Preparação de filmes de suporte à amostra em microscopia eletrônica de transmissão usando um bloco de flutuação de suporte

Summary

A preparação da amostra para microscopia crio-elétron (crio-EM) é um gargalo significativo no fluxo de trabalho de determinação da estrutura deste método. Aqui, fornecemos métodos detalhados para o uso de um bloco impresso tridimensional e fácil de usar para a preparação de filmes de suporte para estabilizar amostras para estudos em transmissão.

Abstract

A determinação da estrutura pela microscopia crio-elétron (crio-EM) cresceu rapidamente na última década; no entanto, a preparação da amostra continua sendo um gargalo significativo. As amostras macromoleculares são idealmente imagens diretamente de orientações aleatórias em uma fina camada de gelo vítreo. No entanto, muitas amostras são refrattárias a isso, e a desnaturação de proteínas na interface ar-água é um problema comum. Para superar tais questões, apoiar filmes- incluindo carbono amorfo, grafeno e óxido de grafeno - pode ser aplicado à rede para fornecer uma superfície que as amostras podem povoar, reduzindo a probabilidade de partículas experimentando os efeitos deletérios da interface ar-água. A aplicação desses suportes delicados às grades, no entanto, requer um manuseio cuidadoso para evitar quebras, contaminação aérea ou extensas etapas de lavagem e limpeza. Um relatório recente descreve o desenvolvimento de um bloco de flutuação fácil de usar que facilita a transferência molhada de filmes de suporte diretamente para a amostra. O uso do bloco minimiza o número de etapas de manuseio manual necessárias, preservando a integridade física do filme de suporte e o tempo ao longo do qual a contaminação hidrofóbica pode se acumular, garantindo que uma fina película de gelo ainda possa ser gerada. Este artigo fornece protocolos passo a passo para a preparação de suportes de carbono, grafeno e óxido de grafeno para estudos em EM.

Introduction

Na última década, avanços, principalmente na tecnologia de detectores, mas também em outras áreas técnicas, facilitaram uma sucessão de aumentos substanciais na resolução em que sistemas biologicamente relevantes podem ser imagens por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)^1,2. Apesar de o crio-EM já permitir a resolução de estruturas de alta resolução de apenas 50 μg de proteína através da análise de partículas únicas (SPA), a amostra crio-EM e a preparação da grade continuam sendo grandes gargalos3,4,5. As amostras de SPA consistem em macromoléculas distribuídas aproximadamente aleatoriamente dentro de uma camada de gelo vítreo. O gelo deve ser o mais fino possível para maximizar a diferença de contraste entre as partículas e o solvente. Macromoléculas biológicas são mais estáveis (ou seja, menos propensas a perder sua estrutura nativa) em gelo mais espesso, porque permanecem melhor solvated. Além disso, as partículas são frequentemente encontradas como muito melhor distribuídas sobre o campo de visão no gelo muito mais espessa do que o tamanho de ^partículas6 e frequentemente podem não ser encontradas dentro de buracos nos filmes de carbono em tudo.

Além disso, camadas mais espessas de gelo diminuem a probabilidade de moléculas estarem próximas da interface ar-água devido à alta relação superfície-volume, e estima-se que o uso de métodos padrão de congelamento de mergulho para estudos crio-EM resulta na adsorção de ~90% das partículas para a interface ^ar-água7. O gelo mais espesso resulta em fundo indesejávelmente alto devido ao aumento dos eventos de dispersão dentro do solvente e atenuação concomitante do ^sinal6,7. É, portanto, necessário alcançar uma camada de gelo vítreo possível; idealmente, a camada seria apenas um pouco mais espessa que a partícula. O desafio para o pesquisador, que deve ser superado para cada amostra diferente aplicada a uma grade, é preparar espécimes finos o suficiente para imagens de alto contraste, mantendo a integridade estrutural das partículas dentro de sua amostra. A adsorção de proteínas à interface ar-água é acompanhada por vários efeitos, geralmente deletérios.

Em primeiro lugar, a ligação de proteínas a esta interface hidrofóbica muitas vezes induz a desnaturação da proteína, que prossegue rapidamente e é tipicamente ^{irreversível8,9}. Um estudo realizado com a synthase de ácido graxo de levedura mostrou que até 90% das partículas adsorvidas são desnaturadas10. Em segundo lugar, evidências de um estudo comparando a distribuição de orientação de conjuntos de dados ribossomos 80S coletados tanto em carbono ^amorfo11 ou sem ^suporte12 mostraram que a interface ar-água pode causar orientação preferencial severa comprometendo a reconstrução 3D do ^volume13. Os métodos para reduzir a interação partícula com a interface ar-água incluem a suplementação do tampão de congelamento com surfactantes (como detergentes), o uso de filmes de suporte, captura de afinidade ou andaimes de substratos e tempos acelerados de mergulho. O uso de surfactantes está associado a seus próprios problemas, pois algumas amostras de proteínas podem se comportar não idealmente em sua presença, enquanto substratos de captura de afinidade e andaimes geralmente requerem superfícies de grade sob medida de engenharia e estratégias de captura. Finalmente, embora existam muitas pesquisas sobre o desenvolvimento de dispositivos de mergulho ^{rápido14,15,16}, estes requerem aparelhos que geralmente não estão amplamente disponíveis.

Embora a grade tem padrão para crio-EM biológico já apresenta uma folha de carbono amorfo ^perfurada17, há uma série de protocolos disponíveis para a geração de filmes de suporte adicionais e sua transferência para grades TEM. O uso desses filmes é um método há muito estabelecido para estabilização ^amostral18. Suportes amorfos de carbono são gerados por evaporação e deposição em folhas de mica ^cristalina19, das quais as camadas podem ser flutuadas em grades, com a utilidade de suportes de flutuação como ferramentas úteis estabelecidas em relatórios ^anteriores20. Os flocos de óxido de grafeno, tipicamente preparados usando uma versão modificada do método ^Hummers21, têm sido usados como uma estrutura de suporte preferível ao carbono amorfo para sua diminuição do sinal de fundo, bem como a capacidade de imobilizar e estabilizar macromoléculas22. Mais recentemente, houve um ressurgente interesse no uso do grafeno como filme de suporte TEM devido à sua estabilidade mecânica, alta condutividade, contribuição extremamente baixa para o ruído de ^fundo23, bem como o surgimento de métodos reprodutíveis para gerar áreas macroscopicamente grandes de grafeno ^monocamada24 e transferi-lo para grades ^TEM25 . Quando comparado ao carbono amorfo, que sofre movimentos induzidos por feixes semelhantes, ou pior, do que o gelo sem um filme de suporte11,12,17, o grafeno mostrou uma redução significativa no movimento induzido pelo feixe de imagens crio-EM12.

No entanto, enquanto o grafeno hidrofilizado protegia a synthase de ácidos graxos da desnaturação interfacial da água do ar, os autores deste estudo observaram que o grafeno foi contaminado durante a preparação da amostra, provavelmente devido a uma combinação de contaminação de hidrocarbonetos atmosféricos e do reagente usado para hidrofilizar as ^redes10. De fato, apesar de muitas das qualidades superiores do grafeno, seu uso generalizado ainda é dificultado pela derivatização necessária para diminuir sua ^{hidroofobidade12}, que em última análise é quimicamente difícil e requer equipamentos especializados. Este artigo relata protocolos para a preparação de suportes de amostras de carbono amorfo, grafeno e grafeno usando um bloco de flutuação de amostra impressa tridimensional (3D)²⁷ para transferir diretamente filmes de suporte dos substratos nos quais foram gerados para grades TEM (Figura 1). Uma das principais vantagens do uso desse dispositivo é a transferência molhada de filmes, minimizando a contaminação hidrofóbica dos suportes e, consequentemente, a necessidade de tratamento adicional e reduzindo o número de etapas de manuseio manual potencialmente prejudiciais. Essas abordagens são baratas de implementar e, portanto, amplamente acessíveis e aplicáveis para estudos crio-EM onde os suportes amostrais são necessários.

Protocol

1. Preparação geral da transferência de pré-suporte das grades TEM

1. Utilizando um par de pinças limpas e finas, levante e submerse as grades TEM sequencialmente em água duplamente destilada (_ddH2O) ou água ultrapura para 10-15 s, seguida por acetato de etila, para 10-15 s.
   NOTA: Aqui, foram utilizadas pinças de ação negativa, oblíquas.
2. Coloque a pinça, com grade ainda em aderência, de um lado para secar ao ar por ~5 min.
3. Limpe as grades para remover a superfície de quaisquer contaminantes acumulados através das etapas de lavagem ou lavagem.
   NOTA: Aqui, a limpeza de plasma foi feita para 10-15 s no ar com um poder de radiofrequência de 25 W.

2. Preparação geral de soluções de reagente

1. Solução de acetato deuranyl (UAc) (2% c/v)
   1. Enrole um tubo de 50 mL em papel alumínio, encha com 50 mL de água ultrauso e adicione 1 g de pó UAc.
      NOTA: O UAc é sensível à luz e precipita-se ao longo do tempo quando exposto. Como a UAc é radioativa e tóxica, mantenha um alto nível de limpeza. Com o risco mais grave decorrente da inalação ou ingestão, deve-se tomar cuidado extra para evitar qualquer possibilidade de inalação de partículas finas. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear ou pesar os sais de urânio. Máscaras e óculos altamente recomendados. Os sais de urânio devem ser eliminados de acordo com os requisitos legais estabelecidos para os riscos radioativos no estado.
   2. Deixe a solução mexendo por 1h para permitir que todo o UAc se dissolva. Armazene a 4°C.
   3. Antes de usar, filtrar 1 mL da solução de manchas em um pequeno frasco usando filtro de 0,22 μm para remover quaisquer cristais de acetato restantes.
2. Suspensão de óxido de grafeno (GrOx)
   1. Pipeta 2,5 μL de GrOx em um tubo de 1,5 mL (concentração final de 1%). Pipeta 2,5 μL de 10% (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) detergente no GrOx, e misturar suavemente (0,1% (w/v) concentração final).
   2. Adicione 245 μL de água ultrauso à mistura GrOx-DDM e imediatamente o vórtice vigorosamente por 5 min. Use a suspensão GrOx dentro de 1h de preparação, vórtice vigorosamente por pelo menos 1 minuto antes do uso imediato.
3. Solução de cloreto de ferro (III) (_FeCl3) (10% c/v)
   1. Pesar cuidadosamente 5 g de _FeCl3 em um barco de pesagem. Transfira para um cilindro de medição de 100 mL contendo 35 mL de _ddH2O e uma barra de agitação magnética.
   2. Coloque em uma placa de agitação magnética, e dissolva o _FeCl3, adicionando ddH2O a um volume final de 50 mL. Filtre a solução _FeCl3 através de um filtro de seringa de 0,8 μm em uma garrafa limpa para armazenamento.
      NOTA: _FeCl3 é corrosivo e irritante; lavar as mãos e outras áreas expostas com sabão e água suaves antes de comer, beber ou fumar e quando sair do trabalho. Fornecer boa ventilação na área de processo para evitar a formação de vapor. Não respire névoa, vapores, spray. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear ou pesar o sal. Máscaras e óculos altamente recomendados sempre que estiver em uso.

3. Troca tampão por filmes de suporte a carbono em mica para preparar amostras manchadas negativamente usando o bloco de flutuação de suporte

1. Lavar e limpar plasma as grades TEM.
   NOTA: Aqui, 300 redes de cobre de carbono furado de malha foram usadas conforme descrito acima na seção 1.
2. Pipeta 10-12 μL de amostra no poço de troca de buffer (com os pequenos canais) do bloco de flutuação e 10-12 μL de solução UAc de 2% (ver seção 2.1) para coloração negativa no poço de troca não tampão adjacente.
   NOTA: O poço tem um volume de 10 μL; no entanto, ajuste o volume da amostra para que um menisco convexo seja formado na superfície do líquido para permitir flutuação adequada do filme. Um baixo volume de amostra pode causar quebra de filme.
3. Corte cuidadosamente dois pequenos pedaços de mica com filme de carbono pré-colocado no topo. Certifique-se de que os fragmentos de mica são largos o suficiente para caber no poço (largura de 3,4 mm) e mais longos que o comprimento do poço (3,45 mm), de tal forma que o fragmento se sentará no poço enquanto o carbono estiver flutuando, e haja espaço suficiente para manusear o fragmento com a pinça.
   NOTA: Para manusear o carbono, use pinças de ponta longa de ação negativa plana. Ao cortar os fragmentos de mica, corte usando movimentos únicos para manter a integridade do filme de carbono.
4. Mergulhe o mica no poço com um ângulo aproximado de 45° até que o mica se sente na rampa do poço e uma camada de carbono seja observada na superfície da amostra líquida.
5. Após a incubação inicial da amostra (tipicamente de 20 a 20 minutos, dependendo da adesão da amostra; otimizar esse período com base em necessidades experimentais), retire a folha de mica muito lentamente para recuperar o filme de carbono e minimizar a retenção residual da amostra viscosa.
6. Limpe cuidadosamente o mica tocando a superfície inferior (lado não carbono) com papel filtro para remover o excesso de líquido e, posteriormente, troque o carbono que leva a amostra para a mancha negativa por aplicação ao poço oposto (ou seja, mergulhe o mica como na etapa 3.4) contendo a solução UAc de 2%.
   NOTA: Uma camada de carbono deve ser observada flutuando em cima da solução de manchas neste momento.
7. Recupere a camada de carbono flutuante com o lado furado coberto de carbono de uma rede EM lavada e limpa por plasma. Deixe as grades secas até que a imagem esteja em um TEM. O ideal é cobrir as grades durante o processo de secagem para evitar contaminação no ar.

4. Aplicação do bloco de flutuação de suporte para preparar grades TEM revestidas de óxido de grafeno

1. Lavar e limpar as grades TEM limpas com plasma usando 300 redes de cobre de carbono furado de malha, conforme descrito acima (seção 1).
2. Pipeta 10-12 μL de suspensão GrOx (ver seção 2.2) nos 4 poços de troca não tampão ao longo do bloco de flutuação. Pipeta 10-12 μL _ddH2O ou água ultrauso nos 4 poços de troca de buffer restantes do bloco.
   NOTA: Este volume de água deve ser suficiente para formar um leve menisco convexo acima da altura do bloco.
3. Solte 4 grades suavemente na suspensão grOx de cada poço por 1 minuto, garantindo que o lado furado coberto de carbono faça contato com a solução. Após 1 min, recupere cada grade cuidadosamente deslizando as pinças para o sulco da pinça de cada poço de troca não tampão.
4. Toque suavemente e brevemente o lado de cobre, não coberto de carbono de cada grade para o _ddH2O no poço adjacente. Em seguida, segure cuidadosamente e suavemente a grade, lado da gota d'água para baixo, contra um pedaço de papel filtro.
   NOTA: A mancha da água atrairá a suspensão grox através da grade por ação capilar. É crucial evitar submergir a grade no _ddH2O, por isso o contato deve ser muito breve. Quando a rede é levantada, uma gota de água deve segurar na parte inferior da grade. Tome cuidado para não mover a grade no papel do filtro, pois isso pode perturbar a resolução dos flocos grOx.
5. Deixe as grades nas pinças secas ao ar até a preparação com a amostra. O ideal é cobrir as grades durante o processo de secagem para evitar contaminação no ar.

5. Aplicação do bloco de flutuação de suporte para a preparação de amostras em filmes de monocamadas-grafeno

1. Lave as grades TEM conforme descrito acima (seção 1), mas omitindo a limpeza plasmática.
   NOTA: Aqui, 300 redes de ouro de carbono furado de malha foram usadas, mas outras redes não-cobre ou redes de liga de cobre também são viáveis.
2. Para depositar grades com grafeno, transfira diretamente do grafeno cultivado em substratos de cobre (Cu-grafeno) para grades crio-EM, como descrito ^{anteriormente25}.
   1. Coloque quatro grades lavadas em cima de uma folha de Cu-grafeno (10 mm × 10 mm) depositadas em um slide de vidro e cubra cada grade com uma gota de isopropanol (5-10 μL) para permitir contato íntimo entre o grafeno da monocamada e a grade.
      NOTA: Certifique-se de colocar o lado furado coberto de carbono das grades em contato com a folha de grafeno.
   2. Quando o isopropanol estiver completamente evaporado (tipicamente 2h), flutue a folha de Cu-grafeno com grades em 10% (w/v) solução _FeCl3 (ver seção 2.3) em uma placa de vidro Petri, e deixe gravar à temperatura ambiente durante a noite. Cubra o prato para evitar contaminação pelo ar.
      NOTA: Após a gravação estar completa, apenas a monocameira de grafeno permanecerá flutuando na solução _FeCl3 - isso deve ser visível aos olhos com iluminação adequada.
   3. Use um laço com diâmetro maior que o tamanho da grade TEM para pescar as grades flutuando na monocamadora de grafeno, e transfira cuidadosamente para uma placa de vidro Petri contendo _ddH2O para lavar.
      NOTA: Seja extremamente cauteloso ao pescar as grades para evitar bater nas paredes da placa de Petri, o que pode causar quebra ou dobra de filme de grafeno.
   4. Lave mais duas vezes na água por redes de pesca e transfira para uma placa de Petri limpa contendo _ddH2O para remover todo o _FeCl3 residual. Finalmente, transfira as grades para uma placa de Petri contendo tampão de amostra até a preparação da amostra e o congelamento do mergulho.
      NOTA: O lado coberto de grafeno das grades deve ser sempre molhado para evitar sua exposição a contaminantes no ar.
3. Pipeta a amostra (10-12 μL) em um poço de troca não tampão do bloco de flutuação. Quando a amostra estiver pronta no bloco, escolha uma grade revestida de grafeno da solução tampão usando um par de pinças limpas e coloque na superfície do poço contendo amostras.
4. Após um período de incubação adequado (1-5 min dependendo da amostra; otimizar de acordo com as necessidades experimentais), escolha a grade com um par de pinças de congelamento limpo, e proceda com manchas e vitrificação.

Results

As grades TEM preparadas com suportes de carbono amorfo são tipicamente cobertas por toda a superfície da rede. Embora a quebra do filme de carbono ocorra em alguns casos, juntamente com alguns babados (Figura 2A), um grande número de quadrados de grade são imaculados e, portanto, amplamente aplicáveis para fins de coloração negativa. O principal fator que afeta a integridade do suporte é a espessura do carbono, que é determinada durante a evaporação do carbono. Da mesma forma, com este protocolo GrOx, uma boa cobertura é rotineiramente alcançada em toda a grade (Figura 2B). Uma única aplicação de suspensão GrOx por 1 min é suficiente para garantir poucas áreas com múltiplas camadas, que são fáceis de ver devido às bordas do floco. As grades grOx podem ser preparadas rapidamente a partir de matérias-primas e são altamente protetoras da amostra. No entanto, bordas de flocos, cobertura incompleta e babados são mais frequentemente visíveis com grades GrOx do que para as outras técnicas devido à natureza dos flocos grOx.

Embora a integridade do filme de suporte ao grafeno, como o carbono amorfo, dependa do processo de deposição, áreas que são bem cobertas exibem o padrão característico de difração do grafeno de camada única. É importante ressaltar que, mantendo as películas de suporte ao grafeno molhadas, as amostras podem ser recuperadas do bloco de flutuação após um período de incubação e dados coletados de forma favorável à análise de partículas únicas. Este método não requer qualquer outro tratamento do grafeno para molhar, removendo assim a exigência de equipamentos caros para tornar o hidrofílico de grafeno, e é melhor preparar filmes de suporte pouco antes da preparação da amostra e congelamento da grade (Figura 2C).

Figura 1: Design do bloco de flutuação da amostra e aplicação durante a preparação do filme de suporte. (A) Esquemático de vista superior, bem, e visão lateral do bloco de flutuação, incluindo medidas da forma, profundidade e inclinação. O sulco para as pontas da pinça descansar, bem como os canais para inserir agulhas, são indicados. (B) Camadas de carbono amorfa podem ser facilmente flutuadas sobre a superfície do tampão contida dentro dos poços do bloco de flutuação usando a rampa, ou seja, durante a preparação de grades TEM manchadas negativamente. (C) A largura dos poços é adequada para acomodar uma grade TEM, enquanto as ranhuras da pinça reduzem a necessidade de liberar e pegar grades desnecessariamente durante as etapas de preparação, mas oferecem um caminho definido para recuperar grades sem risco de dobra se as grades forem liberadas. As imagens em B são modificadas a partir de ²⁷. Abreviação: TEM = microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos típicos de filmes de suporte amostral preparados usando o bloco de flutuação. As visualizações quadradas (esquerda) e de imagem (direita) são mostradas para (A) carbono amorfo, (B) óxido de grafeno e (C) filmes de suporte ao grafeno preparados usando o bloco de flutuação. O suporte de carbono amorfo foi utilizado na preparação de ribossomos 70S para coloração negativa, enquanto os suportes de óxido de grafeno e grafeno foram usados na preparação de ribossomos 70S para crio-EM. As imagens em A e C são modificadas a partir de ²⁷. Barra de escala para um quadrado de grade = 10 μm; barras de escala para quadrados de grade B e C = 5 μm; barras de escala para visualizações de imagem A-C = 50 nm. Abreviação: crio-EM = microscopia crio-elétron. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este artigo apresenta protocolos para manuseio de ambos os filmes amorfos de carbono e grafeno para preparação de amostras crio-EM usando um bloco de flutuação de ^amostra27. Um arquivo STL para o bloco de suporte está livremente disponível no repositório thingiverse público [www.thingiverse.com/thing:3440684], e pode ser impresso em 3D com qualquer impressora estereotipada adequada a partir de uma resina adequada. O uso de filmes de carbono cobrindo uma grade TEM geralmente envolve a flutuação de carbono na ^amostra28. Essa abordagem para o preparo de redes de manchas negativas minimiza a exposição ao ar durante o manuseio do suporte, reduzindo assim a contaminação e a desnaturação de proteínas. A preparação de grades usando carbono flutuante em pequenos poços é vantajosa para flutuar uma área de superfície maior, ou seja, em um banho de água ou placa de Petri, nesse caso a tesoura mecânica do carbono ocorre muito mais facilmente.

A UAc pode ser difícil de comprar devido às normas de saúde e segurança vigentes no momento da publicação. Muitos outros reagentes de coloração comumente usados, não radioativos e negativos estão disponíveis, e protocolos para sua preparação foram descritos ^{anteriormente29}. Embora as manchas alternativas não tenham sido utilizadas com este bloco de flutuação de suporte, não é provável que haja diferenças nesses protocolos além da otimização do tempo de incubação com a amostra (etapa 3.5), que já é inerentemente dependente da amostra. O passo chave neste protocolo de preparação de suporte grOx é o passo 4.4, destacado pela nota para evitar que a solução de água e GrOx entre em contato ao redor da borda da grade. A mistura inadequada da água e das soluções grOx impede a fixação unidirecional dos flocos de GrOx por ação capilar. Ter flocos de GrOx em ambos os lados da folha de carbono resulta em camadas grossas, negando assim as vantagens de usar GrOx como suporte de camada quase única, bem como prender água entre os flocos, o que causa contaminação de áreas utilizáveis com camadas adicionais de gelo. A preparação de suporte ao óxido de grafeno é relativamente fácil de conseguir usando gotículas de solução em filme de poliolefina flexível. No entanto, quando realizado dessa forma, é mais fácil contaminar acidentalmente o lado de cobre da rede por erros de manuseio indevido; o uso do bloco de flutuação reduz a probabilidade dessa eventualidade.

Finalmente, este artigo apresenta um protocolo para preparar redes cobertas de grafeno que evite qualquer tipo de pré-tratamento de grafeno para torná-lo hidrofílico, reduzindo assim seu custo e aumentando sua acessibilidade. Manter um filme molhado durante toda a preparação do espécime e aplicar a amostra in situ no bloco pouco antes do congelamento é suficiente para permitir a geração de camadas de gelo adequadas para crio-EM com uma distribuição de amostra homogênea. No geral, os protocolos aqui apresentados minimizam o contato amostral com a interface ar-água, reduzindo assim a desnaturação amostral e a contaminação por suporte. Para os três filmes de suporte utilizados nessas abordagens, distribuições de amostras homogêneas poderiam ser alcançadas em todas as redes, juntamente com imagens de partículas únicas intactas e bem preservadas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Limpador de Plasma Básico (230 V)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Pinça Dumont N5A INOX.	Pinça Dumont Swissmade	0302-N5A-PO
Dumont NGG INOX.	Dumont Swissmade	0102-NGG-PO
Ehtylacetate	Sigma-Aldrich	270989-250ML
Alças de Pesca 10 μ L	VWR	612-9353
Óxido de grafeno 2 mg/mL	Sigma-Aldrich	763705-25ML
Cloreto de ferro (III)	Sigma-Aldrich	31232-250MG
Folhas de mica 75 mm x 25 mm x 0,15 mm Agar	Scientific	AGG250-1	Normalmente revestimos mica com uma espessura de filme de carbono alvo de 2 nm
Grafeno monocamada em	Graphenea	N/A	10 mm x 10 mm, embalagem de 4
n-dodecil β-D-maltosídeo (DDM)	GLYCON Biochemicals GmbH	D97002-C
Quantifoil R1.2/1.3 Grades de cobre de 300 mesh	Enzo Life Sciences	JBS-X-101-Cu300
Quantifoil R2/1 Grades de cobre de 300 mesh	Enzo Life Sciences	JBS-X-102-Cu300
Quantifoil R2/1 300 mesh grades de ouro	Microscopia Eletrônica	Q350AR1
Tesouras	Agar Scientific	AGT577
Acetato de Uranilo	TAAB Laboratórios Equipamentos	U001
Vitrobot Mark IV	FEI	N / A
Whatman papel de filtro 55 mm	GE Healthcare Life Sciences	1441-055
Papel de filtro Whatman 70 mm	GE Healthcare Life Sciences	1441-070