O protocolo aqui apresentado descreve um pipeline completo para analisar dados de transcriptome de sequenciamento de RNA desde leituras brutas até análises funcionais, incluindo etapas de controle de qualidade e pré-processamento para abordagens analíticas estatísticas avançadas.
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Artigo de método
Análise de transcriptome de alto rendimento para investigar interações host-pathogen
Neste artigo
Resumo
Resumo
Patógenos podem causar uma grande variedade de doenças infecciosas. Os processos biológicos induzidos pelo hospedeiro em resposta à infecção determinam a gravidade da doença. Para estudar tais processos, os pesquisadores podem usar técnicas de sequenciamento de alto rendimento (RNA-seq) que medem as mudanças dinâmicas do transcriptome hospedeiro em diferentes estágios de infecção, desfechos clínicos ou gravidade da doença. Essa investigação pode levar a uma melhor compreensão das doenças, bem como a descoberta de potenciais alvos e tratamentos medicamentosos. O protocolo aqui apresentado descreve um pipeline completo para analisar dados de sequenciamento de RNA desde leituras brutas até análises funcionais. O gasoduto é dividido em cinco etapas: (1) controle de qualidade dos dados; (2) mapeamento e anotação de genes; (3) análise estatística para identificar genes expressos diferencialmente e genes co-expressos; (4) determinação do grau molecular da perturbação das amostras; e (5) análise funcional. A etapa 1 remove artefatos técnicos que podem afetar a qualidade das análises a jusante. Na etapa 2, os genes são mapeados e anotados de acordo com os protocolos padrão da biblioteca. A análise estatística na etapa 3 identifica genes que são expressos diferencialmente ou co-expressos em amostras infectadas, em comparação com as não infectadas. A variabilidade da amostra e a presença de potenciais outliers biológicos são verificadas usando o grau molecular de abordagem de perturbação na etapa 4. Por fim, a análise funcional na etapa 5 revela os caminhos associados ao fenótipo da doença. O pipeline apresentado tem como objetivo apoiar pesquisadores através da análise de dados RNA-seq a partir de estudos de interação hospedeiro-patógeno e impulsionar futuros experimentos in vitro ou in vivo , que são essenciais para entender o mecanismo molecular das infecções.
Introdução
Arboviroses, como dengue, febre amarela, chikungunya e zika, têm sido amplamente associadas a diversos surtos endêmicos e surgiram como um dos principais patógenos responsáveis por infectar humanos nas últimas décadas1,2. Indivíduos infectados com o vírus chikungunya (CHIKV) frequentemente têm febre, dor de cabeça, erupção cutânea, poliartalgia e artrite3,4,5. Vírus podem subverter a expressão genética da célula e influenciar várias vias de sinalização de hospedeiro. Recentemente, estudos de transcrição sanguínea util....
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Protocolo
As amostras utilizadas neste protocolo foram aprovadas pelos comitês de ética tanto do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo quanto da Universidade Federal de Sergipe (Protocolos: 54937216.5.0000.5467 e 54835916.2.0000.5546, respectivamente).
1. Instalação de desktop docker
NOTA: As etapas para preparar o ambiente Docker são diferentes entre os sistemas operacionais (OSs). Portanto, os usuários de Mac devem seguir as etapas listadas como 1.1, os usuários de Linux devem seguir as etapas listadas como 1.2 e os usuários do Windows devem seguir a....
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Resultados
O ambiente de computação para análises de transcriptome foi criado e configurado na plataforma Docker. Essa abordagem permite que usuários iniciantes do Linux usem sistemas de terminais Linux sem conhecimento de gerenciamento a priori. A plataforma Docker usa os recursos do sistema operacional host para criar um contêiner de serviço que inclua ferramentas específicas de usuários (Figura 1B). Um contêiner baseado na distribuição Linux OS Ubuntu 20.04 foi criado e foi totalmente configurado pa.......
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Discussão
A preparação das bibliotecas de sequenciamento é um passo crucial para responder às questões biológicas da melhor maneira possível. O tipo de transcrição de interesse do estudo orientará qual tipo de biblioteca de sequenciamento será escolhida e conduzirá análises bioinformáticas. Por exemplo, a partir do sequenciamento de um patógeno e interação do host, de acordo com o tipo de sequência, é possível identificar sequências de ambas ou apenas das transcrições do host.
O equipamento de sequencia.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
HN é financiado pela FAPESP (números de subvenção: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 e 2013/08216-2) e CNPq (313662/2017-7).
Agradecemos especialmente as seguintes bolsas para bolsistas: ANAG (Processo FAPESP 2019/13880-5), VEM (Processo FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Processo FAPESP 2020/05284-0), APV (Processo FAPESP 2019/27146-1) e, RLTO (Processo CNPq 134204/2019-0).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Laboratório de Biologia de Sistemas Computacionais | CEMiTool | 1.12.2 | Descoberta e análise de módulos de genes de co-expressão de maneira totalmente automática, ao mesmo tempo em que fornece um relatório HTML amigável com gráficos de alta qualidade. |
| EdgeR | Bioconductor (Mantenedor: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au]) | 3.30.3 | Análise de expressão diferencial de perfis de expressão de RNA-seq com replicação biológica |
| EnhancedVolcano | Bioconductor (Mantenedor: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk]) | 1.6.0 | Gráficos de vulcões prontos para publicação com coloração e rotulagem aprimoradas |
| FastQC | Babraham Bioinformatics | 0.11.9 | Tem como objetivo fornecer uma maneira simples de fazer algumas verificações de controle de qualidade em dados brutos de sequência provenientes de sequenciamento de alto rendimento |
| FeatureCounts | Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research | 2.0.0 | Atribuir leituras de sequenciamento mapeadas a recursos genômicos especificados |
| MDP | Computational Systems Biology Laboratory | 1.8.0 | O Grau de Perturbação Molecular calcula pontuações para amostras de dados de transcriptoma com base em sua perturbação de controles |
| R | R Core Group | 4.0.3 | Linguagem de programação e ambiente de software livre para computação estatística e gráficos |
| Divisão de Bioinformática STAR, Instituto Walter e Eliza Hall de Pesquisa Médica | 2.7.6a | Alinhador projetado para abordar especificamente muitos dos desafios do mapeamento de dados de RNA-seq usando uma estratégia para contabilizar alinhamentos emendados | |
| Bowtie2 | Johns Hopkins University | 2.4.2 | Ferramenta ultrarrápida e eficiente em memória para alinhar leituras de sequenciamento a sequências de referência longas |
| Trimmomatic | THE USADEL LAB | 0.39 | Tarefas de sequência de adaptador de corte para dados de extremidade emparelhada e terminada única Illumina |
| Obtenha o Docker | Docker | 20.10.2 | Crie um ambiente de bioinformática reproduzível e previsível (https://docs.docker.com/get-docker/) |
| WSL2-Kernel | Windows | NA | https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel |
| Obter Docker Linux | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/ |
| Repositório Docker Linux | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository |
| MDP Website | Laboratório de Biologia de Sistemas Computacionais | NA | https://mdp.sysbio.tools |
| Enrichr Website | MaayanLab | NA | https://maayanlab.cloud/Enrichr/ |
| webCEMiTool | Laboratório de Biologia de Sistemas Computacionais | NA | https://cemitool.sysbio.tools/ |
| gProfiler | Grupo de Bioinformática, Algoritmos e Mineração de Dados | NA | https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost |
| goseq | Bioconductor (Mantenedor: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk]) | NA | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html |
| SRA Estudo NCBI | NCBI | NA https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/ |
Referências
- Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).
- Burt, F. J., et al. Chikungunya virus: an update o....
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Reimpressões e permissões
