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Artigo de método

Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata

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DOI:

10.3791/62319

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25 de fevereiro de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences, Curtin University, 5Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Neste artigo

Resumo

Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.

Resumo

Glicosaminoglicanos sulfatos (GAGs) como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) são onipresentes em organismos vivos e desempenham um papel crítico em uma variedade de estruturas e processos biológicos básicos. Como polímeros, os GAGs existem como uma mistura de polidisperse contendo cadeias de polissacarídeos que podem variar de 4000 Da a bem mais de 40.000 Da. Dentro dessas cadeias existem domínios de sulfatação, conferindo um padrão de carga negativa que facilita a interação com resíduos carregados positivamente de ligantes proteicos cognatos. Os domínios sul-americanos dos GAGs devem ter comprimento suficiente para permitir essas interações eletrostáticas. Para entender a função dos GAGs em tecidos biológicos, o pesquisador deve ser capaz de isolar, purificar e medir o tamanho dos GAGs. Este relatório descreve uma técnica prática e versátil baseada em gel de poliacrilamida baseada em eletroforese que pode ser aproveitada para resolver diferenças relativamente pequenas de tamanho entre GAGs isolados de uma variedade de tipos de tecidos biológicos.

Introdução

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma família diversificada de polissacarídeos lineares que são um elemento onipresente em organismos vivos e contribuem para muitos processos fisiológicos básicos1. GaGs como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) podem ser sulfatados em posições distintas ao longo da cadeia de polissacarídeos, transmitindo domínios geográficos de carga negativa. Esses GAGs, quando amarrados a proteínas da superfície celular conhecidas como proteoglycans, projetam-se no espaço extracelular e se ligam a ligantes cognatos, permitindo a regulação tanto dos processos de sinalização cis- (ligantes ligados à mesma célula) quanto trans( ligantes ligados à célula vizinha) processos de sinalização2. Além disso, os GAGs também desempenham papéis críticos como elementos estruturais em tecidos como a membrana glomerular do porão3,o glicocalyx endotelial vascular4 e a glicocalyx epitelialpulmonar 5, e em tecidos conjuntivos tais cartilagem6.

O comprimento das cadeias de polissacarídeos GAG varia substancialmente de acordo com seu contexto biológico e pode ser dinamicamente alongado, cortado e modificado por um sistema regulatório enzimático altamente complexo7. É importante ressaltar que o comprimento das cadeias de polímeros GAG contribui substancialmente para sua afinidade vinculante com ligantes e, posteriormente, para sua função biológica8,9. Por essa razão, a determinação da função de um GAG endógeno requer a valorização de seu tamanho. Infelizmente, ao contrário de proteínas e ácidos nucleicos, existem muito poucas técnicas prontamente disponíveis para detectar e medir GAGs, o que historicamente resultou em uma investigação relativamente limitada sobre os papéis biológicos desta diversificada família polissacarídeo.

Este artigo descreve como isolar e purificar GAGs da maioria dos tecidos biológicos, e, também, descreve como usar a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) para avaliar o comprimento dos polímeros isolados com um grau justo de especificidade. Em contraste com outras abordagens glicomicicas altamente complexas (e muitas vezes baseadas em espectrometria de massa), este método pode ser empregado usando equipamentos e técnicas de laboratório padrão. Essa abordagem prática pode, portanto, expandir a capacidade dos investigadores de determinar o papel biológico dos GAGs nativos e sua interação com ligantes contextualmente importantes.

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Protocolo

Todas as amostras biológicas analisadas neste protocolo foram obtidas a partir de camundongos, sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado.

1. Isolamento de sulfato heparano

  1. Delipidação de amostras de tecido
    NOTA: A delipidação é um passo opcional para tecidos ricos em gordura.
    1. Faça uma mistura de 1:1 de metanol e diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por amostra; pedaços maiores de tecido podem exigir até 1 mL.
    2. Coloque cada amostra de tecido em um pequeno recipiente de vidro com uma tampa para delipidação.
      NOTA: A massa amostral pode variar de acordo com o tecido de interesse e necessidades experimentais. 50 mg ou menos é normalmente suficiente para o rendimento adequado do GAG, mas alguma otimização pode ser necessária pelo usuário final.
    3. Adicione 500 μL da solução de metanol:diclorometano a cada recipiente de vidro e misture. Certifique-se de que todas as amostras de tecido sólido estão completamente submersas em solvente.
      NOTA: Use pipetas sorológicas ou tubos cônicos plásticos para misturar e manusear a solução de metanol/diclorometano; outros plásticos podem dissolver.
    4. Coloque amostras em um agitador (em rack seguro) em um capô de fumaça química e agitar suavemente por 1h.
    5. Agitar as amostras para misturar e centrífugas a 17.000 x g por 5 min a 4 °C.
    6. Pipeta cuidadosamente a fração de solvente orgânico (supernasteante). Esta é a fração lipídica - não contém GAGs e pode ser descartada.
      NOTA: Tente não perturbar o tecido, pois pequenos pedaços podem ser perdidos. É preferível deixar parte da camada orgânica no recipiente de amostra, em vez de arriscar a perda da amostra.
    7. Deixe a tampa do recipiente de vidro aberta e deixe-a evaporar durante a noite no capô. Troque o tubo para o próximo passo, pois esses tubos não sobreviverão a mais processamento.
    8. Uma vez que a mistura de solventes tenha evaporado completamente, proceda à desintegração mecânica (se a amostra residual for >50 mg) ou digestão Actinase E (< 50 mgs).
  2. Desintegração mecânica do tecido sólido (opcional; para amostras de tecido maior)
    NOTA: A maioria dos pedaços menores de tecido sólido (aproximadamente 50 mg ou menos) deve dissolver-se completamente durante a etapa de digestão. No entanto, amostras maiores exigirão desintegração mecânica.
    1. Amostras de interesse congelantes piscando colocando-as em um tubo de polipropileno de tamanho apropriado e colocando o tubo fechado em nitrogênio líquido. Deixe a amostra congelar até ficar completamente sólida.
    2. Usando uma argamassa limpa e pilão, triture amostras congeladas em uma consistência em pó.
    3. Prossiga diretamente para digestão Actinase E (Passo 1.4).
  3. Desalting e concentração de amostras
    NOTA: Este é um passo opcional e apenas necessário para amostras de tecido líquido diluído (por exemplo, bronco-alveolar fluido de lavage (BALF) ou plasma).
    1. Biolou amostras líquidas em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental)
    2. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um corte de peso molecular (MWCO) de 3.000 Da.
    3. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
    4. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
    5. Inverta o filtro e gire por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e apropriadamente rotulados. Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
  4. Digestão Actinase E
    NOTA: Esta etapa é necessária para digerir e, finalmente, remover contaminantes proteicos da sua amostra.
    1. Misture amostras 1:1 com Actinase E recombinante para uma concentração desejada de 10 mg/mL. Adicione o volume apropriado do concentrado tampão de digestão de 10x. Concentração final desejada: acetato de cálcio de 0,005 M e acetato de sódio de 0,01 M, pH 7,5. Por exemplo: 190 μL de amostra líquida, 190 μL de 20 mg/mL Actinase E, 20 μL de acetato de cálcio de 0,05 M, acetato de sódio de 0,1 M.
    2. Agitar amostras suavemente para misturar, em seguida, digerir por 48-72 h a 55 °C (até 7 dias para tecido inteiro).
    3. Aqueça a 80 °C por 15-20 min para aquecer a ativação Actinase E.
    4. Congele a amostra a -80 °C ou continue a passo 1,5.
  5. Desalting e concentração de amostras
    NOTA: Se uma baixa massa de interesse da GAG for antecipada na amostra biológica, ou se a conservação de reagentes consumíveis (ou seja, colunas de filtro centrífugo) é desejável, as amostras podem ser agrupadas para produzir um único concentrado por grupo experimental (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental).
    1. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
    2. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário, se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
    3. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
    4. Inadvertida filtro e giro por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e apropriadamente rotulados (geralmente incluídos com as colunas do filtro centrífuga). Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
  6. Dessecação
    1. Coloque as amostras dissolvidas da etapa 1.5.5 em um concentrador de vácuo rotacional durante a noite ou liofilize as amostras conforme detalhado abaixo.
    2. Congele as amostras completamente durante a noite em -80 °C ou mergulhando em nitrogênio líquido.
    3. Pierce amostra tampas com uma agulha de 18 G e coloque na câmara de lyophilizer. Adicione toalhas de papel para embalar conforme necessário.
    4. Fixar câmara de liofilizador para liofilizador e congelar durante a noite (pelo menos -40 °C, 0,135 Torr)
  7. Coluna de troca de cation
    1. Amostras dessecadas de ressuspend em até 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2% (ou, se agrupando amostras, resuspend a um máximo de (400/n) μL, onde n = o número de amostras na piscina desejada. Use o mínimo possível da solução de detergente.
    2. Equilibre a coluna de troca de cation (IEX) com 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2%. Gire por 5 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
    3. Carregar 400 μL de amostras/amostras agrupadas na coluna IEX. Gire por 5 min a 2.000 x g.
    4. Lave 3x com 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2%. Gire por 5 min a 2.000 x g todas as vezes.
    5. Elute 3x com 400 μL de 0,2 M NaCl. Gire por 5 min a 2.000 x g cada. Esta é a fração de baixa afinidade - esta pode ser retida para fins de controle de qualidade, se desejar.
    6. Elute 3x com 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Gire por 5 min a 2.000 x g cada. Esta fração conterá os glicosaminoglicanos isolados de interesse - guarde tudo!
    7. Para desalar cada fração elucidada, adicione metanol até 80 vol% e incubar a 4 °C durante a noite. Gire cada amostra por 5 min a 2.000 x g. Recupere o resíduo sólido, pois este é glicosaminogligliglicano seco.
      NOTA: Alternativamente, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.8 para desaderar o elunato sem metanol.
  8. Desalting e concentração de amostras
    1. Se necessário, o pool eluia frações (de 1,7.6) em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por réplica biológica ou grupo experimental).
    2. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
    3. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário, se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
    4. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através. Prossiga diretamente para a etapa 1.9.
  9. Digestão de condroitina
    NOTA: O objetivo desta etapa é remover GAGs não de interesse do usuário final. Neste caso, a condroitina é usada para remover a condroitina. Nos tecidos utilizados para a geração de Resultados Representativos (fluido de lavage bronco-alveolar e pulmão inteiro), a digestão do sulfato de condroitina deixa o sulfato heparan como a GAG residual primária. Os usuários finais podem precisar adicionar etapas adicionais de digestão, dependendo de seus objetivos experimentais.
    1. Carregar 350 μL de tampão de digestão (acetato de amônio de 50 mM com cloreto de cálcio de 2 mM ajustado ao pH 7.0) à coluna do filtro centrífuga sem tocar na membrana.
    2. Adicione 5 μL de condroitinase recombinante ABC.
    3. Coloque o tubo de amostras em um forno de 37 °C e incubar por 1h.
    4. Vire a coluna e coloque em tubos de coleta devidamente rotulados. Gire por 1 min a 2000 x g.
    5. Amostras de calor a 80 °C por 15-20 min para inativar condroitinase ABC.
  10. Desalting e concentração de amostras
    1. Se necessário, a condroitina da piscina digeriu amostras da etapa 1.9.5 em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental)
    2. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
    3. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
    4. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
    5. Inadvertidamente filtro e gire por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e devidamente rotulados. Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
  11. Dessecação
    NOTA: Nesta etapa, é necessário dessecação para que as amostras possam ser resuspendidas na menor quantidade possível de água e tampão de corrente.
    1. Coloque as amostras digeridas da condroitina a partir da etapa 1.10.5 diretamente em um concentrador de vácuo rotacional durante a noite ou liofilize da seguinte forma:
    2. Congele as amostras completamente durante a noite em -80 °C ou mergulhando em nitrogênio líquido.
    3. Pierce amostra tampas com uma agulha de 18 G e coloque na câmara de lyophilizer. Adicione toalhas de papel para embalar conforme necessário.
    4. Fixar câmara de liofilizador para liofilizador e congelar seco durante a noite (pelo menos 40 °C, 0,135 Torr)

2. Eletroforese de gel de poliacrilamida de glicosaminoglycanos isolados e purificados

  1. Prepare as soluções necessárias para a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) com antecedência(Tabela 1).
    NOTA: Selecione a acrilamida por cento da solução de gel de resolução, dependendo do tamanho dos glicosaminoglicanos esperados para estar na amostra. Recomenda-se 15% para a resolução de fragmentos maiores (maiores que 30 subunidades descaramento em comprimento); 22% para fragmentos menores (<20 subunidades descaramento em comprimento).
  2. Coloque o vazio no tanque PAGE. Molde o gel de resolução da seguinte forma: Em tubo de 15 mL, misture 10 mL de solução de gel de resolução, 60 μL de 10% de persulfeto de amônio (deve ser preparado recentemente) e 10 μL de TEMED (adicionar TEMED por último). Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use a pipeta para adicionar rapidamente a solução acima de 10 mL ao. Sobreposição com 2 mL de água desionizada e filtrada e permitir que o gel de resolução polimerize por 30 minutos.
    NOTA: O protocolo PAGE a seguir foi otimizado para um sistema PAGE vertical usando de fundição de 13,3 x 8,7cm (largura x comprimento) de 1,0 mm de espessura com um volume total de aproximadamente 12mL. Outros sistemas de podem ser usados, mas podem exigir otimização pelo usuário final.
  3. Após o gel de resolução ter polimerizado totalmente, descarte a água sobreposta e lance o gel de empilhamento da seguinte forma: em um tubo de 15 mL, misture 3 mL da solução de gel de empilhamento, 90 μL de persulfito de amônio de 10% (deve ser preparado recentemente), 3 μL de TEMED (adicionar por último TEMED).
  4. Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use uma pipeta para adicionar rapidamente a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução solidificado; preencher para borda. Insira totalmente o pente incluído com a configuração. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por 30 minutos.
  5. Uma vez que o gel tenha polimerizado, certifique-se de que a tira de fita seja removida da parte inferior do e coloque o de volta no conjunto do tanque PAGE.
  6. Encha as câmaras superior e inferior com tampão de câmara superior e inferior, respectivamente.
  7. Dissolva as amostras secas da etapa 1.11.4 no volume mínimo necessário de água desionizada e filtrada (no máximo, 50% do volume dos poços no gel PAGE). Misture 1:1 com o tampão de carga da amostra. Carregue as amostras e as "escadas" de oligossacarídeo hs (ver Tabela 1) no gel.
  8. Pré-executar o gel por 5 min a 100 V. Em seguida, execute o gel a 200 V por 20-25 min (para um gel de resolução de poliacrilamida de 15%) ), 40-50 min (para um gel de resolução de poliacrilamida de 18%)
    NOTA: Alguma otimização do tempo de execução de 200 V pode ser necessária. O vermelho fenol migra à frente de oligossacarídeos de heparina que são 2 subunidades de polímeros em comprimento (ou seja, grau de polimerização 2, ou dp2); o azul bromofenol migra antes do dp10-dp14. Os melhores resultados são obtidos quando a tensão é aplicada de tal forma que a faixa vermelha fenol migra quase, mas não completamente, para o fundo do gel. Ajuste o tempo de execução de acordo.

3. Protocolo de coloração de prata

  1. Prepare todas as soluções necessárias para a coloração de prata com antecedência(Tabela 2).
    NOTA: Não toque diretamente no gel PAGE até que ele tenha sido manchado, desenvolvido e colocado em solução stop. Em vez disso, manipule o gel usando ferramentas de plástico ou vidro limpas. O manuseio direto do gel resultará em distorções de impressão digital e outros artefatos visíveis no gel após a coloração.
  2. Uma vez concluída a execução, desmonte o e o extrato de gel em um recipiente limpo, médio-grande, cheio de água desionizada e filtrada.
    NOTA: Para evitar manusear diretamente o gel, use a ponta da pipeta ou outro objeto plástico para retirar suavemente o gel da fita enquanto estiver submerso na água. O gel pode ser frágil - manuseie com cuidado.
    1. Descarte a água. Manche o gel na solução de coloração azul alciano por 5 min.
    2. Descarte a mancha azul alciana. Enxágüe/lave rapidamente 2-3x com água filtrada desionizada até que a maior parte da solução de coloração azul alciano tenha sido removida.
    3. Deixe des colorigar em água desionizada e filtrada durante a noite no roqueiro. Certifique-se de que há um grande volume de água filtrada e desionizada para garantir que qualquer mancha residual seja totalmente lavada do gel durante a noite.
    4. Lave gel em 50% de metanol (40 min total, mude a solução 2-3x).
    5. Lave gel em água desionizada e filtrada por 30 minutos. Descarte a água e repita mais 3 vezes para um total de 2h, substituindo a água cada vez.
    6. Em um recipiente fresco e limpo, manche o gel por 30 min em solução de coloração de nitrato de prata.
    7. Enxágüe/lave rapidamente 2-3x em água filtrada desionizada para remover totalmente a solução de coloração de prata.
    8. Lave por 30 minutos em água desionizada e filtrada. Descarte a água e repita 2x por um total de 90 minutos, substituindo o banho de água cada vez.
    9. Descarte a água e adicione a solução de desenvolvimento.
    10. Uma vez adicionada a solução em desenvolvimento, observe cuidadosamente o gel e observe o aparecimento de bandas. Dependendo da qualidade da mancha e da massa da amostra carregada, o desenvolvimento pode levar de alguns segundos a vários minutos.
    11. Assim que as bandas desejadas estiverem visíveis, descarte imediatamente a solução de desenvolvimento e lave brevemente com a solução stop.
    12. Descarte a solução stop lavar e substitua por uma solução de parada fresca. Deixe de molho por 1h em um roqueiro ou agitador.
    13. Lave em água desionizada e filtrada durante a noite (no entanto, o gel pode ser imageado imediatamente após a lavagem da solução stop).

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Resultados

O azul alciano é usado para manchar GAGs sulfatos 10; este sinal é amplificado pelo uso de uma mancha de prata subsequente 11. A Figura 1 fornece uma demonstração visual do processo de desenvolvimento de manchas de prata. Como demonstrado, o sinal azul alciano representando GAGs separados por eletroforese é amplificado à medida que o agente em desenvolvimento penetra o gel de poliacrilamida. Normalmente, o processo de desenvolvimento reduzirá o...

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Discussão

Os GAGs desempenham um papel central em muitos processos biológicos diversos. Uma das principais funções dos GAGs sulfatados (como HS e CS) é interagir e ligar-se aos ligantes, o que pode alterar as funções de sinalização a jusante. Um importante determinante da afinidade de ligação gag com ligantes cognatos é o comprimento da cadeia de polímeros GAG 8,9,14. Por essa razão, é importante que os pesquisadores possam definir com pr...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL e EPS)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Accuspin Micro17 microcentrífuga de bancadathermoFisher Scientific13-100-675Qualquer combinação de microcentrífuga de bancada/rotor capaz de 14000 xG é apropriada
Acrilamida (sólida)thermoFisher ScientificBP170-100Grau de eletroforese
Actinase ESigma AldrichP5147Mistura de protease de S. griseus
Alcian Blue 8GX (sólido)thermoFisher ScientificAC400460100
Acetato de amônio (sólido)thermoFisher ScientificA639-500Grau de biologia molecular
Hidróxido de amônio (líquido)thermoFisher ScientificA669S-500certificado ACS
Persulfato de amônio (sólido)thermoFisher ScientificBP179-25grau de eletroforese
Barnstead GenPure Pro Water Sistema de PurificaçãoThermoFisher Scientific10-451-217PKGQualquer sistema de deionização/ purificação de água é um substituto aceitável
Ácido bórico (sólido)termoFisher ScientificA73-500Grau de biologia molecular
Azul de bromfenol (sólido)termoFisher ScientificB392-5
Acetato de cálcio (sólido)ThermoFisher Scientific18-609-432Cloreto
cálcio (sólido)ThermoFisher ScientificAC349610250Detergente CHAPS de grau de biologia molecular
(3-((3-cholamidopropyl) dimetilamônio)-1-propanossulfonato)ThermoFisher Scientific28299
Condroitinase ABCSigma AldrichC3667
vazio Criterion para PAGE (1,0 mm de espessura, 12+2 poços)Bio-Rad3459901Qualquer sistema de de fundição PAGE de 1,0 mm de espessura será suficiente
Critério PAGE Sistema celular (célula e fonte de alimentação)Bio-Rad1656019qualquer sistema PAGE de gel vertical comparável funcionará)
Diclorometano (líquido)thermoFisher ScientificAC610931000certificado ACS
EDTA sal dissódico (sólido)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular grau de biologia
Ácido acético glacial (líquido)thermoFisher ScientificA35-500Certificado ACS
Glicina (sólido)thermoFisher ScientificG48-500Eletroforese
grau Heparanase I / IIISigma AldrichH3917De Flavobacterium heparinum
Decasacchaídeo derivado de heparina (dp10)galen scientificHO10
Hexassacarídeo derivado da heparina (dp6)Galen scientificHO06
Oligossacarídeo derivado da heparina (dp20)galen scientificHO20
Ácido clorídrico (líquido)thermoFisher ScientificA466-250
LiofilizadorLabconco7752020Qualquer liofilizador que possa atingir -40C e 0,135 Torr funcionará; também pode ser substituído por concentrador de vácuo rotacional
Metanol (líquido)termoFisher ScientificA412-500Certificado ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Qualquer sistema de imagem em gel comparável é um substituto aceitável
N,N'-metileno-bis-acrilamida (sólido)thermoFisher ScientificBP171-25Grau de eletroforese
Vermelho de fenol (sólido)thermoFisher ScientificP74-10Coluna
Troca Iônica Q Mini HLivre VivapureVS-IX01QH24A coluna de troca iônica deve ter um volume mínimo de carga de 0,4mL, pH de trabalho de 2-12 e seletividade para grupos iônicos com pKa de 11
Nitrato de prata (sólido)thermoFisher ScientificS181-25certificado ACS
Acetato de Sódio (sólido)ThermoFisher ScientificS210-500 Grau debiologia molecular
Cloreto de sódio (sólido)termoFisher ScientificS271-500Grau de biologia molecular
Hidróxido de sódio (sólido)termoFisher ScientificS392-212
Sacarose (sólido)termoFisher ScientificBP220-1 Grau debiologia molecular
TEMED (N,N,N',N'-tetrametilenodiamina)termoFisher ScientificBP150-20Grau de eletroforese
Base Tris (sólido)thermoFisher ScientificBP152-500de grau de biologia molecular
, 0.5mL, 3000 Da corte de peso molecularAmiconUFC500324Unidades de filtro de maior volume podem ser usadas, dependendo do tamanho da amostra. 
Ureia (sólida)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Qualquer concentrador de vácuo rotacional funcionará; pode ser substituído por liofilizador
Unidade de filtro a vácuo, uso único, poro PES de 0,22uM, volume de 500mLthermoFisher Scientific569-0020Volumes alternativos e materiais de filtro aceitáveis
de de de Ácido Filtros ultracentrífugos

Referências

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
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