Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

Resumo

Este protocolo usa repórteres fluorescentes e classificação celular para simplificar experimentos de knock-in em linhas de células macrófagos e t. Dois plasmídeos são usados para esses experimentos simplificados de knock-in, ou seja, um plasmídeo de expressão CRISPR/Cas9 e DsRed2 e um plasmídeo de recombinação homólogo que expressa EBFP2, que está permanentemente integrado no lócus Rosa26 em células imunes.

Resumo

Estudos de genômica funcional do sistema imunológico requerem manipulações genéticas que envolvem tanto a exclusão de genes-alvo quanto a adição de elementos a proteínas de interesse. A identificação de funções genéticas em modelos de linha celular é importante para a descoberta genética e exploração de mecanismos intrínsecos. No entanto, as manipulações genéticas de células imunes, como células T e linhas de células macrófagos usando knock-in mediada por CRISPR/Cas9, são difíceis devido à baixa eficiência de transfecção dessas células, especialmente em um estado quiescente. Para modificar genes em células imunes, a seleção de resistência a drogas e vetores virais são tipicamente usados para enriquecer para células que expressam o sistema CRIPSR/Cas9, o que inevitavelmente resulta em intervenção indesejável das células. Em um estudo anterior, projetamos repórteres fluorescentes duplos acoplados ao CRISPR/Cas9 que foram transitoriamente expressos após a eletroporação. Esta solução técnica leva à rápida exclusão genética em células imunes; no entanto, o impacto genético em células imunes, como células T e macrófagos sem o uso de seleção de resistência a drogas ou vetores virais, é ainda mais desafiador. Neste artigo, mostramos que, usando a triagem celular para auxiliar a seleção de células que expressam transitoriamente as construções CRISPR/Cas9 visando o lócus Rosa26 em combinação com um plasmídeo doador, o knock-in genético pode ser alcançado tanto em células T quanto em macrófagos sem enriquecimento de resistência a drogas. Como exemplo, mostramos como expressar o ACE2 humano, um receptor de SARS-Cov-2, que é responsável pela atual pandemia Covid-19, em macrófagos RAW264.7 realizando experimentos knock-in. Tais células de impacto genéticos podem ser amplamente utilizadas para estudos mecanicistas.

Introdução

Células imunes são críticas para a defesa contra patógenos. Imunidade inata e adaptativa são necessárias para liberação de infectantes e manutenção da homeostase^{tecidual 1,2}. Modelos de linha celular são ferramentas essenciais para a compreensão dos fundamentos moleculares do sistema imunológico dos mamíferos; são utilizados em ensaios funcionais in vitro, como aqueles modelando a ativação de células T humanas, e na determinação da função de fatores genéticos na ativação ou amortecimento das respostas imunes^3,4. É importante notar que o sistem....

Protocolo

1. Projeto e Construção Plasmid de sgRNAs visando Rosa26 Locus

1. Guia de design RNAs em torno do local de inserção desejado
   1. Certifique-se de que o local de inserção do mouse Rosa26 (doravante designado como mRosa26) esteja localizado no primeiro intron de mRosa26; este site foi utilizado em estudos anteriores^28,29. Para experimentos em células humanas, certifique-se de que o local de inserção resida no lócus ROSA26 humano (doravante referido como hROSA26), que foi identificado como o homólogo humano de

Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima para realizar experimentos de knock-in no lócus mRosa26 usando macrófagos murine RAW264.7, projetamos um vetor direcionado para expressar ace2 humano, um receptor para o vírus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando um design semelhante, geramos células Tockat T humanas com knock-in da proteína de fusão RASGRP1 marcada pelo OST(Figura 2C). Após a transfecção de três plasmídeos, dois dos quais foram usados para expressão de CRIS.......

Discussão

Em nossos experimentos, demonstramos como realizar a edição em células imunes desde o projeto de construção até a triagem e validação celular knock-in usando células toscos humanos e macrófagos murine RAW264.7 como exemplos. As linhas de células T e macrófagos são resistentes à transfecção^36,37; no entanto, o problema da baixa eficiência da entrega do CRISPR/Cas9 pode ser superado com o auxílio de repórteres fluorescentes aliados à classificação celular. Este pro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Amersham Imager 600	Ge Imaging		de saúde de quimioluminescência
Ampicilina, sal de sódio	MP Biomedicals	194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074	na diluição 1/5000
Anticorpo anti-RasGRP1, clone 10.1	Merck	MABS146	1.0 μ g/mL de concentração de trabalho
AscI	New England BioLabs	R0558S
β-Actin (D6A8) Tecnologia	de Sinalização de Células	8457	a 1/1000 de diluição
BamHI-HF	New England BioLabs	R3136S
BbsI-HF	New England BioLabs	R3539S
Cellometer Mini Contador Celular Automatizado	Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Células competentes	Takara	9057
DMSO (Dimetil Sulfóxido)	MP Biomedicals	196055
DNeasy Blood & Kits de Tecidos	Qiagen	69506	reagente de cultura de células
DPBS (10X), sem cálcio, sem magnésio	ThermoFisher Scientific	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com alta glicose	HyClone	SH30022.01
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
FACSAria™ Fusion	BD Biosciences		equipado com gabinete de biossegurança
FACS Citômetro de fluxo Canto	BD Biosciences
Falcon 5 ml de poliestireno tubo de ensaio de fundo redondo	BD Biosciences	352003
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
FlowJo versão 10.7	BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP  Tecnologia	de sinalização de células	5174	com diluição de 1/1000
Anticorpo secundário anti-IgG (H + L) de cabra, HRP	ThermoFisher Scientific	31430	com diluição de 1/5000
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrato	Millipore	WBKLS0500
Membrana Immobilon-PSQ PVDF	Millipore	ISEQ00010
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Sulfato de canamicina	MP Biomedicals	194531
LB ágar pó	Multicanal 22700041		ThermoFisher Scientific
(30-300 μ L)	Eppendorf, ou similar
Sistema de Transfecção Neon	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Sistema de Transfecção Neon, 10 μ Kit L	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéreis	ThermoFisher Scientific	339651
OneTaq® Carregamento rápido de arranque a quente® 2X Master Mix	New England BioLabs	(M0489)	para modelo de alta GC%
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 a 180	kDa ThermoFisher Scientific	26616
Ponta de pipeta 0.1-20µ l	Eppendorf, ou similar	0030 075.005
Ponteira de pipeta 2-200µ l	Eppendorf, ou similar	0030 075.021
Ponta de pipeta 50-1000µ l	Eppendorf, ou similar	0030 075.064
Kit Maxi de Plasmídeo	Qiagen	12163
pX458-DsRed2	Addgene	112219
QIAquick Kit de Purificação de PCR	Qiagen	28104	purifica o plasmídeo da digestão de restrição
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England BioLabs	M0494S
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
Anticorpo anti-ACE2 recombinante [EPR4435(2)]	Abcam	ab108252	a 1/1000 de diluição
RPMI 1640 Medium	HyClone	SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads	IBA Lifesciences	2-1201-010
Penicilina-Estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SYTOX™ Coloração de células mortas vermelhas, para excitação de 633 ou 635 nm	ThermoFisher Scientific	S34859
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202S
T4 Polinucleotídeo quinase	New England BioLabs	M0201S
Solução de azul de tripano, 0,4%	ThermoFisher Scientific	15250061
solução de tripsina-EDTA (0,25%), com vermelho de fenol	ThermoFisher Scientific	25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-Rad
1.5 mL microtubos, PCR-clean	Eppendorf, ou similar	0030 125.215
Placas de múltiplos poços tratadas com TC de 24 poços	Corning	3524
Microplacas de poliestireno de fundo plano de 96 poços	Corning	3599
Microplaca Corning 3799 tratada com TC de fundo redondo transparente de 96 poços