Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.
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Artigo de método
Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata
Neste artigo
Resumo
Resumo
Glicosaminoglicanos sulfatos (GAGs) como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) são onipresentes em organismos vivos e desempenham um papel crítico em uma variedade de estruturas e processos biológicos básicos. Como polímeros, os GAGs existem como uma mistura de polidisperse contendo cadeias de polissacarídeos que podem variar de 4000 Da a bem mais de 40.000 Da. Dentro dessas cadeias existem domínios de sulfatação, conferindo um padrão de carga negativa que facilita a interação com resíduos carregados positivamente de ligantes proteicos cognatos. Os domínios sul-americanos dos GAGs devem ter comprimento suficiente para permitir essas interações eletrostáticas. Para entender a função dos GAGs em tecidos biológicos, o pesquisador deve ser capaz de isolar, purificar e medir o tamanho dos GAGs. Este relatório descreve uma técnica prática e versátil baseada em gel de poliacrilamida baseada em eletroforese que pode ser aproveitada para resolver diferenças relativamente pequenas de tamanho entre GAGs isolados de uma variedade de tipos de tecidos biológicos.
Introdução
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma família diversificada de polissacarídeos lineares que são um elemento onipresente em organismos vivos e contribuem para muitos processos fisiológicos básicos1. GaGs como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) podem ser sulfatados em posições distintas ao longo da cadeia de polissacarídeos, transmitindo domínios geográficos de carga negativa. Esses GAGs, quando amarrados a proteínas da superfície celular conhecidas como proteoglycans, projetam-se no espaço extracelular e se ligam a ligantes cognatos, permitindo a regulação tanto dos processos de sinalização cis- (ligantes ligados à mesma célul....
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Protocolo
Todas as amostras biológicas analisadas neste protocolo foram obtidas a partir de camundongos, sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado.
1. Isolamento de sulfato heparano
- Delipidação de amostras de tecido
NOTA: A delipidação é um passo opcional para tecidos ricos em gordura.- Faça uma mistura de 1:1 de metanol e diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por amostra; pedaços maiores de tecido podem exigir até 1 mL.
- Coloque cada amostra de tecido em um pequeno recipiente de vidro com uma tampa para delipidação.
NOTA: A ma....
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Resultados
O azul alciano é usado para manchar GAGs sulfatos 10; este sinal é amplificado pelo uso de uma mancha de prata subsequente 11. A Figura 1 fornece uma demonstração visual do processo de desenvolvimento de manchas de prata. Como demonstrado, o sinal azul alciano representando GAGs separados por eletroforese é amplificado à medida que o agente em desenvolvimento penetra o gel de poliacrilamida. Normalmente, o processo de desenvolvimento reduzirá o.......
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Discussão
Os GAGs desempenham um papel central em muitos processos biológicos diversos. Uma das principais funções dos GAGs sulfatados (como HS e CS) é interagir e ligar-se aos ligantes, o que pode alterar as funções de sinalização a jusante. Um importante determinante da afinidade de ligação gag com ligantes cognatos é o comprimento da cadeia de polímeros GAG 8,9,14. Por essa razão, é importante que os pesquisadores possam definir com pr.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL e EPS)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accuspin Micro17 microcentrífuga de bancada | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Qualquer combinação de microcentrífuga de bancada/rotor capaz de 14000 xG é apropriada |
| Acrilamida (sólida) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Grau de eletroforese |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Mistura de protease de S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (sólido) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Acetato de amônio (sólido) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Grau de biologia molecular |
| Hidróxido de amônio (líquido) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certificado ACS |
| Persulfato de amônio (sólido) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | grau de eletroforese |
| Barnstead GenPure Pro Water Sistema de Purificação | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Qualquer sistema de deionização/ purificação de água é um substituto aceitável |
| Ácido bórico (sólido) | termoFisher Scientific | A73-500 | Grau de biologia molecular |
| Azul de bromfenol (sólido) | termoFisher Scientific | B392-5 | |
| Acetato de cálcio (sólido) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Cloreto |
| cálcio (sólido) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Detergente CHAPS de grau de biologia molecular |
| (3-((3-cholamidopropyl) dimetilamônio)-1-propanossulfonato) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Condroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| vazio Criterion para PAGE (1,0 mm de espessura, 12+2 poços) | Bio-Rad | 3459901 | Qualquer sistema de de fundição PAGE de 1,0 mm de espessura será suficiente |
| Critério PAGE Sistema celular (célula e fonte de alimentação) | Bio-Rad | 1656019 | qualquer sistema PAGE de gel vertical comparável funcionará) |
| Diclorometano (líquido) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certificado ACS |
| EDTA sal dissódico (sólido) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular grau de biologia |
| Ácido acético glacial (líquido) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certificado ACS |
| Glicina (sólido) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Eletroforese |
| grau Heparanase I / III | Sigma Aldrich | H3917 | De Flavobacterium heparinum |
| Decasacchaídeo derivado de heparina (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Hexassacarídeo derivado da heparina (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Oligossacarídeo derivado da heparina (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Ácido clorídrico (líquido) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Liofilizador | Labconco | 7752020 | Qualquer liofilizador que possa atingir -40C e 0,135 Torr funcionará; também pode ser substituído por concentrador de vácuo rotacional |
| Metanol (líquido) | termoFisher Scientific | A412-500 | Certificado ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Qualquer sistema de imagem em gel comparável é um substituto aceitável |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (sólido) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Grau de eletroforese |
| Vermelho de fenol (sólido) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Coluna |
| Troca Iônica Q Mini H | Livre Vivapure | VS-IX01QH24 | A coluna de troca iônica deve ter um volume mínimo de carga de 0,4mL, pH de trabalho de 2-12 e seletividade para grupos iônicos com pKa de 11 |
| Nitrato de prata (sólido) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certificado ACS |
| Acetato de Sódio (sólido) | ThermoFisher Scientific | S210-500 Grau de | biologia molecular |
| Cloreto de sódio (sólido) | termoFisher Scientific | S271-500 | Grau de biologia molecular |
| Hidróxido de sódio (sólido) | termoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sacarose (sólido) | termoFisher Scientific | BP220-1 Grau de | biologia molecular |
| TEMED (N,N,N',N'-tetrametilenodiamina) | termoFisher Scientific | BP150-20 | Grau de eletroforese |
| Base Tris (sólido) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | de grau de biologia molecular |
| , 0.5mL, 3000 Da corte de peso molecular | Amicon | UFC500324 | Unidades de filtro de maior volume podem ser usadas, dependendo do tamanho da amostra. |
| Ureia (sólida) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Qualquer concentrador de vácuo rotacional funcionará; pode ser substituído por liofilizador |
| Unidade de filtro a vácuo, uso único, poro PES de 0,22uM, volume de 500mL | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Volumes alternativos e materiais de filtro aceitáveis |
Referências
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan ....
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Reimpressões e permissões
