A relação sinal-ruído dos dados é uma das considerações mais importantes na realização de medições de difração de raios-X a partir de microcristais. A linha de feixe VMXm fornece um ambiente de baixo ruído e micróbios para tais experimentos. Aqui, descrevemos métodos de preparação de amostras para montagem e resfriamento de microcristais para VMXm e outras linhas de cristalografia macromolecular microfocus.
Artigo de método
Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm
Neste artigo
Resumo
Resumo
A montagem de microcristais (<10 μm) para crio-cristalografia de cristal único apresenta um desafio não trivial. Melhorias na qualidade dos dados têm sido observadas para microcristais com o desenvolvimento de óptica de linha de luz, estabilidade do feixe e tamanho de feixe variável com foco de submicron a mícrons, como na linha de feixe VMXm na Diamond Light Source1. Outras melhorias na qualidade dos dados serão obtidas por meio de melhorias no ambiente amostral e na preparação da amostra. Os microcristais inerentemente geram uma difração mais fraca, portanto, melhorar o sinal-para-ruído é fundamental para coletar dados de difração de raios-X de qualidade e virá predominantemente de reduções no ruído de fundo. As principais fontes de ruído de fundo de raios-X em um experimento de difração são de sua interação com o caminho do ar antes e depois da amostra, solução de cristalização em excesso em torno da amostra, a presença de gelo cristalino e dispersão de qualquer outra instrumentação de linha de luz ou janelas de raios-X. A linha de feixe VMXm compreende instrumentação e um protocolo de preparação de amostras para reduzir todas essas fontes de ruído.
Em primeiro lugar, um ambiente de amostra no vácuo no VMXm remove o caminho de ar entre a fonte de raios-X e a amostra. Em seguida, os protocolos de preparação de amostras para cristalografia macromolecular no VMXm utilizam uma série de processos e ferramentas adaptados do crioTEM. Estes incluem grades de cobre com filmes de suporte de carbono furado, blotting automatizado e robótica de resfriamento de mergulho fazendo uso de etano líquido. Essas ferramentas permitem a preparação de centenas de microcristais em uma única grade criotem com líquido mínimo ao redor em um suporte de baixo ruído. Eles também minimizam a formação de gelo cristalino a partir de qualquer líquido restante ao redor dos cristais.
Apresentamos o processo de preparação e avaliação da qualidade de microcristais de proteína solúvel usando a microscopia eletrônica de luz visível e varredura antes de montar as amostras na linha de feixe VMXm para experimentos de difração de raios-X. Também forneceremos exemplos de amostras de boa qualidade, bem como aquelas que requerem maior otimização e estratégias para fazê-lo.
Introdução
Uma grande barreira para a determinação de estruturas de alta resolução de moléculas biológicas por cristalografia macromolecular (MX) continua sendo a produção de cristais bem difundidos em um tamanho favorável. Existem muitas estratégias para alcançar esse objetivo desde o projeto de construção de genes de proteína recombinante até grandes buscas de matrizes esparsas por coquetéis químicos que possam gerar cristais iniciais2. Para este último, muitas vezes é o caso de que o cristalógrafo precisará otimizar quaisquer acertos iniciais para obter cristais com qualidade e tamanho suficientes de difração para estudos de determinação da estrutura3. Apesar dessas opções, algumas moléculas-alvo podem nunca gerar grandes (>10 μm), cristais bem difundidos e, como resultado, o cristalógrafo deve perseverar com seus microcristais e os desafios que tais amostras apresentam. Estes incluem a montagem adequada e a proteção crio-crio dos cristais, o gerenciamento de difração inerentemente mais fraca e o aumento da sensibilidade à radiação. Os microcristais são formados a partir de menos células unitárias e moléculas do que cristais maiores e, como tal, a difração não é amplificada na mesma medida em comparação com cristais maiores, resultando em intensidades de difração inerentemente mais fracas. É importante que o sinal de fundo não mascara essas reflexões, particularmente em maior resolução onde intensidades de reflexo fracas podem ser perdidas4. Além disso, os microcristais são mais sensíveis aos danos causados pela radiação e, apesar de registrarem a difração a temperaturas líquidas de nitrogênio5,pode não ser possível coletar dados completos de um único cristal, tornando necessário coletar dados de um número muito grande de cristais para produzir um único conjunto de dados completo6.
A crescente disponibilidade de lasers de elétrons livres de raios-X (XFELs) e a evolução dos métodos de cristalografia serial (SFX)7 forneceram rotas para a coleta de dados de microcristais menores. No entanto, estes são métodos de entrega de amostras sob medida, que requerem uma quantidade significativa de conhecimento de hardware e software, onde os experimentos são limitados à temperatura ambiente e normalmente o consumo de amostras é alto (centenas de microliters) e ainda pode exigir maior otimização8. Como tal, projetos onde apenas uma quantidade limitada de microcristais podem ser feitos não são apropriados para o SFX.
Enquanto isso, a tecnologia de linha de feixe síncrotron nas últimas décadas progrediu para produzir feixes menores e mais estáveis9 com um brilho que permitiu a coleta de dados de cristais cada vez menores10,11. Feixes de microfoco como FMX na NSLS-II e I24 na Diamond Light Source foram capazes de determinar novas estruturas a partir de cristais com dimensões máximas de ~3 μm12 e demonstrar a capacidade de coletar dados utilizáveis de cristais ainda menores medindo ~1 μm13. A linha de feixe deve ser precisamente configurada, com óptica de visualização em eixo excelente e de alta resolução, uma esfera mínima de confusão para rotação de amostras e um eixo de rotação precisamente alinhado que é coincidente com o feixe de raios-X. É importante combinar de perto o perfil do feixe de raios-X com o volume de cristal e garantir que o cristal esteja precisamente alinhado no feixe de raios-X - um desafio para cristais <5 μm14. Atender a essas condições experimentais na linha de trave é essencial para registrar os dados de melhor qualidade dos microcristais.
O aspecto restante e possivelmente mais importante da coleta de dados a partir de microcristais é a apresentação do cristal ao raio-X. Microcristais têm sido frequentemente montados em montagens de amostras de micromesh, fabricados a partir de poliimida, um material de dispersão de raios-X baixo com aberturas tão pequenas quanto 10 μm15,16. A malha de poliimídeo é montada em um pino padrão que é colocado em uma base de COLUNA magnética, tornando-a compatível com a maioria das linhas de raios MX17. O suporte de malha é usado para pescar cristais da gota de cristalização muitas vezes seguindo o mesmo procedimento que montar um cristal de 100 μm usando um suporte padrão estilo loop. Embora os cristais possam ser distribuídos através da malha, uma desvantagem fundamental é que um volume relativamente grande de líquido pode ser transportado pela malha e pelo pino durante a colheita (Figura 1C,D). Este volume de líquido, que pode ser muitas vezes maior do que os próprios cristais, contribuirá para o ruído de fundo quando iluminado com raios-X. Esta dispersão de fundo pode ser ainda mais forte se o líquido formar gelo cristalino durante o resfriamento de flash, diminuindo a relação sinal-ruído de intensidades já fracas dentro das resoluções de difração de gelo. Portanto, é fundamental que o excesso de líquido seja removido da amostra, para garantir que todos os sinais possíveis possam ser registrados. Esse desafio é ainda maior no caso de cristais de proteína de membrana formados dentro da fase cúbica lipídica (LCP), onde o LCP gera forte dispersão de fundo e também é difícil de remover em torno dos cristais 18.
O novo microfoco de cristalismo macromolecular versátil (VMXm) em Diamond Light Source fornece as condições para coletar dados de cristais potencialmente medindo menos de um mícndo em tamanho. A linha de luz foi projetada para fornecer um perfil de feixe medindo 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, um goniômetro com uma esfera de confusão não superior a 60 nm e um ambiente de amostra de vacuo. Essas características de design da estação final VMXm minimizam a geração de ruído de raios-X de fundo pelo aparelho de linha de feixe durante a coleta de dados com a maior fonte de fundo restante gerada pela amostra14.
Métodos específicos de preparação de amostras projetados para a linha de luz VMXm fornecem uma oportunidade para reduzir esse fundo e melhorar ainda mais o sinal-ruído dos dados de difração, maximizando a qualidade dos dados que podem ser registrados a partir de microcristais que medem < 10 μm. Muitos dos requisitos aqui descritos para difração de baixo fundo de microcristais também são comuns à microscopia eletrônica de transmissão criogênica (crioTEM)19 e à difração eletrônica microcristatal (microED)20. Como resultado, muitas das ferramentas já desenvolvidas para a preparação de amostras criotem são adequadas, com algumas adaptações, para a preparação de microcristais. Na preparação de amostras para crioTEM de partículas únicas, as partículas sob investigação estão embutidas em camadas muito finas (tipicamente <100 nm) de gelo vítreo de tal forma que os elétrons são capazes de transmitir através da amostra. A fina camada uniforme é obtida por manchas de excesso de líquido e a vitrificação da amostra é obtida pelo rápido resfriamento da amostra (~104 K s-1)21 através do mergulho em etano líquido mantido em ~93 K22. Em contraste, o nitrogênio líquido, usado rotineiramente para a preparação da amostra MX, é um criogen menos eficiente do que o etano e tem maior propensão para a formação de gelo cristalino dentro da amostra21. A formação de gelo cristalino, que pode degradar a difração e gerar ruído de fundo, é normalmente atenuada através do uso de compostos crio-protetores23. Polímeros de baixo peso molecular, como polietileno glicol (PEG) 400 e metil-2,4-pentanediol (MPD), açúcares, óleos ou sais saturados podem ser adicionados a uma alíquota de solução de cristalização em baixas concentrações24- não há uma solução "um tamanho que se encaixa em todos" para selecionar o crioprotetor mais adequado e isso muitas vezes requer otimização25 . O cristal também sofre múltiplas manipulações durante o processo de colheita e proteção criobito que podem resultar em danos ao cristal, a oportunidade de utilizar o etano líquido permite a omissão desta etapa e ajuda a proteger a integridade do cristal.
Embora o etano líquido seja um criogen eficaz para microcristais (<10 μm) devido à magreza da amostra, existem métodos alternativos para prevenir a formação de gelo cristalino, particularmente em cristais maiores, incluindo a redução do teor de água do cristal por meio de um ambiente úmido bem controlado26, ou através do acúmulo de excesso de líquido longe tanto do laço quanto da superfície do cristal27 , no entanto, estes requerem novamente maior manipulação da amostra. O uso de manchas automatizadas e congelamento de mergulho com etano líquido, como no crioTEM, juntos removem o excesso de solução de cristalização e fornecem um meio de piscar microcristais frios de forma controlada ao tentar minimizar a manipulação.
Aqui, apresentamos um protocolo que pode ser utilizado não apenas por ambos os usuários da linha de luz VMXm e em outras linhas de feixe de microfoco para coletar dados de difração de sinal-ruído elevados, mas também pode ser útil para aqueles que preparam amostras de cristal de proteína de proteína solúvel e detergente à base de proteínas de membrana para experimentos microED. Embora todas as instalações para preparar e avaliar amostras estejam disponíveis na VMXm, muitos laboratórios de biologia estrutural estão cada vez mais equipados para a preparação da amostra crioTEM. Como resultado, prevemos que alguns usuários podem querer usar suas próprias instalações para preparar suas amostras para o tempo de feixe na VMXm.
Protocolo
1. Configuração do equipamento
NOTA: Os métodos aqui descritos utilizam um instrumento de congelamento de mergulho com um único braço de mancha. Alguns instrumentos são equipados com dois braços de manchas e aconselhamos o usuário a verificar as instruções dos fabricantes para ajustar o instrumento para que apenas um braço de mancha esteja em uso.
- Certifique-se de que um microscópio leve esteja posicionado perto do instrumento de congelamento de mergulho, idealmente para que tanto o microscópio quanto o congelador de mergulho estejam em fácil alcance do usuário.
- Configure e esfrie o congelador automatizado de mergulho de acordo com as instruções dos fabricantes.
NOTA: A temperatura da câmara amostral deve ser definida à temperatura em que os cristais foram cultivados. Não coloque papel manchado na câmara de amostra.
ATENÇÃO: O etano líquido é um explosivo altamente inflamável e só deve ser usado em uma área bem ventilada, longe de possíveis fontes de faísca. - Rotular caixas de grade adequadamente e esfriá-las em uma pequena de guerra usando nitrogênio líquido.
- Coloque cuidadosamente grades, lado de filme de carbono para cima, em um portador apropriado para descarregamento de brilho (como um slide de microscópio de vidro envolto em parafilm).
- Rede crioTEM de descarga de brilho para 25 s a 0,39 mBar, usando uma corrente de 15 mA. Descarga de brilho pouco antes das grades serem usadas. Mantenha as grades descarregadas de brilho em uma placa de Petri coberta até ficar pronta; se 30 minutos caducarem após a descarga do brilho, repita o brilho descarregando.
NOTA: Com o congelador de mergulho pronto e as grades preparadas, a atenção pode se voltar para a amostra.
2. Determinando parâmetros iniciais de manchas
- Defina a umidade relativa da câmara de amostra para 90% e o tempo de mancha para 5 s e certifique-se de que o congelador de mergulho esteja configurado para mergulhar automaticamente a amostra após a mancha ser concluída.
NOTA: Estes parâmetros de partida são mais adequados para o congelador de mergulho Leica GP, outros parâmetros como a força de mancha estão disponíveis no FEI Vitrobot. No entanto, em nossa experiência, a integridade do cristal é mais provável de ser mantida pelo uso de um único braço de mancha. - Para poder selar a bandeja de cristalização assim que o poço de interesse for aberto, corte uma pequena tira de fita e dobre sobre uma extremidade para criar uma guia para facilitar a abertura do selo e coloque cuidadosamente para um lado.
- Abra o selo sobre o poço de cristalização, incluindo o reservatório. Trabalhando rapidamente, aplique 2-5 μL de solução de reservatório ao cristal contendo gota para manter o volume líquido na queda.
- Use a aba da fita para, em seguida, ressealar o poço e garantir que a queda de cristalização não seque.
- Enquanto momentaneamente segurando a fita sobre o poço de cristalização, transfira 10 μL da solução do reservatório para um tubo de 0,5 mL para usar para etapas posteriores.
- Reseal o poço.
- Coloque um pedaço de papel de mancha pré-cortado no braço de manchas do instrumento de congelamento do mergulho.
- Coloque uma única grade descarregada de brilho nos fórceps de congelamento do mergulho e carregue no instrumento de tal forma que o lado carbono se despegue do braço de manchas.
- Certifique-se de que a umidade relativa do ar dentro da câmara de manchas está em 90%.
- Gire as fórceps para que o lado do filme de carbono fique de frente para o braço manchador.
- Utilizando uma pipeta de 2,5 μL, aplique 2 μL de solução de reservatório do tubo de 0,5 mL para o lado não-suporte (cobre brilhante) da rede crioTEM.
- Gire a grade para que o lado de suporte de carbono esteja voltado para longe do braço de manchas e repita o processo, aplicando cuidadosamente o líquido ao lado de suporte de filme de carbono da rede. Evite tocar no filme de carbono com a ponta da pipeta para não danificar o filme de carbono. O líquido deve se espalhar pela rede devido à carga depositada durante a descarga de brilho.
- Inicie o processo de mancha enquanto observa a grade. Um escopo de visualização está disponível no Leica GP2 para este fim.
- Observe se o líquido é extraído da superfície de carbono da rede durante este tempo, isso começa com a maioria do bolus líquido na grade achatando-se à medida que o líquido é perverso através da grade. À medida que o líquido em cada quadrado de grade é reduzido ainda mais, uma onda de "estalar" através da superfície da grade pode ser observada. Se esse efeito for observado, a mancha pode ser interrompida dentro de 2-3 s do efeito estalando terminando. Não é necessário mergulhar na grade de teste que pode ser descartada.
- Se o chamado efeito "estalar" não for observado, repita as etapas 2.11-2.14, cada vez estendendo o tempo de mancha em 1-2 s até que o efeito de estalo seja observado pouco antes do braço de mancha se retrair da grade. Note desta vez para o passo 3.
NOTA: É importante que a mancha pare assim que esse efeito estalando tenha ocorrido para garantir que durante o processo, os cristais não fiquem desidratados devido à mancha excessiva. Utilize a solução de cristalização do reservatório para manchas e diluição da amostra, pois garante que os cristais estejam sujeitos a uma solução consistente, reduzindo o risco de desestabilização dos cristais.
3. Colhendo cristais
- Coloque a placa de cristalização sob o microscópio de luz e posicione bem o alvo dentro do campo de visão.
- Coloque uma grade fresca e com descarga de brilho nos fórceps do congelador de mergulho e monte as fórceps no congelador de mergulho, com o lado da película de carbono voltado para longe do braço de manchas.
- Gire as fórceps para que o lado do filme de carbono fique de frente para o braço manchador.
- Utilizando uma pipeta de 2,5 μL, aplique 2 μL de solução de reservatório do tubo de 0,5 mL para o lado não-suporte da rede crioTEM e gire a rede para que o lado de suporte de filme de carbono esteja voltado para a porta de amostra do congelador de mergulho.
- Retire o selo temporário e com a pipeta definida para 2 μL, aspire suavemente a gota de cristalização repetidamente para suspender os microcristais (é importante não introduzir bolhas de ar na queda).
NOTA: É fundamental observar este processo sob o microscópio de luz para garantir que os cristais sejam liberados de qualquer pele superficial ou da base do poço. Se os cristais estiverem presos e não forem desenhados com aspiração, a ponta da pipeta ou outras ferramentas de cristalização, como uma agulha de acupuntura, podem ser usadas para desalojar suavemente os cristais. Dependendo do tamanho dos cristais e da profundidade do campo do microscópio de luz, às vezes é possível visualizar, usando o microscópio, os cristais que entram na ponta da pipeta. - Transfira 2 μL do chorume microcristasta aspirado para o congelador de mergulho e aplique toda a amostra no lado carbono da rede crioTEM.
- Borrida para o tempo determinado na etapa 2 e imediatamente iniciar o congelamento de mergulho. Enquanto estiver borrando, observe a ocorrência de um efeito de onda estalando em toda a grade e note se isso ocorreu completamente através da grade. A presença de cristais pode afetar o tempo inicial de manchas, e isso pode precisar ser ajustado para grades subsequentes em 1-2 s.
- Trabalhando rapidamente, transfira a rede do etano líquido para a caixa de grade imersa em nitrogênio líquido. O etano residual pode se transformar em um sólido branco opaco na rede quando entra em nitrogênio líquido. Para reduzir isso, remova a rede constantemente do etano líquido e, em seguida, transfira rapidamente para o reservatório de nitrogênio líquido.
- Uma vez que 4 grades tenham sido colocadas na caixa de grade, fixe a tampa da caixa com o parafuso e transfira-a para uma de guerra de espuma de nitrogênio líquido para permitir uma avaliação adicional da amostra com um microscópio eletrônico de varredura (SEM) ou para um dewar de armazenamento de nitrogênio líquido usando um recipiente de armazenamento apropriado.
4. Avaliação da densidade amostral por microscopia leve
ATENÇÃO: Este método é destrutivo. Se houver disponibilidade limitada de amostra, como apenas uma ou duas gotículas de cristalização, recomenda-se que esta etapa seja ignorada. Após o mergulho, as amostras de congelamento (etapa 3.7) a distribuição de cristais através da rede pode ser avaliada.
- Monte uma grade crioTEM seca e de temperatura ambiente nas fórceps do congelador e coloque as fórceps de lado no microscópio de luz, com a grade no campo de visão. Defina uma ampliação e foco adequados para que toda a grade e quadrados de grade individuais possam ser resolvidos.
- Siga os passos 3.1-3.7.
- Em vez de transferir a grade para a caixa de grade (etapa 3.8), retraia a grade mergulhada do etano líquido, redefinindo o congelador de mergulho.
ATENÇÃO: A grade e a amostra aquecerão à temperatura ambiente e não poderão ser usadas para mais experimentos de difração. - Remova as fórceps do instrumento de congelamento do mergulho.
- Enquanto segura a grade dentro dos fórceps, coloque a grade sob o microscópio de luz - o foco já estará aproximadamente definido.
- Realize um bom foco e avalie a densidade dos cristais através da grade. Uma boa grade conterá vários cristais isolados longe das barras de grade dentro de cada quadrado de grade e a aglomeração de cristais é mínima.
- Onde a densidade de cristais dentro da rede resulta em agrupamento de cristais com apenas alguns cristais isolados, diluir ainda mais o chorume cristal com solução de reservatório e repetir o passo 3. Tome cuidado ao diluir amostras para que a diluição não resulte na dissolução dos cristais.
- Diluir os cristais em etapas usando pequenos volumes de 0,5-1 μL.
5. Avaliação amostral por microscopia eletrônica de varredura
NOTA: A preparação microcristasta nas grades criotem é melhor avaliada com uma microscopia eletrônica de varredura (SEM) em condições criogênicas, isso pode ser alcançado com um SEM equipado com um estágio criogênico. Na VMXm, são utilizados um JEOL JSM-IT100 SEM (fonte de tungstênio) com uma câmara de ar Quórum PP3006 e criocores. Para garantir danos mínimos à radiação ao visualizar amostras em VMXm28,29, são utilizadas as seguintes configurações: tensão acelerada de 5 kV; um tamanho spot de 40 (unidades arbitrárias no JEOL JSM-IT100); 10 mm de distância de trabalho. As imagens são gravadas usando o detector de elétrons secundário, para alinhamento amostral e focando um tempo de moradia de 0,8 μs é usado enquanto imagens de alta resolução de cristais únicos são capturadas usando um tempo de moradia de 16 μs. É importante antes de carregar uma amostra no SEM que o microscópio esteja alinhado de acordo com as instruções do fabricante. É aconselhável que apenas uma única grade seja carregada no SEM, enquanto todas as grades restantes preparadas com os mesmos parâmetros são reservadas para experimentos de difração de raios-X.
- Prepare o SEM resfriando a amostra crio-estágio para -180 °C de acordo com a instrução do fabricante. Siga as instruções para carregar as grades crioTEM no sistema específico disponível.
- Com a amostra carregada no SEM, ligue o feixe de elétrons, alinhe a amostra e coloque o foco usando uma alta ampliação (0,8 μs de tempo de moradia).
- Primeiro, realize a avaliação inicial com toda a grade em vista na baixa ampliação (x45). Grave uma imagem nesta ampliação.
- Aumente a ampliação para permitir uma inspeção mais minuciosa dos quadrados de grade individuais, cristais individuais devem ser muito claramente observáveis.
- Mova-se ao redor da grade, capturando imagens estádas (16 μs de tempo de moradia) de cristais garantindo que eles atendam aos seguintes requisitos antes de prosseguir:
- Certifique-se de que as grades são planas, e o filme de suporte de carbono está praticamente intacto.
- Certifique-se de que existem numerosos cristais individuais com um halo estreito de líquido vitrificado ao redor do cristal.
- Certifique-se de que os orifícios na filmagem de suporte a carbono sejam visíveis.
- Certifique-se de que não há grandes regiões de líquido vitrificado, conforme definido por uma aparência escura e suave.
- Certifique-se de que há pouco ou nenhum gelo hexagonal, ou gelo superficial espalhado pela rede.
- Certifique-se de que os cristais são distribuídos uniformemente através do filme de suporte e não estão sobrepostos.
- Neste ponto, meça com precisão as dimensões de um número de cristais para permitir uma correlação precisa do tamanho do feixe de raios-X durante experimentos de difração posteriores.
- Amostras que podem ser recuperadas de forma confiável do SEM e mantidas a temperaturas criogênicas podem ser posteriormente usadas para experimentos de difração de raios-X. Se isso não for possível, elimine essas amostras.
NOTA: Enquanto a imagem tanto da grade inteira quanto dos microcristais individuais (aproximadamente x45 e x700 ampliação, respectivamente), deve-se fazer uma avaliação sobre se deve prosseguir para a linha de feixe com grades preparadas usando os mesmos parâmetros ou se alguns parâmetros podem precisar ser ajustados durante a etapa 3. As grades devem atender aos testes descritos na etapa 5.5. Se as grades não atenderem a esses critérios, é necessária uma otimização adicional durante a etapa 3 antes de repetir a etapa 5.
6. Preparando grade para experimentos de difração na VMXm
- Esfrie o número necessário de suportes de amostras VMXm(Figura 4A) (até 5) carregados no cartucho de amostra (com tampa) com o carregador de amostra em uma grande dewar de espuma(Figura 4B) usando nitrogênio líquido - isso pode exigir um grande volume de nitrogênio líquido. O nível de nitrogênio líquido deve estar um pouco acima da posição amostral no carregador de amostras.
- Preparem circlips e ferramentas.
- Coloque ferramentas que incluem ferramentas de corte, fórceps e fórceps de amostra VMXm, em furos no carregador de amostras para esfriar. Pode ser útil organizar um holofote acima da de guerra.
- Transfira rapidamente a caixa de grade contendo as grades carregadas de microcristais para o recesso da caixa de grade no carregador de amostra e desaparafusar a tampa de tal forma que ela esteja solta e rotacionável (não remova).
- Sob nitrogênio líquido remova a tampa do cartucho da amostra com grandes fórceps e coloque-a sob o carregador de amostras.
- Use os fórceps de amostra VMXm para levantar o suporte de amostra no carregador de amostras, garantindo que o suporte esteja voltado para cima para que possa aceitar uma grade. Quando estiver na posição correta, um pequeno pino no carregador de amostras se envolverá com o pequeno orifício no meio do suporte da amostra.
- Com as fórceps finas resfriadas, levante cuidadosamente a grade da caixa da grade e transfira perto da abertura da grade no suporte da amostra. Gire a grade para que ela fique plana (não importa para que lado o lado do filme de suporte está voltado).
- Abaixe suavemente as fórceps para que a grade esteja o mais perto possível acima da abertura da grade (tenha cuidado para não dobrar a grade) e solte a grade na abertura. Se a grade não se acomodar corretamente, use cuidadosamente as fórceps finas para empurrar a grade para a posição ou tocar suavemente o suporte da amostra com as fórceps maiores.
- Coloque rapidamente a ferramenta de circlip pré-resfriada sobre a grade na abertura da grade e coloque o circlip pressionando o botão. Pode ser útil aplicar 2 depressões do botão para garantir que o circlip esteja devidamente sentado.
- Cubra o nitrogênio líquido para que o nível esteja ~1,5 cm acima do suporte da amostra. Usando as fórceps da amostra VMXm, levante cuidadosamente o suporte de amostra carregado para cima e sobre o pequeno pino no carregador de amostras e volte para o cartucho de amostra. Observe o número de posição do suporte da amostra no cartucho de amostra.
- Continue a carregar grades nos suportes de amostras até que todas as amostras sejam carregadas.
- Devolva as caixas de grade para a de guerra de armazenamento se as amostras permanecerem dentro e remover o carregador de amostras da dewar para criar mais espaço.
- Substitua a tampa do cartucho no cartucho, garantindo que o pino na parte superior do cartucho se engaje com o orifício na tampa.
- Esfrie e encha a câmara de ar VMXm com nitrogênio líquido e coloque ao lado da de guerra de espuma contendo o cartucho de amostra carregado.
- Usando a ferramenta do cartucho VMXm, engaje cuidadosamente a ferramenta nos cumes na lateral do cartucho e levante rapidamente o cartucho para a câmara de ar.
- Certifique-se de que o nível de nitrogênio líquido cubra o cartucho.
- Coloque a tampa na câmara de ar e prossiga para a estação final VMXm com o cartucho de amostra carregado.
NOTA: O carregamento do cartucho de amostra na estação final VMXm será realizado pela equipe de linha de vigas.
Resultados
O objetivo deste protocolo é alcançar microcristais vitrificados com um volume mínimo de líquido ao redor do cristal que permitem experimentos de difração de raios-X com dispersão de fundo mínima para melhorar o sinal de difração. Exemplo, imagens SEM de microcristais preparados em grades crioTEM para dispersão mínima de fundo são mostradas nas Figuras 1A,B e Figura 2. Grades com cristais únicos distribuídos uniformemente fornecerão o uso mais eficiente da grade, com bom sinal-a-ruído. No entanto, isso geralmente não é possível em toda a grade e algumas regiões podem apresentar alguma quantidade de aglomerados(Figura 2A,B). Apesar dessa aglomeração, esses exemplos ainda exibem um número útil de cristais isolados únicos que fornecerão difração de baixo fundo(Figura 5). O nível de mancha que ainda mantém dispersão de baixo fundo pode variar. Manchas fortes de tal forma que os orifícios na película de suporte de carbono são claramente visíveis, mas os cristais permanecem hidratados é o objetivo (Figura 2C,D). No entanto, as grades de boa qualidade ainda podem exibir algum líquido dentro dos orifícios da película de suporte, embora a posição dos orifícios ainda deve ser identificável(Figura 2A,B). É importante ressaltar que todos esses exemplos exibem cristais isolados e únicos com um halo vitrificado de líquido ao redor do cristal para manter a hidratação entre a mancha e o congelamento do mergulho.
Muitas amostras podem exigir maior otimização(Figura 3),que pode incluir variação do tempo de mancha ou concentração dos microcristais. Grades sobrecarregadas com cristais demonstrarão eficiência de manchas reduzidas e podem resultar em múltiplas treliças sendo registradas em imagens de difração única(Figura 3A,B). Condições de cristalização mais viscosas, como a da trippsina que contém 8% de PEG 4000 e 15% de glicol de etileno (Figura 3C),podem resultar na necessidade de tempos mais longos de manchas (>10 s). Por outro lado, condições de cristalização com viscosidade muito baixa que mancham muito rapidamente, podem sofrer de problemas de distribuição devido à gravidade causando o assentamento antes que ocorra a mancha, resultando em todos os microcristais se instalando ao longo de um lado da grade(Figura 3D).
A preparação ideal das amostras permite que todas as capacidades do VMXm sejam exploradas para coletar dados de difração de raios-X de alta qualidade na maior resolução possível com alto sinal-para-ruído(Figura 5). Essas amostras se beneficiam de serem compatíveis com o ambiente de amostra in-vacuo, resultando em contagem de fundo muito baixa ou zero em imagens de difração. O uso de etano líquido, sem crio-protetor, resulta na ausência de anéis de gelo(Figura 5),embora onde os cristais estejam próximos às barras de grade de cobre, o feixe de raios-X pode olhar as barras resultando em anéis de difração em pó de cobre a ~2,1 Å e ~1,8 Å.
Figura 1: Comparação da montagem microcristatal em montagens de micromesh e redes cyoTEM. Escaneando micrografias eletrônicas de mergulho microcristais congelados de vírus poliédrico medindo 2,5 μm de diâmetro(A, B) 5 kV acelerando tensão, um tamanho spot de 39 (unidades arbitrárias) e tempo de moradia de 16 μs. A grade é livre de excesso de líquido(A),observa-se um halo estreito de líquido ao redor dos cristais(B). As mesmas amostras montadas em uma micromesh (aberturas de 20 μm) antes do resfriamento em nitrogênio líquido e observadas utilizando o sistema de visualização no eixo na linha de luz I24 face-on(C) e lateral(D). As distorções ópticas (C) ao visualizar face-on dão uma indicação da extensão da espessura líquida através da micromesh, isso é mais claro ao visualizar o lado micromesh(D). O alvo vermelho em C e D representa a posição e tamanho do feixe de raios-X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de amostras de boa qualidade. Cristais de poliédra(A)observados através de um único quadrado de grade de ~100 μm. Enquanto alguns dos cristais são ligeiramente agrupados e mostram alguma conectividade do líquido circundante, há uma série de cristais isolados com um pequeno halo de líquido em torno do cristal. Cristais de insulina ligeiramente maiores(B)medindo ~5 x 5 μm também mostram alguns desajeitados, mas novamente há cristais individuais bem isolados. Cristais de agulha podem ter uma dimensão muito estreita e requerem um micróbio, como esses cristais de liseze em forma de agulha(C). Uma faixa estreita de líquido pode ser vista ao redor desses cristais (halo cinza claro). Microcristais maiores até dezenas de mícrons também podem ser bem montados em grades crioTEM, como estes cristais K proteinase de ~7 μm(D). Em ambos(C) e (D) e em menor grau em (A), os orifícios da película de suporte de carbono são claramente visíveis, demonstrando a presença de muito pouco/nenhum líquido. No exemplo B, embora não sejam observados orifícios vazios, a posição dos orifícios ainda pode ser identificada, indicando que o líquido está apenas preenchendo os orifícios na película de suporte. Em todos esses exemplos, um halo de líquido pode ser visto ao redor da borda do quadrado da grade (um quadrado interno arredondado), onde os buracos têm uma aparência cinza mais clara. Esta é uma característica comum de grades bem preparadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de amostras que requerem maior otimização. Grades sobrecarregadas com microcristais(A, B) podem aumentar a dispersão de fundo à medida que as amostras bloqueiam os buracos na película de suporte reduzindo a eficiência da mancha, e com uma maior tensão superficial entre os cristais permanece mais líquido. Além de uma degradação no sinal-ruído resultando em perda de informações, é provável que várias treliças sejam registradas. Usando um tempo de mancha que não é suficiente, ou uma solução de cristalização altamente viscosa pode resultar em uma amostra excessivamente úmida(C),também produzindo baixo sinal-para-ruído. Condições de cristalização sem precipitantes, como as da insulina bovina(D),têm uma viscosidade muito baixa. Embora isso resulte em um tempo muito curto de manchas, também pode resultar no movimento de cristais através da grade antes e durante a mancha devido aos efeitos da gravidade. Isso geralmente resulta em uma grade em grande parte vazia com uma alta concentração de cristais ao longo de uma borda(D). Pode ser vantajoso adicionar um agente viscoso como o etileno glicol ao chorume cristalino pouco antes de aplicá-los na rede para reduzir o fluxo de cristais e melhorar a distribuição dos cristais. Isso também pode prolongar o tempo de mancha, facilitando a observação da mancha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ferramentas para carregamento de amostras em VMXm. Um conjunto de ferramentas sob medida foi projetado para carregar os porta-amostras VMXm(A). O carregador de amostras (B) tem espaço para um único suporte de amostra VMXm, caixa de grade e armazenamento de ferramentas durante o trabalho. Ele também foi projetado para permitir o trabalho logo abaixo da superfície do nitrogênio líquido e permitir que o cartucho de amostra se encaixe abaixo (B). A câmara de ar de guerra(C),que se encaixa na caixa de gás nitrogênio da câmara de ar na estação final VMXm, é usada para levar o cartucho de amostra carregado do laboratório para a cabana experimental de linha de feixe. Para visualizar amostras no SEM offline, foi feita uma nave sob medida(D)composta pelo suporte de amostra VMXm sem base para permitir a avaliação no suporte de amostra que é usado na linha de feixe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Difração de exemplo de microcristais no VMXm. Uma única imagem de difração registrada usando um detector Pilatus 3 6M no VMXm de um cristal poliédrico do vírus ~3 μm montado em uma grade criotem usando o método de congelamento de mergulho. A difração é observada para além de 1,7 Å e um reflexo (quadrado azul) a 1,74 Å é inset, demonstrando a baixa dispersão de fundo, com um alto número de pixels com zero contagem. O etileno glicol a uma concentração final de 50% v/v foi adicionado ao chorume cristalino antes de aplicá-lo na grade. A baixa natureza de fundo da posição da amostra VMXm é demonstrada pelo fundo constante através da imagem, como mostrado por intensidades traçadas sob a linha azul tracejada, mesmo perto do centro do feixe. As intensidades traçadas mostram que o fundo permanece abaixo de 3 contagens. Dois anéis fracos são observados a 2,15 Å e 1,86 Å que são gerados pela difração em pó do cobre da grade crioTEM. Não há anéis de gelo detectáveis, demonstrando a eficácia da mancha seguida de resfriamento com etano líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Este protocolo demonstra como ferramentas da preparação da amostra crioTEM podem ser usadas para a preparação de microcristais para experimentos de difração de raios-X em linhas de feixes de microfocus. A instrumentação padrão da linha de feixe é centrada em torno de uma amostra montada em pinos e, embora tenham sido feitos esforços para fornecer um suporte amostral nessas montagens para microcristais, eles são muitas vezes desafiadores para carregar com a amostra, garantindo que o maior sinal-para-ruído seja alcançado(Figura 1C,D). Muitas dessas amostras também podem exigir a otimização das condições de proteção criobito para garantir que a amostra seja vítrea. O método de congelamento de mergulho fornece uma maneira repetível para remover o excesso de líquido e resfriar a amostra em um criogen eficiente(Figura 1A,B). Embora a grade possa ser montada em uma linha de feixe padrão com um suporte de pino à base de pinça, os porta-amostras VMXm foram projetados especificamente para aceitar grades e mantê-las abaixo da temperatura de transição de vidro em um ambiente de vácuo através de resfriamento condutivo. O ambiente amostral do VMXm permite a baixa coleta de dados de fundo, onde a amostra é a fonte restante de fundo, e fornece um micróbio que pode ser usado para combinar cristais com dimensões inferiores a 10 μm. Este método de preparação de amostras também pode ser usado para preparar nanocristais para difração eletrônica onde também há um requisito para muito pouco excesso de líquido e uma amostra vítrea devido à fraca penetração de elétrons. Embora as grades crioTEM sejam frágeis, aquelas experimentadas na colheita de cristais em loops se adaptarão rapidamente ao manuseio das grades. Com uma pequena quantidade de experiência, poucas grades serão perdidas durante as etapas de desarmamento, congelamento e carregamento do protocolo. As etapas de otimização são, no entanto, críticas para este sucesso e uma preparação cuidadosa reduzirá as chances de perder cristais ou reduzir a integridade do cristal.
As grades CrioTEM fornecem um suporte único relativamente grande que pode conter muitas centenas de cristais, melhorando assim o throughput onde só pode ser possível registrar uma pequena cunha de dados de difração. Uma única grade também pode fornecer cristais suficientes para determinar a estrutura proteica, particularmente em cristais de alta simetria. Quando apenas uma ou duas gotas de cristalização únicas geraram microcristais, a mancha experimental da condição de cristalização por si só pode ajudar a garantir que quando os microcristais são apagados, os tempos utilizados são os mais próximos possíveis dos necessários para gerar amostras iniciais de boa qualidade. Os suportes de filme de carbono são invisíveis aos raios-X e estão disponíveis com espaçamento diferente de orifício, que pode ser usado para se adequar a uma morfologia particular. Nós mais comumente utilizamos filmes de suporte com furos de 2 μm em um espaçamento de 2 μm, mas buracos menores com maior espaçamento podem ser mais apropriados para cristais menores que 2 μm. Outros filmes de suporte, como aqueles com furos de 1 μm com um espaçamento de 4 μm, bem como filmes de suporte com diferentes orifícios em forma estão disponíveis, todos os quais afetarão o tempo de mancha. Uma grade quadrada de malha de 200 (200 quadrados por polegada) também fornece espaço suficiente (~100 μm) entre as barras de grade de cobre para que o feixe de raios-X não interaja fortemente com o cobre, fornecendo suporte estrutural suficiente para o filme de carbono carregado com cristais. O uso de etano líquido nega a necessidade de crioprotetores, o que, por sua vez, reduz a exigência do volume amostral que teria sido utilizado na otimização das condições crioprotetores.
Os principais parâmetros a serem otimizados durante o processo são os tempos de mancha e a diluição amostral. Os tempos de mancha devem ser longos o suficiente para observar o efeito "estalando" em toda a grade antes de mergulhar em congelamento. Sobre a mancha pode resultar na desidratação dos cristais, no entanto, o controle da umidade dentro da câmara amostral é usado para minimizar esse efeito. Embora seja sugerido que uma umidade relativa de 90% utilizada, algumas amostras podem se beneficiar na otimização da umidade. A umidade pode afetar a eficiência do papel de mancha que pode lentamente ficar saturado com água. Além disso, o controle da umidade dentro da câmara amostral poderia ser usado para melhorar a qualidade da difração dos cristais30. Recomenda-se que pequenas alterações (<5%) na umidade sejam feitas antes de verificar a integridade da difração para garantir que a qualidade da difração não seja degradada.
A otimização de amostras não preciosas pode ser realizada usando um microscópio leve no lugar de um SEM. Embora destrutivo, é útil para avaliar a densidade de cristais em toda a rede e permitir a tomada de decisões sobre se uma amostra deve ser diluída ou concentrada para melhor dispersar cristais através da rede. Esta etapa é mais útil quando há um grande número de cristais disponíveis e particularmente amostras altamente concentradas. A aglomeração de cristais deve ser evitada(Figura 3),pois embora não seja um problema significativo se dois cristais forem iluminados ao mesmo tempo durante a coleta de dados6, provavelmente haverá um volume maior de líquido ao redor da moita, reduzindo assim o sinal-ruído(Figura 5). Embora seja possível observar grandes excessos de líquido globalmente em toda a rede usando um microscópio leve, a avaliação do volume de líquido ao redor dos microcristais e a presença de gelo cristalino só podem ser feitas usando um microscópio eletrônico equipado com um sistema de transferência de vácuo criogênico e estágio. Às vezes, após a aplicação dos cristais na grade e antes da mancha ocorrer, cristais em soluções de baixa viscosidade podem se estabelecer ao longo de uma borda da grade. Descobrimos que somar uma concentração final de 50% de etileno glicol pode retardar o movimento dos cristais através da gotícula, garantindo uma melhor distribuição de microcristais em toda a rede, bem como proporcionando maior controle sobre a mancha, aumentando o tempo de mancha(Figura 3D).
Algumas soluções de cristalização contendo agentes precipitantes viscosos, como PEGs de alto peso molecular, podem ser desafiadoras para a mancha, exigindo tempos cada vez mais longos de manchas (>10 s). Nesses casos, pode ser útil reduzir o volume de líquido depositado na parte de trás da grade, bem como o volume do cristal contendo solução para o lado de filme de suporte da grade. Estratégias como o uso de 2 camadas de papel manchador ou fibras de vidro também podem ajudar a manchar nesses casos difíceis31.
Embora este pipeline seja adequado para cristais de proteína solúveis, aqueles que se formam em meios muito viscosos, como proteínas de membrana em LCP, apresentam um desafio diferente para o qual este protocolo não é adequado. No entanto, estão surgindo estratégias para a preparação de cristais LCP em grades crioTEM para microED, que incluem a redução da viscosidade das amostras, induzindo uma mudança de fase ao LCP. Isso permite que as amostras sejam aplicadas às grades de forma semelhante à descrita neste artigo. Por fim, a amostra pode ser moída com um feixe de íons focalado para remover o excesso de material não cristalino32,33,34.
No geral, este gasoduto geralmente levará de 1 a 2 h (incluindo o tempo de instalação do equipamento) para seguir da amostra que chega à VMXm para fornecer grades otimizadas com amostras bem dispersas e vitrificadas, dependendo da disponibilidade da amostra, da concentração de cristais e da viscosidade da solução de cristalização. Esses métodos já foram empregados com sucesso para a preparação de microcristais para experimentos de difração de raios-X explorando danos de radiação em microcristais onde um volume mínimo de líquido em torno da amostra foi essencial28,35. Deve-se notar que o protocolo pode ser aplicado a todas as amostras de microcristais solúveis, não apenas para difração bem difundida amostras que já foram otimizadas. Um experimento de cristalização que produz material microcristalino seria tradicionalmente um alvo de otimização com o objetivo de obter cristais maiores, no entanto, este método de preparação de amostras e as capacidades do VMXm podem permitir que dados adequados sejam coletados dessas amostras sem maiores otimizações. Alternativamente, se tais amostras de microcristalino difundir mal, os dados coletados do VMXm usando este método de preparação de amostra ainda poderiam atuar como um guia útil para uma otimização adicional das condições de cristalização. As ferramentas para preparar grades, incluindo descarga de brilho e congelamento de mergulho, estão agora amplamente disponíveis em institutos de pesquisa equipados para experimentos criotem e estarão disponíveis para muitos usuários, permitindo que eles preparem amostras com antecedência do tempo de feixe na VMXm.
Divulgações
Não há conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton e Dave Stuart, STRUBI University of Oxford e Rachel Bolton, Universidade de Southampton por gentilmente fornecer amostras de microcristais para o desenvolvimento e demonstração de métodos de preparação de amostras para a linha de feixe VMXm, além de permitir o comissionamento da linha de trave. Os autores também gostariam de agradecer ao iNEXT-Discovery (número do projeto 871037) pela oportunidade e apoio na publicação deste manuscrito.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumento automatizado de congelamento de imersão Cryo-EM | Leica ou ThermoFisher | Vários | |
| microscópios de luz de bancada com fonte de luz | Várias | ||
| lâminas/bisturis | Fisher Scientific | Várias | |
| grades de malha de cobre 200 CryoTEM com filme de suporte de carbono com 2 e micro; m furos | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
| Caixas de armazenamento de grade CryoTEM | Agar Scientific | AGG3727 | |
| ddH2O | n / a | n / a | |
| Fornecimento de gás etano | n / a | n / a | |
| Etilenoglicol | Acros Organics | 146750010 | |
| lâminas de microscópio de vidro | FisherMarca | 12383118 | |
| Placa de Petri de vidro | FisherBrand | 455732 | |
| Dispositivo de descarga de brilho | Pelco | 91000S | |
| Filme de embalagem de laboratório (Parafilme) | Bemis | HS234526B | |
| Grande e pequeno, pinça fina | Agar Científico | Vários | |
| Fornecimento de nitrogênio líquido | n/a | n/a | |
| Pontas de pipeta | Vários | Vários | |
| dispositivos de pipetagem | Vários | Vários Vários | |
| Fita de vedação para placas de cristalização. | Dimensões moleculares | MD6-01 | |
| Dewars de nitrogênio líquido pequeno/médio | Spearlab | Várias | |
| ferramentas de recorte de anel de retenção com molas | Subangstrom | SCT08 | |
| Whatmann No.1 papel de filtro pré-cortado | Leica | 16706440 |
Referências
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Reimpressões e permissões
