar quantas desintegrações por minuto (DPM) foram oferecidas a cada fatia no início.
    NOTA: Para cada placa de 24 poços, recomenda-se preparar 500 μL de 4,5 μCi/mL L-[3H]-glutamato devido ao tempo total de incubação necessário para a captação de L-[3H]-glutamato (5 min) e o tempo para pipetar cada alíquota de 20 μL (0,33 μCi em cada poço), conforme explicado abaixo. A concentração estoque de L-[3H]-glutamato é geralmente de 1,0 mCi/mL, portanto, prepare uma diluição de 1:200 para aplicar nas fatias.
  2. Após 15 min de pré-incubação em HBSS, remova completamente o tampão com uma pipeta Pasteur e substitua-o adicionando às fatias 280 μL de um dos seguintes: (i) HBSS regular (37 ° C) para absorção total; ou ii) HBSS isento de sódio (4 °C) para absorção inespecífica. É importante notar que a absorção total deve ser realizada em uma placa de aquecimento a 37 °C, enquanto a absorção inespecífica é realizada no gelo.
  3. Prepare um temporizador e defina o início do experimento ao adicionar 20 μL de entrada no primeiro poço contendo uma fatia. Aguarde de 15 a 20 s (dependendo do número de fatias na placa) e adicione a entrada radioativa ao próximo poço e assim por diante até o final dos poços contendo fatias. Distribua 20 μL de entrada em todos os poços sempre considerando o tempo total de incubação (5 min).
  4. Uma vez que cada um dos poços contendo fatias na placa esteja cheio, espere que a primeira fatia complete 5 min de incubação com L-[3H]-glutamato. Em seguida, remova imediatamente o meio de incubação para um frasco adequado para resíduos radioativos.
  5. Imediatamente após a remoção, adicione rapidamente 300 μL de HBSS gelado e remova-o com cuidado. Repita este procedimento mais duas vezes em cada poço, completando três lavagens para cada fatia. Certifique-se de usar o HBSS sem sódio para lavar as fatias dedicadas à medição de absorção inespecífica. Depois de lavar todas as fatias da placa, adicione 300 μL de NaOH 0,5 M a cada poço e armazene a placa protegida com parafilme a 4 °C durante a noite.

9. Contagem do L-[3H]-glutamato radioativo

  1. No dia seguinte, rotule tantos tubos quanto fatias no experimento e colete o conteúdo do poço para cada tubo. Certifique-se de que as fatias estejam completamente solubilizadas na solução de lise. Se necessário, homogeneizar a amostra usando uma agulha de calibre 26 acoplada a uma seringa de 1 mL.
  2. Adicione 1,2 mL de líquido de cintilação a um volume final de aproximadamente 1,5 mL e homogeneize todas as amostras em um vórtice antes de lê-las em um contador de cintilação por 60 s cada.
    NOTA: Certifique-se de que os parâmetros de detecção estejam definidos como trítio e o resultado será entregue em DPM.

10. Cálculos

  1. Converter os resultados obtidos pelo contador de cintilação na radioactividade emitida pelo reagente retido na fatia e representar a quantidade de glutamato absorvida. Deduzir o valor obtido para a captação inespecífica do resultado obtido com o HBSS regular. Um μCi é equivalente a 2,22×106 DPM.
  2. Conhecendo a quantidade de μCi e a concentração original de [3H]L-Glutamato (informação geralmente fornecida no frasco ou folha de dados do reagente), calcule o L-[3H]-Glutamato capturado por cada fatia.

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Resultados

A captação de glutamato é um dos mecanismos mais importantes que controlam a neurotransmissão no cérebro. O hipocampo, especificamente, é um local crítico na sinalização do glutamato, sendo um importante centro que conecta memória, cognição e emoções no cérebro. Seguindo o protocolo, ratos Wistar machos adultos foram usados para gerar resultados representativos. Os animais foram anestesiados com isoflurano 3% até ficarem inconscientes. Após a dissecação do cérebro, os hipocampos foram removidos e colocados na mesa picado...

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Discussão

O protocolo apresentado mostra uma avaliação da captação de glutamato de fácil execução usando fatias do hipocampo. Os resultados demonstram que a AHS ocupa regularmente cerca de 60 fmol de L-[3H]-glutamato radiomarcado, que a espessura da fatia (quantidade de proteína) não influenciou a captação de L-[3H]-glutamato (dados não mostrados) e que as partes dorsal, intermediária e ventral do hipocampo exibiram desempenhos semelhantes quando obtidas de ratos Wistar macho...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores recebem apoio financeiro do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Excitotoxicidade e Neuroproteção [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] e [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#11 lâmina de bisturiSwann-Morton525
placa de Petri de vidro de 100 mmFornecedores
Filtro Whatman de 110 mm de diâmetroFiltro Sigma AldrichWHA1001110 Filtro
42,5 mm de diâmetro Placade cultura de células deSigma Aldrich
Falcon353047
BeckerFornecedores
Lâminas para o picador de tecidosWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Ácido aspárticoPerkinElmerNET581001MC11,3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-glicoseSigma AldrichG8270
N-metil-D-glucaminaSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Tesoura de írisErwin Guth8,00,040
IsofluranoCristalia (Sã o Paulo, Brasil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Ácido GlutâmicoPerkinElmerNET490005MC49,7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Pipeta de plástico Pasteur Fornecedores
comunsLíquido de cintilaçãoPerkinElmer1200.437 para 1 x 5 litrosOptiphase HiSafe 3
Tesoura cirúrgica pequenaErwin Guth8,00,040
Pinças pequenasErwin Guth6,00,131
Discos de corte sobressalentes para o picadorFornecedores
Tesoura padrãoErwin Guth8,00,010
Escovas finas ( tamanho 0 ou 2)Fornecedores
Espátula fina de ponta duplaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.Rolamento 10180
comuns Whatman de 24 poços WHA1001042 comunscomunscomuns

Referências

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  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
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