Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

Lichen Zhang; Rong Huang; Liaoxun Lu; Rui Fu; Guo Guo; Yanrong Gu; Zhuangzhuang Liu; Le He; Marie Malissen; Yinming Liang

doi:10.3791/62328

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Artigo de método

Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

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DOI:

10.3791/62328

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13 de novembro de 2021

Lichen Zhang¹ , Rong Huang¹ , Liaoxun Lu¹ , Rui Fu¹ , Guo Guo¹ , Yanrong Gu¹ , Zhuangzhuang Liu¹ , Le He¹ , Marie Malissen² , Yinming Liang¹

¹The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, ²Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Neste artigo

Resumo

Este protocolo usa repórteres fluorescentes e classificação celular para simplificar experimentos de knock-in em linhas de células macrófagos e t. Dois plasmídeos são usados para esses experimentos simplificados de knock-in, ou seja, um plasmídeo de expressão CRISPR/Cas9 e DsRed2 e um plasmídeo de recombinação homólogo que expressa EBFP2, que está permanentemente integrado no lócus Rosa26 em células imunes.

Resumo

Estudos de genômica funcional do sistema imunológico requerem manipulações genéticas que envolvem tanto a exclusão de genes-alvo quanto a adição de elementos a proteínas de interesse. A identificação de funções genéticas em modelos de linha celular é importante para a descoberta genética e exploração de mecanismos intrínsecos. No entanto, as manipulações genéticas de células imunes, como células T e linhas de células macrófagos usando knock-in mediada por CRISPR/Cas9, são difíceis devido à baixa eficiência de transfecção dessas células, especialmente em um estado quiescente. Para modificar genes em células imunes, a seleção de resistência a drogas e vetores virais são tipicamente usados para enriquecer para células que expressam o sistema CRIPSR/Cas9, o que inevitavelmente resulta em intervenção indesejável das células. Em um estudo anterior, projetamos repórteres fluorescentes duplos acoplados ao CRISPR/Cas9 que foram transitoriamente expressos após a eletroporação. Esta solução técnica leva à rápida exclusão genética em células imunes; no entanto, o impacto genético em células imunes, como células T e macrófagos sem o uso de seleção de resistência a drogas ou vetores virais, é ainda mais desafiador. Neste artigo, mostramos que, usando a triagem celular para auxiliar a seleção de células que expressam transitoriamente as construções CRISPR/Cas9 visando o lócus Rosa26 em combinação com um plasmídeo doador, o knock-in genético pode ser alcançado tanto em células T quanto em macrófagos sem enriquecimento de resistência a drogas. Como exemplo, mostramos como expressar o ACE2 humano, um receptor de SARS-Cov-2, que é responsável pela atual pandemia Covid-19, em macrófagos RAW264.7 realizando experimentos knock-in. Tais células de impacto genéticos podem ser amplamente utilizadas para estudos mecanicistas.

Introdução

Células imunes são críticas para a defesa contra patógenos. Imunidade inata e adaptativa são necessárias para liberação de infectantes e manutenção da homeostase^{tecidual 1}^,². Modelos de linha celular são ferramentas essenciais para a compreensão dos fundamentos moleculares do sistema imunológico dos mamíferos; são utilizados em ensaios funcionais in vitro, como aqueles modelando a ativação de células T humanas, e na determinação da função de fatores genéticos na ativação ou amortecimento das respostas imunes^3,⁴. É importante notar que o sistem....