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Artigo de método

Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

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DOI:

10.3791/62328

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13 de novembro de 2021

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1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Neste artigo

Resumo

Este protocolo usa repórteres fluorescentes e classificação celular para simplificar experimentos de knock-in em linhas de células macrófagos e t. Dois plasmídeos são usados para esses experimentos simplificados de knock-in, ou seja, um plasmídeo de expressão CRISPR/Cas9 e DsRed2 e um plasmídeo de recombinação homólogo que expressa EBFP2, que está permanentemente integrado no lócus Rosa26 em células imunes.

Resumo

Estudos de genômica funcional do sistema imunológico requerem manipulações genéticas que envolvem tanto a exclusão de genes-alvo quanto a adição de elementos a proteínas de interesse. A identificação de funções genéticas em modelos de linha celular é importante para a descoberta genética e exploração de mecanismos intrínsecos. No entanto, as manipulações genéticas de células imunes, como células T e linhas de células macrófagos usando knock-in mediada por CRISPR/Cas9, são difíceis devido à baixa eficiência de transfecção dessas células, especialmente em um estado quiescente. Para modificar genes em células imunes, a seleção de resistência a drogas e vetores virais são tipicamente usados para enriquecer para células que expressam o sistema CRIPSR/Cas9, o que inevitavelmente resulta em intervenção indesejável das células. Em um estudo anterior, projetamos repórteres fluorescentes duplos acoplados ao CRISPR/Cas9 que foram transitoriamente expressos após a eletroporação. Esta solução técnica leva à rápida exclusão genética em células imunes; no entanto, o impacto genético em células imunes, como células T e macrófagos sem o uso de seleção de resistência a drogas ou vetores virais, é ainda mais desafiador. Neste artigo, mostramos que, usando a triagem celular para auxiliar a seleção de células que expressam transitoriamente as construções CRISPR/Cas9 visando o lócus Rosa26 em combinação com um plasmídeo doador, o knock-in genético pode ser alcançado tanto em células T quanto em macrófagos sem enriquecimento de resistência a drogas. Como exemplo, mostramos como expressar o ACE2 humano, um receptor de SARS-Cov-2, que é responsável pela atual pandemia Covid-19, em macrófagos RAW264.7 realizando experimentos knock-in. Tais células de impacto genéticos podem ser amplamente utilizadas para estudos mecanicistas.

Introdução

Células imunes são críticas para a defesa contra patógenos. Imunidade inata e adaptativa são necessárias para liberação de infectantes e manutenção da homeostasetecidual 1,2. Modelos de linha celular são ferramentas essenciais para a compreensão dos fundamentos moleculares do sistema imunológico dos mamíferos; são utilizados em ensaios funcionais in vitro, como aqueles modelando a ativação de células T humanas, e na determinação da função de fatores genéticos na ativação ou amortecimento das respostas imunes3,4. É importante notar que o sistema imunológico dos mamíferos é extremamente heterogêneo e, igualmente importante, um enorme número de moléculas controla a diferenciação, migração e função de uma determinada célula tipo5,6.

As ferramentas de edição de genomas curtas econsetos interespaçadas regularmente (CRISPR)/Cas9 permitem a manipulação genética de tipos de células específicas, o que facilita a anotação funcional de genes de forma precisa7,8. Vários protocolos publicados descreveram a entrega de CRISPR/Cas9 na forma de complexos de RNA de guia Cas9 conhecidos como ribonucleoproteínas (RNPs) em células HEK293, linhas celulares Jurkat, células T primárias9,10,macrófagos11,12,13, células-tronco14, e outras15,16. Nesses protocolos, a marcação genética geralmente é alcançada fundindo uma tag fluorescente às proteínas endógenas17,18. No entanto, poucas tentativas foram feitas para usar repórteres fluorescentes duplos, que são compatíveis com a classificação de células únicas, para facilitar experimentos de knock-in19,20, particularmente em células imunes.

Análises mecanicistas aprofundadas destinadas a entender as funções de um novo fator genético em células imunes geralmente requerem a exclusão específica do tipo celular de um gene, experimentos de resgate genético e ideal identificação de seus interagirores. Embora métodos de otimização da exclusão genética de genes em células imunes tenham sido publicados9,15,21, muito menos métodos foram relatados para introduzir alelos knock-in com funções versáteis para entender a resposta imune. Portanto, neste protocolo pretendemos descrever em detalhes um protocolo eficiente e altamente reprodutível para expressar uma proteína de interesse (POI) no lócus do porto seguro Rosa26 em linhas de células imunes humanas e murinas. Projetamos um sistema de repórter de duas cores para enriquecer para células transfeinadas com plasmídeos expressando CRISPR/Cas9 (DsRed2) e um modelo de DNA recombinante (EBFP2), que pode ser isolado por classificação celular. Seguindo este protocolo, obtivemos múltiplas linhas de knock-in da linha celular T humana Jurkat e macrófago murina RAW264.7 para análises funcionais de proteínas mal estudadas.

Como exemplo, mostramos neste protocolo como obter macrófagos RAW264.7 expressando compunção ace2 humano (receptor de SARS-Cov-2)22. Como as células imunes inatas estão envolvidas na patogênese do Covid-1923,24 e o ACE2 humano é considerado um receptor importante necessário para a entrada viral nas células antes da replicação, macrófagos com knock-in do ACE2 humano podem servir como uma ferramenta útil para estudos mecanicistas de multiplicação viral dentro de macrófagos. Em paralelo, também apresentamos um exemplo de knock-in de um gene no lócus ROSA26 humano para expressar a proteína RASGRP1, que foi fundida em seu amino terminus com uma afinidade Twin-Strep-tag (OST). As células T são células-alvo-chave em terapias imunológicas, e um número crescente de estudos tem se concentrado na manipulação de sua capacidade de resposta ao câncer25,26. Como rasgrp1 é conhecido por ser uma molécula-chave de sinalização a jusante do receptor de células T e seus interagirres não são bem elucidados27, o modelo de knock-in OST-RASGRP1 fornece a base para identificar interactores que regulam a resposta das células T a tumores e infecções. Juntas, essas ferramentas podem ser usadas para estudos covid-19 e a descoberta de novas moléculas interagindo com Rasgrp1.

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Protocolo

1. Projeto e Construção Plasmid de sgRNAs visando Rosa26 Locus

  1. Guia de design RNAs em torno do local de inserção desejado
    1. Certifique-se de que o local de inserção do mouse Rosa26 (doravante designado como mRosa26) esteja localizado no primeiro intron de mRosa26; este site foi utilizado em estudos anteriores28,29. Para experimentos em células humanas, certifique-se de que o local de inserção resida no lócus ROSA26 humano (doravante referido como hROSA26), que foi identificado como o homólogo humano de mRosa2630.
    2. Use as sequências genômicas de camundongos e espécies humanas obtidas da Informática do Genoma do Rato (http://www.informatics.jax.org/) e do navegador genoma Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), respectivamente. Copie 50 pares de base (bp) da sequência genômica do lócus mRosa26 ou hROSA26 em cada lado flanqueando o local de inserção desejado.
    3. Guia de design RNAs usando a ferramenta web on-line CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Cole a sequência de 100 bp de entrada a partir de 1.1.2. Selecione dois RNAs guia com uma pontuação de alta especificidade, uma pontuação de alta eficiência e atividade baixa fora do alvo. Além disso, escolha guias de RNA com pontuações mais altas do doench e evite aqueles rotulados como "Ineficientes"32.
      NOTA: Ferramentas alternativas de design CRISPR também são valiosas e disponíveis publicamente, por exemplo, a ferramenta de design Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). Para aumentar a frequência de células mutadas mediadas pelo CRISPR/Cas9, selecione duas RNAs guiadas próximas ao local de inserção desejado quando possível33.
    4. Para o lócus mRosa26, utilize dois RNAs de guia adjacente designados como mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') e mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3')(Figura 1A). Para o lócus hROSA26, utilize dois RNAs guia adjacentes, ou seja, hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') e hR26-sg2 (5'- AATCGAAGCGACTCGACA -3')(Figura 1B).
      NOTA: As atividades de edição de genomas de células mR26-sg1 e mR26-sg2 e de hR26-sg1 e hR26-sg2 foram avaliadas em células RAW264.7 e Jurkat, respectivamente (Ver Arquivo Suplementar, Figura S1).
  2. Clonagem de vetores de expressão CRISPR contendo sgRNA visando o Lócus Rosa26
    1. Sintetizar oligos para frente e reverter para um guia RNA (Ver Arquivo Suplementar).
      NOTA: É preferível adicionar um nucleotídeo 'G' ao início da sequência guia, o que ajuda na expressão impulsionada pelo promotor do U6. Por exemplo, para clonar o referido mR26-sg1, o oligo avançado é CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT e o oligo reverso é AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. O adicional G no oligo dianteiro e seu complemento no oligo reverso são indicados em negrito.
    2. Clone oligos sintético correspondentes ao guia RNAs no vetor de expressão CRISPR all-in-one pX458-DsRed2 gerado em nosso trabalho anterior21 (Figura 1C) usando o protocolo geral para clonagem de gRNA desenvolvido pelo Laboratório de Zhang (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); no entanto, pule a etapa de purificação do gel e purifique o vetor digerido usando um kit de purificação PCR (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Em protocolos anteriores, foi realizada a purificação do vetor digerido pelo BbsI; no entanto, esse passo é demorado. No presente protocolo, o produto digerido é purificado usando um kit de purificação pcr e usado diretamente para a reação de ligadura a jusante, que geralmente produz colônias positivas com eficiência comparável.
    3. Transforme 10 μL do produto de ligadura (etapa 1.2.2) em 50 μLde células competentes Escherichia coli DH5α de acordo com as instruções do fabricante. Escolha aleatoriamente três colônias de uma placa de ágar LB com ampicillina (100 μg/mL) e inocula cada uma em 3 mL de meio LB com ampicilina para cultivo durante a noite.
    4. Use 1 mL da cultura bacteriana durante a noite para sequenciamento Sanger e mantenha o resto a 4 °C até que a construção seja confirmada como correta: pDsR-mR26-sg1 e pDsR-mR26-sg2 para mRosa26 locus knock-in, e pDsR-hR26-sg1 e pDsR-hR26-sg2 para o lócus hROSA26.
    5. Prepare uma alta concentração de DNA plasmídeo (aproximadamente 2 μg/μL) com um kit maxiprep para purificação de plasmídeo de grau de transfecção (ver Tabela de Materiais).

2. Projeto e Construção de Vetores direcionados como Modelos de Recombinação Homólogo

  1. Projete um modelo de reparo direcionado à e homologia
    1. Projete um vetor direcionado para expressar constitutivamente o POI usando um de expressão otimizado de um estudo anterior29, que inclui um promotor híbrido CAG, um site de restrição ascI permitindo a clonagem do cDNA do POI, um repórter IRES-EBFP2, e um sinal de poliadenylation hormonal de crescimento bovino (bGH-polyA) sinal(Figura 1B e Arquivo Suplementar).
    2. Projetar braços de elogia (HAs) que compartilham a homologia com as sequências genômicas do lócus mRosa26 ou hROSA26. Inclua ~1 kb do HA de 5' correspondente à sequência genômica a montante do local de inserção desejado à esquerda do de expressão. Da mesma forma, inclua ~1 kb do HA de 3' correspondente à sequência genômica a jusante do local de inserção à direita do de expressão.
      NOTA: O de expressão é inserido o mais próximo possível dos locais de decote CRISPR/Cas934. Para evitar o recoamento do alelo-alvo por CRISPR/Cas9, incorpore alterações de nucleotídeos na sequência protoespacial adjacente (PAM) (5'-NGG-3') no vetor de alvo34,35.
    3. Para permitir a linearização do vetor de destino, insira um site EcoRI exclusivo apenas a montante do HA de 5' e um site bamhi único a jusante do HA de 3'.
    4. Tenha um fornecedor comercial sintetizando os vetores de destino e designá-los como pKR26-iBFP e pKhR26-iBFP para mRosa26 e hROSA26 knock-in, respectivamente.
  2. Construa um vetor de destino como um modelo de reparo direcionado à e homologia
    1. Para expressar o POI, obtenha a sequência cDNA (sequência de codificação) do navegador genoma Ensembl e escolha a transcrição possuindo a maior sequência de proteínas. Por exemplo, o cDNA do gene ACE2 humano é ACE2-202 ENST000000427411.2 e o cDNA do gene RASGRP1 humano é RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Sintetizar o cDNA do POI com a ajuda de um fornecedor comercial. Também é possível clonar o cDNA via amplificação PCR (não descrito aqui). Coloque a sequência GGCGCGCCACC (5' - 3'), que inclui um site de restrição ascI (itálico e negrito) e o local de iniciação de tradução de consenso Kozak (sublinhado), imediatamente antes do codon de iniciação ATG do cDNA e outro local de restrição ascI (5'- GGCGCGCC -3') após o codon stop do cDNA.
    3. Digerir a sequência sintetizada com AscI e purificar usando um kit de purificação pcr projetado para purificar fragmentos de DNA após a digestão da restrição, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    4. Ligate a inserção cDNA purificada no vetor de coluna linearizado ascI pKR26-iBFP ou pKhR26-iBFP usando ligase de DNA T4 seguindo as instruções do fabricante.
    5. Verifique o vetor de alvo final, pKR26-POI-iBFP ou pKhR26-POI-iBFP, por sequenciamento. Use maxiprep para purificar os construtos verificados de acordo com o protocolo do fabricante.
    6. Digerir o vetor de destino usando EcoRI ou BamHI e purificar o produto de digestão usando um kit de purificação pcr de acordo com as instruções do fabricante. Armazene o vetor de alvo linearizado (~0,8 μg/μL) a -20 °C até a eletroporação.

3. Eletroporação de linhas de células Macrófagos e T

  1. Prepare culturas celulares para eletroporação
    1. Prepare o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) como meio de crescimento completo para células Jurkat T. Prepare o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) da Dulbecco com 10% de FBS para cultivo de macrófagos RAW264,7. Suplemente todas as mídias de crescimento completas com penicilina U/mL e estreptomicina de 100 μg/mL (Pen/Strep), exceto para mídias usadas para incubação pós-transfecção antes da triagem celular.
    2. Realizar subcultura das células RAW264.7 e Jurkat T de acordo com as instruções do fornecedor (Ver Tabela de Materiais). Ao subculturar células RAW264,7, use a solução trypsin-EDTA (0,25%) para desprender células. Use FBS suplementado com DMSO de 10% (v/v) como meio de criopreservação para células RAW264.7 e Jurkat.
    3. Coletar células a 250 × g por 5 min para macrófagos RAW264.7 e 90 × g por 8 min para células Jurkat T. Em seguida, lave com 5-10 mL de 1× DPBS (sem íons Ca2+ ou Mg2+). Remova o DPBS.
    4. Resuspense a pelota celular usando 2 mL de 1× DPBS. Use 10 μL de células e misture com um volume igual de 0,2% azul trypan para estimar a contagem celular e a viabilidade.
      NOTA: Certifique-se de que a cultura celular tenha >90% de viabilidade no dia da transfecção.
    5. Para um único experimento knock-in, realize a eletroporação com 10 μL dicas de nucleosfeição com cinco repetições. Calcule o volume necessário para 2,0 × 106 células e pelota as células por centrifugação. Lave a pelota celular novamente com 1× DPBS, conforme descrito na etapa 3.1.3.
      NOTA: Ao usar 10 μL dicas de nucleofecção, 4,0 × 105 células são necessárias por eletroporação. Assim, prepare pelo menos 2,0 × 106 células para um experimento de knock-in.
    6. Prepare uma placa de 24 poços com 0,5 mL de meio de crescimento completo (preparado na etapa 3.1.1) por poço sem Caneta/Estreptococos e pré-aquecimento em uma incubadora de 37 °C.
  2. Eletroporação de componentes CRISPR/Cas9 e vetor de mira
    1. Ligue o sistema de eletroporação. Use parâmetros de eletroporação otimizados em um estudo anterior21: 1.400 V/20 ms/2 pulsos para macrofagos RAW264.7 e pulsos de 1350 V/20 ms/2 para células Jurkat T.
    2. Contabilizando a perda amostral devido à pipetação, prepare uma mistura de eletroporação de 55 μL em um tubo de microcentrífugo estéril de 1,5 mL contendo 2,5 μg de cada vetor CRISPR/Cas9, 2,4 μg do vetor de alvo linearizado e o Tampão de Ressuspensão R.
      NOTA: Para economizar tempo, a mistura de eletroporação pode ser preparada durante a centrifugação (etapa 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 células (preparadas na etapa 3.1.5) na mistura de eletroporação de 55 μL da etapa 3.2.2.
    4. Aspire a mistura celular/eletroporação a partir da etapa 3.2.3 usando uma ponta de nucleofecção de 10 μL com uma pipeta.
      NOTA: Durante a pipetação, evite a introdução de bolhas de ar, que podem causar falha na eletroporação.
    5. Adicione a amostra a um tubo preenchido com 3 mL de Buffer E do kit de eletroporação.
    6. Aplique os parâmetros de eletroporação para os dois tipos de células descritos na etapa 3.2.1.
    7. Transfira a amostra para um poço da placa de 24 poços com meio pré-armado a partir da etapa 3.1.6.
    8. Repetir as etapas 3.2.4-3.2.7 para as outras quatro repetições, bem como para os controles apenas de vetor de vetor de destino e vetor de expressão CRISPR.
      NOTA: Altere a ponta e o tubo de nucleofecção ao mudar para um DNA diferente tipo celular/plasmídeo.
    9. Cultura as células transfectadas por 48-72 h para permitir a recuperação após a eletroporação e expressão de componentes CRISPR/Cas9 antes da análise da citometria de fluxo ou da triagem celular ativada por fluorescência (FACS). Examine a expressão de DsRed2 usando um microscópio fluorescente equipado com um canal vermelho a 24 h após a transfecção.
      NOTA: Um benefício do monitoramento das células fluorescentes DsRed2 é que a eficiência da eletroporação pode ser estimada e a adequação para uma triagem celular adicional pode ser prevista.

4. Classificação celular para isolar células putativas

  1. Antes da triagem FACS, lave as células transfeinadas uma vez com meio de crescimento completo. Células de pelotas por centrifugação como descrito na etapa 3.1.3 e resuspensam a pelota em 500 μL de meio fresco.
  2. Defina o classificador de células (localizado em um armário de biossegurança) com um bocal de 85 μm e baixa taxa de fluxo. Selecione o modo "célula única" para classificação e teste a eficiência e precisão de classificação de células únicas, classificando 20-30 células na tampa de uma microplata de 96 poços. Uma gota localizada no centro de cada poço indica a configuração adequada do instrumento.
  3. Transfira a suspensão celular da etapa 4.1 para tubos FACS estéreis e adicione mancha de célula vermelha SYTOX para uma concentração final de 1 nM.
  4. Analise amostras no classificador de células. SYTOX Red e EBFP2 estão animados com um laser de 405 nm e detectados pelos canais V450/BV421 e APC, respectivamente. DsRed2 é animado por um laser de 488 nm e detectado pelo canal PE. Use células não transfectadas e células positivas únicas EBFP2 e DsRed2 como controles para compensação espectral.
  5. Classifique 10 células únicas em cada poço de uma microplacão de 96 poços contendo 150 μL por poço de meio de crescimento completo pré-aquecido. Use microplacas de fundo redondo para amassar linhas de células de suspensão, como células Jurkat T e microplacas inferiores planas para macrófagos RAW264.7 aderentes.
    NOTA: A classificação de 10 células por poço é uma estratégia otimizada para melhorar a sobrevivência celular e minimizar o número de microplacões de 96 poços que precisam ser semeadas e o número de amostras que precisam ser rastreadas por citometria de fluxo e genotipagem; se classificar apenas uma célula por poço, a semeadura de mais microplacões é necessária para aumentar a chance de obter células editadas corretamente.

5. Triagem e Validação de Células Positivas

  1. Triagem para células de knock-in candidato por citometria de fluxo
    1. Incubar as células da etapa 4.5 por 10-15 dias e adicionar meio de crescimento completo a cada 3 dias para substituir o líquido perdido através da evaporação. Para as células Jurkat T, transfira células cultivadas na placa de fundo redondo de 96 poços para uma placa inferior plana para otimizar a proliferação celular.
    2. Transfira as células classificadas expandidas para placas de 48 poços para maior expansão.
    3. Quando as células estiverem próximas à confluência, use metade da cultura para testar a expressão EBFP2 por citometria de fluxo(Figura 3). Normalmente, metade da cultura em uma placa de 48 poços após o crescimento confluente equivale a 0,5-1,0 × 105 células, o que é adequado para análise de uma amostra por citometria de fluxo.
    4. Transfira as células restantes para placas de 24 poços para maior proliferação.
    5. Mantenha as populações de células candidatas possuindo uma alta porcentagem de células EBFP2 positivas para novos experimentos de genotipagem.
      NOTA: Como 10 células são classificadas em cada poço da microplaca de 96 poços, é possível que as células knock-in cresçam com células que não expressam o gene knock-in. Portanto, é normal realizar uma rodada adicional de classificação celular para separar as células positivas do EBFP2 das células negativas.
  2. Triagem para células de knock-in de candidatos por PCR e sequenciamento
    1. Recolher 2 × 105 células candidatas. Extrair o DNA genômico usando um kit de preparação de DNA (Ver tabela de materiais).
    2. Para verificar se o reparo preciso direcionado à dnaologia (HDR) ocorreu no lócus mRosa26, em vez de em locais aleatórios no genoma das células de knock-in do candidato, realize pcr com primers abrangendo cada lado dos HAs(Figura 4). Escolha uma cartilha localizada na região genômica fora do vetor de destino (oligo externo) e outra cartilha localizada dentro do vetor de alvo (oligo interno).
      NOTA: Um design semelhante é usado para verificar HDR no lócus hROSA26. Os primers PCR também podem ser facilmente projetados para detectar a inserção da sequência POI. Além disso, os genótipos de aleelo silvestre e knock-in podem ser detectados simultaneamente usando PCR de três primer (Ver Arquivo Suplementar, Figura S2).
    3. Clone os produtos PCR positivos usando um kit de clonagem rápida (ver Tabela de Materiais). Transforme a mistura de reação em células competentes DH5α.
    4. Escolha aleatoriamente 8-10 colônias bacterianas individuais por transformação e sequencia os produtos PCR a partir da etapa 5.2.3 pelo sequenciamento Sanger.
  3. Validação de células positivas por análise de imunoblot e purificação de afinidade
    NOTA: As células candidatas são submetidas à análise de imunobloto para validação da inserção do POI, ou purificação de afinidade (AP) para estudos de interação proteína-proteína.
    1. Realize a análise do imunoblot de acordo com as instruções do fabricante de anticorpos. Consulte Tabela de Materiais para obter informações sobre o uso de anticorpos primários e anticorpos secundários.
    2. Sujeitar os lises das células de knock-in expressando o POI marcado pela OST para AP usando contas sepharose strep-tactin seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    3. Detecte a quemiluminescência usando um imager.

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Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima para realizar experimentos de knock-in no lócus mRosa26 usando macrófagos murine RAW264.7, projetamos um vetor direcionado para expressar ace2 humano, um receptor para o vírus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando um design semelhante, geramos células Tockat T humanas com knock-in da proteína de fusão RASGRP1 marcada pelo OST(Figura 2C). Após a transfecção de três plasmídeos, dois dos quais foram usados para expressão de CRIS...

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Discussão

Em nossos experimentos, demonstramos como realizar a edição em células imunes desde o projeto de construção até a triagem e validação celular knock-in usando células toscos humanos e macrófagos murine RAW264.7 como exemplos. As linhas de células T e macrófagos são resistentes à transfecção36,37; no entanto, o problema da baixa eficiência da entrega do CRISPR/Cas9 pode ser superado com o auxílio de repórteres fluorescentes aliados à classificação celular. Este pro...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a instalação do núcleo de citometria de fluxo da Universidade Médica de Xinxiang. O desenvolvimento dessa tecnologia tem sido apoiado por subvenções da NSFC 81601360 à LZ, 81471595 e 32070898 à YL. O trabalho também conta com o apoio da Fundação do Comitê Educacional henan nº 21IRTSTHN030.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amersham Imager 600Ge Imagingde saúde de quimioluminescência
Ampicilina, sal de sódioMP Biomedicals194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074na diluição 1/5000
Anticorpo anti-RasGRP1, clone 10.1MerckMABS1461.0 μ g/mL de concentração de trabalho
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Tecnologiade Sinalização de Células8457a 1/1000 de diluição
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Contador Celular AutomatizadoNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Células competentesTakara9057
DMSO (Dimetil Sulfóxido)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Kits de TecidosQiagen69506reagente de cultura de células
DPBS (10X), sem cálcio, sem magnésioThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com alta glicoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipado com gabinete de biossegurança
FACS Citômetro de fluxo CantoBD Biosciences
Falcon 5 ml de poliestireno tubo de ensaio de fundo redondoBD Biosciences352003
Soro fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo versão 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP  Tecnologiade sinalização de células5174com diluição de 1/1000
Anticorpo secundário anti-IgG (H + L) de cabra, HRPThermoFisher Scientific31430com diluição de 1/5000
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstratoMilliporeWBKLS0500
Membrana Immobilon-PSQ PVDFMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Sulfato de canamicinaMP Biomedicals194531
LB ágar póMulticanal 22700041ThermoFisher Scientific
(30-300 μ L)Eppendorf, ou similar
Sistema de Transfecção NeonThermoFisher ScientificMPK5000
Sistema de Transfecção Neon, 10 μ Kit LThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos EstéreisThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Carregamento rápido de arranque a quente® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)para modelo de alta GC%
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 a 180kDa ThermoFisher Scientific26616
Ponta de pipeta 0.1-20µ lEppendorf, ou similar0030 075.005
Ponteira de pipeta 2-200µ lEppendorf, ou similar0030 075.021
Ponta de pipeta 50-1000µ lEppendorf, ou similar0030 075.064
Kit Maxi de PlasmídeoQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick Kit de Purificação de PCRQiagen28104purifica o plasmídeo da digestão de restrição
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Anticorpo anti-ACE2 recombinante [EPR4435(2)]Abcamab108252a 1/1000 de diluição
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™ Coloração de células mortas vermelhas, para excitação de 633 ou 635 nmThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polinucleotídeo quinaseNew England BioLabsM0201S
Solução de azul de tripano, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061
solução de tripsina-EDTA (0,25%), com vermelho de fenolThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1.5 mL microtubos, PCR-cleanEppendorf, ou similar0030 125.215
Placas de múltiplos poços tratadas com TC de 24 poçosCorning3524
Microplacas de poliestireno de fundo plano de 96 poçosCorning3599
Microplaca Corning 3799 tratada com TC de fundo redondo transparente de 96 poços
mAb de Coelho mAb de coelho Pipeta

Referências

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