O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.
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Artigo de método
Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A sensação de paladar é mediada por papilas gustativas na língua, que são compostas de células receptoras de sabor (TRCs) que renovam rapidamente. Essa rotatividade contínua é alimentada por células progenitoras locais e torna a função de paladar propensa à interrupção por uma infinidade de tratamentos médicos, o que, por sua vez, impacta severamente a qualidade de vida. Assim, estudar esse processo no contexto do tratamento medicamentoso é vital para entender se e como a função progenitora do sabor e a produção de TRC são afetadas. Dadas as preocupações éticas e a limitada disponibilidade do tecido de sabor humano, os modelos de camundongos, que têm um sistema de sabor semelhante aos humanos, são comumente usados. Em comparação com os métodos in vivo, que são demorados, caros e não favoráveis a estudos de alto rendimento, organoides linguais murinos podem permitir que experimentos sejam executados rapidamente com muitas réplicas e menos camundongos. Aqui, protocolos publicados anteriormente foram adaptados e um método padronizado para gerar organoides de paladar a partir de células progenitoras de sabor isoladas da papila circunvallada (CVP) de camundongos adultos é apresentado. Células progenitoras de sabor no LGR5 expresso CVP e podem ser isoladas através da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de camundongos portadores de um alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. As células classificadas são banhadas em um sistema de cultura 3D baseado em gel matricial e cultivadas por 12 dias. Os organoides se expandem durante os primeiros 6 dias do período cultural por meio da proliferação e, em seguida, entram em uma fase de diferenciação, durante a qual geram todos os três tipos de células de paladar, juntamente com células epiteliais sem gosto. Os organoides podem ser colhidos após o amadurecimento no dia 12 ou a qualquer momento durante o processo de crescimento para expressão de RNA e análise imunohistoquímica. Padronizar métodos culturais para a produção de organoides linguais a partir de células-tronco adultas melhorará a reprodutibilidade e avançará organoides linguais como uma poderosa ferramenta de triagem de medicamentos na luta para ajudar pacientes que experimentam disfunção do sabor.
Introdução
Em roedores, as papilas gustativas linguais são alojadas em papilas fungiformes distribuídas anteriormente, papilas foliadas bilaterais posteriormente, bem como uma única papila circunvallada (CVP) na linha média posterodorsal da língua1. Cada paladar é composto por células receptoras de sabor de 50-100 de curta duração, que renovam rapidamente as células receptoras de sabor (TRCs), que incluem células de suporte tipo I, células tipo II que detectam células doces, amargas e umami, e células tipo III que detectam células azedas2,3,4. No mouse CVP, as células-tronco LGR5+ ao longo da lamina basal produzem todos os tipos de TRC, bem como células epiteliais não saborosas5. Ao renovar a linhagem de sabor, as células filhas LGR5 são primeiramente especificadas como células precursoras do sabor pós-mitótico (células tipo IV) que entram em uma papila gustativa e são capazes de se diferenciar em qualquer um dos três tipos TRC6. A rápida rotatividade dos TRCs torna o sistema de paladar suscetível à interrupção por tratamentos médicos, incluindo radiação e certas terapias medicamentosas7,8,9,10,11,12,13. Assim, estudar o sistema de paladar no contexto da regulação de células-tronco do sabor e da diferenciação de TRC é vital para entender como mitigar ou prevenir a disfunção do sabor.
Os camundongos são um modelo tradicional para estudos in vivo em ciência do sabor, uma vez que possuem um sistema de sabor organizado de forma semelhante aos humanos14,15,16. No entanto, os camundongos não são ideais para estudos de alto rendimento, pois são caros de manter e demorados para trabalhar. Para superar isso, métodos in vitro de cultura organoide têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Organoides de paladar podem ser gerados a partir do tecido CVP nativo, um processo no qual organoides brotam do camundongo isolado CVP epitélio cultivado ex vivo17. Estes organoides exibem um epitélio multicamadas consistente com o sistema de sabor in vivo. Uma forma mais eficiente de gerar organoides que não requerem a cultura ex vivo CVP foi desenvolvida pela Ren et al. em 201418. Adaptando métodos e meios de cultura desenvolvidos pela primeira vez para cultivar organoides intestinais, isolaram células lgr5-GFP+ progenitores únicas do mouse CVP e as banhavam em gel de matriz19. Essas células únicas geraram organoides linguais que se proliferam durante os primeiros 6 dias de cultura, começam a se diferenciar por volta do dia 8, e ao final do período cultural contêm células epiteliais sem gosto e todos os três tipos TRC18,20. Até o momento, foram publicados múltiplos estudos utilizando o sistema de modelo organoide lingual17,18,20,21,22; no entanto, os métodos e condições de cultura utilizados para gerar esses organoides variam entre as publicações (Tabela Suplementar 1). Assim, esses métodos foram ajustados e otimizados aqui para apresentar um protocolo padronizado detalhado para a cultura de organoides linguais derivados do LGR5+ progenitores do mouse adulto CVP.
Organoides linguais fornecem um modelo único para estudar os processos biológicos celulares que impulsionam o desenvolvimento e renovação das células do paladar. À medida que as aplicações dos organoides linguais se expandem e mais laboratórios se movem para utilizar modelos organoides in vitro, é importante que o campo se esforce para desenvolver e adotar protocolos padronizados para melhorar a reprodutibilidade. Estabelecer organoides linguais como uma ferramenta padrão dentro da ciência do sabor permitiria estudos de alto rendimento que provocam como células-tronco únicas geram as células-tronco diferenciadas do sistema de paladar adulto. Além disso, organoides linguais poderiam ser empregados para rastrear rapidamente drogas para potenciais impactos na homeostase do sabor, que poderia então ser investigada mais detalhadamente em modelos animais. Esta abordagem, em última análise, aumentará os esforços para criar terapias que melhorem a qualidade de vida dos futuros receptores de medicamentos.
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Protocolo
Todos os procedimentos animais foram realizados em uma unidade credenciada pela AAALAC em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Lei de Bem-Estar Animal e Política de Serviços públicos de Saúde, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz. Os camundongos LGR5EGFP-IRES-CreERT2 usados neste protocolo são do Laboratório Jackson, Stock No. 008875.
NOTA: As seguintes etapas devem ser concluídas antes de começar a garantir a progressão suave e oportuna do protocolo: definir banho de água para 37 °C, definir soluções de enzima centrífuga a 4 °C, fazer soluções de enzima de injeção e dissociação a partir das soluções de espase de 10 mg/mL, Colagenase e Elastase (ver Tabela de Materiais),remover gel de matriz a partir de -20 °C congelador (~750 μL necessário para uma placa de 48 poços) e descongelar submergindo o frasco no gelo para a 00 pelo menos 3-4 h, tubos de microcentrifuuge pré-casaco em FBS não diluídos balançando suavemente à temperatura ambiente por pelo menos 30 min (dois tubos de 2 mL para coleta de tecido, dois tubos de 1,5 mL para células dissociadas e um tubo de 1,5 mL para coleta de células únicas do classificador celular; remover o excesso de FBS antes de usar).
1. Isolamento do epitélio CVP
NOTA: Para obter células LGR5+ suficientes para uma placa completa de 48 poços, colete três CVPs LGR5-EGFP no mesmo tubo e processe simultaneamente. É importante ressaltar que colhe e processa o CVP de pelo menos um tipo selvagem de ninhado em paralelo em um tubo separado e utilize-o como um controle de gating para definir parâmetros FACS (ver Resultados Representativos).
- Eutanize os camundongos com asfixia de CO2 de acordo com as regulamentações da IACUC, seguido de um método secundário aprovado, como toracotomia bilateral, luxação cervical, decapitação ou exsanguinação.
- Use uma grande tesoura de dissecção estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do chão da cavidade oral. Corte a língua e colete-a em salina tamponada de fosfato de Dulbecco (dPBS) com Ca2+ e Mg2+.
- Remova e descarte a língua anterior cortando apenas antes da eminência intermolar com uma lâmina de barbear(Figura 1A, linha tracejada). Use uma limpeza de tarefa delicada para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da língua posterior.
- Encha 1 mL de seringa com 200-300 μL de solução de enzima de injeção (concentração final: 2 mg/mL tipo-I Colagemnase e 5 mg/mL Dispase II em Ca2+/Mg2+-contendo dPBS, diluído de 10 mg/mL soluções de estoque) e insira uma agulha de 30 G x 1/2 logo acima da eminência intermolar(Figura 1B, seta preta)até apenas antes do CVP (Figura 1B, caixa preta). Injete a solução enzimante por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes (lamina propria, músculo). Retire a seringa lentamente e continuamente da língua à medida que a injeção for realizada.
- Incubar a língua em dPBS ca2+/Mg2+livre a temperatura ambiente por precisamente 33 min.
- Faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e apenas anterior ao CVP usando uma tesoura de dissecção fina extra, e descasque suavemente o epitélio levantando-o com fórceps finos. Uma vez que o epitélio da trincheira esteja livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em um tubo vazio de microcentrifuuge de 2 mL pré-revestido com FBS. Faça o aparador epitelial antes ou depois de desacoplar o epitélio CVP (Figura 1C, D).
2. Dissociação do epitélio CVP
NOTA: A dissociação do epitélio CVP e do revestimento são representadas graficamente na Figura 2.
- Adicione o coquetel de enzima dissociação (concentração final: 2 mg/mL tipo I Collagenase, 2 mg/mL Elastase e 5 mg/mL Dispase II em Ca2+/Mg2+-contendo dPBS, diluído a partir de 10 mg/mL soluções de estoque) para tubos contendo epithelia CVP descascada (200 μL por CVP). Incubar em um banho de água de 37 °C por 45 min. Vórtice brevemente a cada 15 minutos.
NOTA: Pré-aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA em banho de água de 37 °C durante os últimos 15 minutos de incubação de coquetéis enzimados. - Após a incubação, o vórtice (três pulsos) em seguida triturar com uma pipeta Pasteur de vidro por 1 min. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer contendo a primeira coleção de células dissociadas, em novos tubos de microcentrifuuge revestidos de FBS de 1,5 mL correspondentes ao genótipo. Processe ainda mais as peças de tecido restantes conforme descrito na etapa 2.3. abaixo.
- Gire o supernante por 5 min a 370 x g e 4 °C para as células de pelotas.
- Remova o supernascimento resultante e resuspenque a pelota celular no Buffer de Classificação celular Ativado por Fluorescência (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) e 1% FBS em PBS ca2+/Mg2+-free (50 μL por CVP)). Guarde no gelo.
- Ao realizar as etapas 2.2.1 e 2.2.2, dissociar as peças de tecido restantes da etapa 2.2 adicionando 0,25% de trypsin-EDTA (200 μL por CVP) aos tubos originais de microcentrifuge de 2 mL e incubar em um banho de água de 37 °C por 30 minutos. Vórtice brevemente a cada 10 minutos.
- Após a incubação, o tubo contendo pedaços de tecido (três pulsos) em seguida, triturar com uma pipeta Pasteur de vidro por 1 min. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernacido nos tubos de microcentrifuus de 1,5 mL contendo células da etapa 2.2.2. Descarte os tubos que contenham os pedaços de tecido restantes.
- Gire os tubos com células dissociadas por 5 min a 370 x g e 4 °C para células de pelotas.
- Remova as pelotas de células supernascidas e resuspendas em Buffer FACS (100 μL por CVP). Guarde no gelo.
- Passe as células através de um filtro de malha de nylon de 30 μm e adicione DAPI(emissão λ = 450 nm) às misturas celulares antes do FACS. Isole células Lgr5-GFP+ via FACS usando o canal de proteína fluorescente verde (excitaçãoλ = 488 nm;emissão λ = 530 nm). Classifique as células usando um bico de 100 μm em um novo tubo de microcentrifusagem revestido de FBS de 1,5 mL contendo 300 μL de Ca2+/Mg2+ dPBS grátis. Coloque as células no gelo até chapeamento.
3. Chapeamento de células Lgr5-EGFP
- Determine o volume de suspensão celular LGR5+ recebida do citômetro de fluxo.
- Com base no número de células obtidas do classificador, calcule o número de células por μL. Em seguida, determine o volume necessário para obter o número desejado de células para chapeamento (usamos 200 células por poço de uma placa de 48 poços) e transfira esse volume total de células suspensas para um novo tubo de microcentrifuagem.
- Gire o tubo por 5 min a 370 x g e 4 °C para as células de pelota (pelotas podem não ser visíveis). Remova o supernatante e coloque o tubo no gelo.
- Resuspenque suavemente a pelota celular na quantidade apropriada de gel de matriz (15 μL por poço para placas de 48 poços); pipeta para cima e para baixo suavemente para distribuir completamente as células em gel de matriz. Coloque 15 μL de mistura matriz gel/célula no centro de cada poço. Mantenha o tubo de microcentrifuagem no gelo em um tubo cônico de 50 mL durante o revestimento para evitar que o gel de matriz geleia. Continue a misturar mistura matriz gel/célula ao longo do revestimento, pipetando para cima e para baixo a cada três poços para garantir uma distribuição uniforme das células através dos poços.
- Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% DE CO2, ~95% de umidade) por 10 minutos para permitir gelagem de geleia de geleia matricial. Em seguida, adicione 300 μL de temperatura ambiente WENRAS + Y27632 mídia para cada poço e devolva a placa para a incubadora.
4. Manutenção organoide
NOTA: Os organoides são cultivados em mídia organoide convencional (WENR) que compreendem eGF recombinante e mídia 50% condicionada contendo Wnt3a, Noggin e R-spondin23. Medicamentos A8301 e SB202190 são adicionados nos primeiros 6 dias do período cultural para otimizar o crescimento (mídia WENRAS) (Figura 5), depoisremovidos para promover a diferenciação (mídia WENR)20. Y27632 é adicionado para os dois primeiros dias de cultura para promover a sobrevivência. As condições da mídia relativas ao cronograma da cultura são apresentadas na Figura 4.
- Dois dias após o revestimento, remova as mídias WENRAS + Y27632 de cada poço usando uma pipeta de 1 mL, garantindo nenhuma contaminação cruzada. Adicione 300 μL de mídia WENRAS na lateral do poço para não interromper o gel de matriz. Devolva a placa para a incubadora.
- Alterar a mídia a cada 2 dias, utilizando os meios de comunicação apropriados para a fase cultural(Figura 4). Mantenha os organoides até o dia 12, quando os organoides estiverem prontos para a colheita.
5. Processamento de RNA
- Colhendo organoides para RNA
- Coloque placa de 48 poços no gelo por 30 minutos para despolimerizar o gel de matriz.
- Usando uma pipeta de 1 mL, puxe a mídia organoide; então, à medida que a mídia é devolvida ao poço, use a ponta da pipeta para coçar e quebrar ainda mais o gel de matriz. Transfira o conteúdo para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, agrupando o conteúdo de três poços em um tubo. Centrifugar os tubos por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
- Remover o máximo de supernanato de mídia possível sem remover quaisquer organoides; em seguida, gire os tubos novamente por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
- Remova a mídia restante e resuspenque os organoides em 350 μL tampão de lise + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME por tampão de 1 mL de lise). Coloque as amostras no gelo para extração imediata de RNA ou armazene a -80 °C.
- Análise quantitativa de RT-PCR
- Meça a quantidade de RNA via espectotômetro. RNA de transcrição reversa usando um kit de síntese cDNA.
- Misture cDNA equivalente a RNA de 5 ng com primers pré-validados para frente e reverso de 200 nM(Tabela 1) e PCR Master Mix fluorescente. Execute a reação qRT-PCR para 40 ciclos a: 95 °C para 15 s, depois 60 °C para 60 s.
6. Imunohistoquímica
- Colhendo e consertando os organoides
- Coloque placa de 48 poços no gelo por 30 minutos para soltar o gel de matriz.
- Remova a mídia organoide e adicione 400 μL de PBS gelado a cada poço. Em seguida, remova o PBS e adicione 400 μL de solução de recuperação celular gelada a cada poço. Arrase suavemente a 4 °C por 30 min.
- Cubra uma ponta de tubulação de 1 mL com 1% de BSA na PBS, e gentilmente in pipet conteúdo do poço para cima e para baixo para quebrar o gel de matriz. Transfira os organoides para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL colocado no gelo.
- Enxágüe cada poço com 300 μL PBS + 1% BSA e transfira quaisquer organoides restantes para os tubos correspondentes. Remova a solução de recuperação celular/PBS + BSA de cada tubo. Adicione 400 μL de PBS gelado e repita com outra lavagem pbs gelada.
- Remova o PBS e corrija organoides com 300 μL de 4% pfa gelado (em 0,1 M PB) por 20 minutos, incubando à temperatura ambiente. Remova pfa e enxágue organoides com PBS gelado de 400 μL.
- Remover PBS; em seguida, adicione 400 μL PBS + 1% BSA. Armazenar a 4 °C.
- Coloração de imunofluorescência
- Enxágüe organoides em 500 μL PBS + 1% BSA. Em seguida, incubar organoides na solução de bloqueio (5% soro normal de cabra ou burro, 1% de albumina de soro bovino, 0,3% Triton X 100 em 1x PBS pH 7.3) por 2 h, balançando suavemente à temperatura ambiente.
- Adicione a solução de anticorpos primário (anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio) e arrase suavemente por 3 noites a 4 °C.
- Lave organoides 4x por 1h com 500 μL PBS + 0,2% Triton, balançando suavemente à temperatura ambiente. Adicione solução secundária de anticorpos (anticorpos secundários diluídos em solução de bloqueio) e organoides rochosos durante a noite, protegidos da luz, a 4 °C.
- Lave organoides 3x por 1h com 500 μL PBS + 0,2% Triton, protegidos da luz e balançando suavemente à temperatura ambiente. Incubar com DAPI diluído 1:10.000 em 0,1 M PB por 20 min, balançando e coberto à temperatura ambiente.
- Lave os organoides 3x por 20 min com 0,1 M PB, balançando suavemente e cobertos à temperatura ambiente.
- Montagem de organoides para microscopia confocal invertida.
NOTA: As imagens passo a passo do processo de montagem do slide são mostradas na Figura 7.- Crie um perímetro quadrado de 22 x 22 mm de espessura de ~1 mm de argila de modelagem não tóxica em um slide de microscópio.
- Remova 0,1 M PB do tubo de microcentrifuus e resuspende suavemente em 100 μL meio de montagem de escolha; então, transfira para o centro da praça de argila.
- Encha o quadrado de argila até que o meio de montagem esteja quase no topo. Em seguida, coloque as coberturas quadradas de 22 x 22 mm sobre a argila e pressione firmemente para baixo nas laterais da tampa para selar. Deixe curar de acordo com as instruções do fabricante (aqui, temperatura ambiente por 1-2 dias) e armazenar a 4 °C.
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Resultados
Os camundongos possuem um CVP, localizado posteriormente na língua, a partir do qual as células-tronco LGR5+ podem ser isoladas(Figura 1A, caixa preta). A injeção de uma solução enzimápica dentro e ao redor do CVP (Figura 1B) resulta em um leve inchaço do epitélio e digestão do tecido conjuntivo. A digestão suficiente é alcançada após uma incubação de 33 min, o que permite a fácil separação do epitélio CVP do tecido subjacente. Ao ten...
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Discussão
Relatado aqui é um método eficiente e facilmente repetitivo para a cultura, manutenção e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de gosto de camundongos adultos. Verificou-se que o uso de três CVPs de camundongos Lgr5 de 8 a 20 semanas de idade-EGFP é suficiente para obter ~10.000 células GFP+ para uso experimental, resultando em 50 poços banhados a uma densidade de 200 células por poço em placas de 48 poços. A remoção da epitélio da trincheira CVP é otimizada injetando o epit...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Dempsey e Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por fornecer mídia condicionada wnr e discussões valiosas. Agradecemos também à University of Colorado Cancer Center Cell Technologies and Flow Cytometry Shared Resources, especialmente Dmitry Baturin, pela experiência em triagem celular. Este trabalho foi financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 e NIH/NCI R21 CA236480 para LAB, e R21DC016131 e R21DC016131-02S1 para DG, e F32 DC015958 para EJG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos | |||
| Alexa Fluor 546 | Sondas Moleculares | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Sondas Moleculares | IgG de Coelho Anti Coelho Alexa Fluor 546 | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 IgG anti cobaia de cabra | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (para FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (para imuno-histoquímica) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R& D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Porquinho-da-índia anti-KRT13 | Acris Anticorpos | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Coelho anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Coelho anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rato anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: | 1:100 |
| Equipamento | |||
| 2D balancim | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Temporizador / cronômetro de dígitos grandes | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Tanque de | CO2 | Airgas CD USP50 | |
| FormaTM Série 3 Incubadora de CO2 com cano de água | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Aço inoxidável polido |
| Sartorius Incucyte | Modelo: S3 | Cancer Center Cell Technologies Recurso Compartilhado, University of Colorado Anschutz Medical Campus | |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Modelo: S13211997 | Núcleo de Citometria de Fluxo Gates Center, Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | Excella E1 | New Brunswick Scientific | |
| Applied Biosystems | 4376600 | ||
| Espectrofotômetro Eppendorf | 5417R | ||
| Thermo Scientific | ND-1000 | ||
| Estereomicroscópio | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Termociclador | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Banho-maria | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Concentração de estoque 10 mM, final concentração 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Suplemento | Gibco | 17504044 | Concentração de estoque 50X, concentração final 1X |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | Concentração de estoque 1000X, concentração final 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Concentração de estoque 100X, concentração final 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Concentração de estoque 100X, concentração final 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Concentração de estoque 500 µ g/mL, concentração final 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Concentração de estoque 50 µ g/mL, concentração final 25 ng/mL |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma | A9165 | Concentração de estoque 0,5 M, concentração final 1 mM |
| Nicotinamida | Sigma | N0636-100g | Concentração de estoque 1 M, concentração final 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Concentração de estoque 100X, concentração final 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Concentração de estoque 500X, concentração final 1X |
| SB202190 | R& D Systems | 1264 | Concentração de estoque 10 mM, concentração final 0,4 µ M |
| WRN Mídia | condicionada recebida do Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derivado de L-WRN (ATCC® CRL-3276™) células | ||
| Y27632 di-hidrocloridrato 10ug | APExBIO | A3008-10 | Concentração de estoque 10 mM, concentração final 10 µ M |
| Outros | |||
| 1 ml TB Seringa | BD Seringa | 309659 | |
| 2-Mercaptoetanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML& | beta;-mercaptoetanol |
| 2,0 mL Tubos de Microcentrífuga | USA Scientific | 1420-2700 | |
| Placas de 48 poços | Thermo Scientific | 150687 | |
| Pipetas Pasteur de 5 3/4 polegadas | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Tampão de lise | QIAGEN | Solução de Recuperação de Células 1015750 | |
| Corning | 354253 | ||
| Tesoura de Mola Cohan-Vannas | Ferramentas de Ciência Fina | 15000-02 | |
| Colagenase de Clostridium histolyticum, tipo I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Tipo 2, Pathclear | R& D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (protease neutra, grau II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Filtros Descartáveis | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina pH 7,4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ livre) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato com Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Fórceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Liofilizada | Worthington Bioquímica | LS002292 | |
| Tesoura Bonn Extra Fina | Ferramentas de Ciência Fina | 14084-08 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Solução HEPES | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| Kit de Síntese de cDNA iScript | Bio-Rad | 1706691 | |
| Argila de Modelar, Cinza | Sargent Art | 22-4084 | |
| Seringa BD | de agulha 305106 | ||
| soro de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Soro de cabra normal | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Tubos Safe-Lock 1,5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Fosfato de Sódio dibásico anidro | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Fosfato de Sódio monobásico anidro | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| Lâminas de Microscópio SuperFrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tesouras Cirúrgicas - Sharp | Ferramentas de Ciência Fina | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro vidro de cobertura | VWR | 48366067 | 22x22mm |
Referências
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12(2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285(2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442(2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934(2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185(2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004(2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118(2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
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